肠道病毒RNA RT－PCR检测在病毒性心肌炎诊断中的应用
作者：王永祥 金世香 金玉怀 刘贵霞
单位：河北医科大学基础医学院微生物学与免疫学教研室(石家庄 050017)
关键词：心肌炎；诊断；心肌炎；病因学；肠道病毒感染；诊断；肠病毒；分离和提纯；聚合酶链反应；方法
河北医科大学学报990205 摘 要 目的 探讨RT-PCR方法在肠道病毒感染诊断中的应用。方法 根据肠道病毒5'非编码区和VP2基因区共同序列设计一对引物，建立了检测各型肠道病毒的RT-PCR方法。用该方法扩增已知病毒，并用于临床标本检测。结果 所检测的11种已知病毒中，只对肠道病毒的9个型别扩增。186例心肌炎患者血清标本中，52例(27.95%)阳性。15例脑炎患者脑脊液标本中，4例(26.67%)阳性。结论 该RT-PCR方法具有肠道病毒特异性，在肠道病毒感染的诊断中有一定应用价值。
, http://www.100md.com 中图号 R542.21;R512.5
USE OF RT-PCR ASSAY IN DIAGNOSIS OF ENTEROVIRUS MYOCARDITIS
Wang Yongxiang Jin Shixiang Jin Yuhuai Liu Guixia
Department of Microbiology & Immunology,the School of Basic
Medical Sciences,Hebei Medical University(Shijiazhuang 050017)
ABSTRACT Objective To explore the use of RT-PCR in diagnosis of enterovirus infection. Methods A pair of premers hemologous to 5' non-coding and VP2 region of the enteroviruses was designed, and a RT-PCR method of detecting all types of enteroviruses was developed. The serum samples of the patients with myocarditis and cerebrospinal fluid samples of the patients with meningitis were tested. Results Among the 186 cases of myocarditis, 52 were positive for enterovirus RNA in serum. While 4 of 15 cases of meningitis were positive in cerebrospinal fluid.Conclusion Due to specificity on enterovirus,the RT-PCR method has some value in the diagnosis of enterovirus infections.
, 百拇医药
MeSH myocarditis/diag;myocarditis/etiol;enterovirus infections/diag;enteroviruses/isol;polymerase chain reaction/methods
肠道病毒中的柯萨奇病毒B组是病毒性心肌炎最主要的病原。此外，柯萨奇病毒A组和埃可病毒的某些型别也可引起此病。近年来，病毒性心肌炎发病率有增加趋势。为探讨聚合酶链反应(PCR)方法在肠道病毒检测及临床诊断中的应用价值，建立了检测肠道病毒的PCR方法，并用于临床诊断为病毒性心肌炎患者血清标本的检测。
1 材料和方法
1.1 标本：病毒性心肌炎患者186例，系石家庄市4所医院就诊者，符合1995年全国心肌炎、心肌病专题研讨会制定的成人急性病毒性心肌炎诊断标准[1]。患者年龄18～45岁，平均27岁。其中男性81例，女性105例。无菌取静脉血，分离血清。取病毒性脑炎患者脑脊液15份。标本放-50℃备用。
, 百拇医药
1.2 病毒：脊髓灰质炎病毒Sabin疫苗株，系中国药品生物制品鉴定所提供，柯萨奇病毒B组1～6型，系上海医科大学中山医院提供，单纯疱疹病毒2型，狂犬病毒Flury株和流感病毒甲3型分别由本院基础所、河北省微生物所和河北省防疫站提供。
1.3 引物：根据文献[2]由中科院微生物所协助合成一对肠道病毒共同序列引物，位于肠道病毒RNA 5'端非编码区和VP2区。引物1为：(1058～1077)5' GGT AAT TTC CAC CAC CAA CC 3'， 引物2为 ：(542～567)5' CTA CTT TGG GTG TCC G 3'。
