肝硬化腹水大鼠肾脏一氧化氮合酶(NOS)免疫组织化学研究
作者：谭凯 张鹏宇 王天才 唐望先 梁扩寰
单位：谭凯 王天才 唐望先 梁扩寰(同济医科大学附属同济医院内科，武汉 430030)；张鹏宇(上海市第一人民医院内科，上海 200080)
关键词：肝硬变；腹水；肾脏；一氧化氮合酶；免疫组织化学
同济医科大学学报000413 摘要 为探讨肝硬化腹水大鼠钠潴留的发生机制，应用免疫组织化学法对胆管结扎诱导的胆 汁性肝硬化腹水大鼠和假手术大鼠肾组织内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及诱导型一氧化氮合 酶(iNOS)的表达进行比较性研究。结果显示二组大鼠肾组织eNOS表达无显著性差异，而iN OS在肝硬化腹水大鼠呈强阳性表达，在假手术大鼠则为阴性。提示胆汁性肝