1.4 核酸提取：按异硫氰酸胍一步法进行[3]。50 μl标本(或已知病毒)加入500 μl异硫氰酸胍提取液中，混匀，65℃作用30分钟。然后用酚-氯仿异戊醇混合液提取，取上清液加3 mol/L乙酸钠至终浓度为0.3 mol/L,加入2.5倍体积无水乙醇,放-20℃ 2小时,10 000r/min离心15分钟沉淀核酸,再以75%乙醇洗1次,真空干燥后加少量蒸馏水溶解沉淀。
, 百拇医药
1.5 cDNA合成:按文献方法[4]进行。在20 μl反应体系中含10 μl提取物溶液，RNasin 20 u，4 μl 5X逆转录酶缓冲液(250 mmol/L Tris-HCl pH 8.3, 15 mmol/L MgCl2,350 mmol/L KCl, 50 mmol/L DTT)4种 dNTP各125 umol/L, 125 pmol/L引物和5单位逆转录酶(RMV)，置42 ℃30分钟，于95 ℃7分钟终止反应。
1.6 PCR:参照文献[4]，30 μl反应体系中含3 μl 10X缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3, 560 mmol/L KCl, 250 mmmol/L MgCl,170 μg/L牛血清白蛋白)，4种dNTP各125 umol/L,引物各25 pmol/L,Taq聚合酶2u，逆转录反应产物10 μl,混匀，加液体石蜡覆盖液面，PCR扩增温度控制在94 ℃、52 ℃、72 ℃各60秒,共循环35周期。
, 百拇医药
1.7 产物分析：将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶板上电泳经EB染色，在紫外检测仪下观察结果。
2 结果
2.1 PCR特异性：从狂犬病毒，单纯疱疹病毒，脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒B组细胞培养物中提取核酸，进行逆转录和扩增，经电泳和EB染色，可见脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒B组扩增产物在650 bp处有明显泳带，与文献相符，而狂犬病毒，单纯疱疹病毒和流感病毒不出现泳带。将脊髓灰质炎病毒2型加入正常人血清中也扩增出650 bp核酸，而正常人血清未扩增出任何泳带，说明扩增产物具有肠道病毒特异性。
2.2 病毒性心肌炎患者血清扩增结果:对186例病毒性心肌炎患者血清扩增，52例扩增出650 bp核酸，阳性率27.95%,另对15例临床诊断为病毒性脑炎患者的脑脊液标本进行扩增，4例阳性，阳性率为26.67%。
3 讨论
, 百拇医药
肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒等60多个型别，可引起多种疾病。对肠道病毒的诊断已有细胞分离、中和试验、ELISA等检测手段。但由于肠道病毒型别繁多，给检测带来困难而限制了这些技术的应用，使肠道病毒感染的实验室诊断不能满足临床的需要。PCR方法是一种敏感的方法，根据Olive研究，PCR方法可以从脑脊液中检出1PFU的肠道病毒核酸。应用肠道病毒共同序列引物可同时检测肠道病毒属的各种病毒。实验结果表明，用此引物进行扩增具较好的特异性，能在2天内得到结果，提示该技术可作为肠道病毒快速、敏感特异的检测手段。
利用本文建立的检测肠道病毒RNA的R T-PCR技术，检测了186例临床诊断为病毒性心肌炎患者的血清，有52例阳性，阳性率27.95%。15例病毒性脑炎患者的脑脊液4例阳性，阳性率26.67%。肠道病毒感染机体后，可刺激机体产生中和抗体，2～3周抗体水平达到高峰而中和病毒。此时，从血中不能分离出病毒。应用PCR方法检测肠道病毒，在发病早期进行,可提高检测阳性率,同时达到早期诊断的目的。
, 百拇医药
注：河北省秦皇岛市第三医院
参考文献
1.全国心肌炎、心肌病专题研讨会纪要.临床心血管病杂志, 1995,11(6):324
2.Olive DM, Mufti SA, Mulla WA, et al. Detection and differentation of piconaviruses in clinical samples following genomic amplification. J Gen Virol,1990,71:2141
3.Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry,1987,162:156
4.Rotbort HA, Kinsella JP , Wasserman RL. Persistent enterovirus infection in culture negative meningoencephalitis:Demonstration by enzymatic RNA amplification.J Infect Dis, 1990,161:787
(1997-11-18 收稿), 百拇医药
单位：河北医科大学基础医学院微生物学与免疫学教研室(石家庄 050017)
关键词：心肌炎；诊断；心肌炎；病因学；肠道病毒感染；诊断；肠病毒；分离和提纯；聚合酶链反应；方法
河北医科大学学报990205 摘 要 目的 探讨RT-PCR方法在肠道病毒感染诊断中的应用。方法 根据肠道病毒5'非编码区和VP2基因区共同序列设计一对引物，建立了检测各型肠道病毒的RT-PCR方法。用该方法扩增已知病毒，并用于临床标本检测。结果 所检测的11种已知病毒中，只对肠道病毒的9个型别扩增。186例心肌炎患者血清标本中，52例(27.95%)阳性。15例脑炎患者脑脊液标本中，4例(26.67%)阳性。结论 该RT-PCR方法具有肠道病毒特异性，在肠道病毒感染的诊断中有一定应用价值。
, http://www.100md.com 中图号 R542.21;R512.5
USE OF RT-PCR ASSAY IN DIAGNOSIS OF ENTEROVIRUS MYOCARDITIS
Wang Yongxiang Jin Shixiang Jin Yuhuai Liu Guixia
Department of Microbiology & Immunology,the School of Basic
Medical Sciences,Hebei Medical University(Shijiazhuang 050017)
ABSTRACT Objective To explore the use of RT-PCR in diagnosis of enterovirus infection. Methods A pair of premers hemologous to 5' non-coding and VP2 region of the enteroviruses was designed, and a RT-PCR method of detecting all types of enteroviruses was developed. The serum samples of the patients with myocarditis and cerebrospinal fluid samples of the patients with meningitis were tested. Results Among the 186 cases of myocarditis, 52 were positive for enterovirus RNA in serum. While 4 of 15 cases of meningitis were positive in cerebrospinal fluid.Conclusion Due to specificity on enterovirus,the RT-PCR method has some value in the diagnosis of enterovirus infections.
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MeSH myocarditis/diag;myocarditis/etiol;enterovirus infections/diag;enteroviruses/isol;polymerase chain reaction/methods
肠道病毒中的柯萨奇病毒B组是病毒性心肌炎最主要的病原。此外，柯萨奇病毒A组和埃可病毒的某些型别也可引起此病。近年来，病毒性心肌炎发病率有增加趋势。为探讨聚合酶链反应(PCR)方法在肠道病毒检测及临床诊断中的应用价值，建立了检测肠道病毒的PCR方法，并用于临床诊断为病毒性心肌炎患者血清标本的检测。
1 材料和方法
1.1 标本：病毒性心肌炎患者186例，系石家庄市4所医院就诊者，符合1995年全国心肌炎、心肌病专题研讨会制定的成人急性病毒性心肌炎诊断标准[1]。患者年龄18～45岁，平均27岁。其中男性81例，女性105例。无菌取静脉血，分离血清。取病毒性脑炎患者脑脊液15份。标本放-50℃备用。
, 百拇医药
1.2 病毒：脊髓灰质炎病毒Sabin疫苗株，系中国药品生物制品鉴定所提供，柯萨奇病毒B组1～6型，系上海医科大学中山医院提供，单纯疱疹病毒2型，狂犬病毒Flury株和流感病毒甲3型分别由本院基础所、河北省微生物所和河北省防疫站提供。
1.3 引物：根据文献[2]由中科院微生物所协助合成一对肠道病毒共同序列引物，位于肠道病毒RNA 5'端非编码区和VP2区。引物1为：(1058～1077)5' GGT AAT TTC CAC CAC CAA CC 3'， 引物2为 ：(542～567)5' CTA CTT TGG GTG TCC G 3'。
1.4 核酸提取：按异硫氰酸胍一步法进行[3]。50 μl标本(或已知病毒)加入500 μl异硫氰酸胍提取液中，混匀，65℃作用30分钟。然后用酚-氯仿异戊醇混合液提取，取上清液加3 mol/L乙酸钠至终浓度为0.3 mol/L,加入2.5倍体积无水乙醇,放-20℃ 2小时,10 000r/min离心15分钟沉淀核酸,再以75%乙醇洗1次,真空干燥后加少量蒸馏水溶解沉淀。
, 百拇医药
1.5 cDNA合成:按文献方法[4]进行。在20 μl反应体系中含10 μl提取物溶液，RNasin 20 u，4 μl 5X逆转录酶缓冲液(250 mmol/L Tris-HCl pH 8.3, 15 mmol/L MgCl2,350 mmol/L KCl, 50 mmol/L DTT)4种 dNTP各125 umol/L, 125 pmol/L引物和5单位逆转录酶(RMV)，置42 ℃30分钟，于95 ℃7分钟终止反应。
1.6 PCR:参照文献[4]，30 μl反应体系中含3 μl 10X缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3, 560 mmol/L KCl, 250 mmmol/L MgCl,170 μg/L牛血清白蛋白)，4种dNTP各125 umol/L,引物各25 pmol/L,Taq聚合酶2u，逆转录反应产物10 μl,混匀，加液体石蜡覆盖液面，PCR扩增温度控制在94 ℃、52 ℃、72 ℃各60秒,共循环35周期。
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1.7 产物分析：将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶板上电泳经EB染色，在紫外检测仪下观察结果。
2 结果
2.1 PCR特异性：从狂犬病毒，单纯疱疹病毒，脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒B组细胞培养物中提取核酸，进行逆转录和扩增，经电泳和EB染色，可见脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒B组扩增产物在650 bp处有明显泳带，与文献相符，而狂犬病毒，单纯疱疹病毒和流感病毒不出现泳带。将脊髓灰质炎病毒2型加入正常人血清中也扩增出650 bp核酸，而正常人血清未扩增出任何泳带，说明扩增产物具有肠道病毒特异性。
2.2 病毒性心肌炎患者血清扩增结果:对186例病毒性心肌炎患者血清扩增，52例扩增出650 bp核酸，阳性率27.95%,另对15例临床诊断为病毒性脑炎患者的脑脊液标本进行扩增，4例阳性，阳性率为26.67%。
3 讨论
, 百拇医药
肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒等60多个型别，可引起多种疾病。对肠道病毒的诊断已有细胞分离、中和试验、ELISA等检测手段。但由于肠道病毒型别繁多，给检测带来困难而限制了这些技术的应用，使肠道病毒感染的实验室诊断不能满足临床的需要。PCR方法是一种敏感的方法，根据Olive研究，PCR方法可以从脑脊液中检出1PFU的肠道病毒核酸。应用肠道病毒共同序列引物可同时检测肠道病毒属的各种病毒。实验结果表明，用此引物进行扩增具较好的特异性，能在2天内得到结果，提示该技术可作为肠道病毒快速、敏感特异的检测手段。
利用本文建立的检测肠道病毒RNA的R T-PCR技术，检测了186例临床诊断为病毒性心肌炎患者的血清，有52例阳性，阳性率27.95%。15例病毒性脑炎患者的脑脊液4例阳性，阳性率26.67%。肠道病毒感染机体后，可刺激机体产生中和抗体，2～3周抗体水平达到高峰而中和病毒。此时，从血中不能分离出病毒。应用PCR方法检测肠道病毒，在发病早期进行,可提高检测阳性率,同时达到早期诊断的目的。
, 百拇医药
注：河北省秦皇岛市第三医院
参考文献
1.全国心肌炎、心肌病专题研讨会纪要.临床心血管病杂志, 1995,11(6):324
2.Olive DM, Mufti SA, Mulla WA, et al. Detection and differentation of piconaviruses in clinical samples following genomic amplification. J Gen Virol,1990,71:2141
3.Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry,1987,162:156
4.Rotbort HA, Kinsella JP , Wasserman RL. Persistent enterovirus infection in culture negative meningoencephalitis:Demonstration by enzymatic RNA amplification.J Infect Dis, 1990,161:787
(1997-11-18 收稿), 百拇医药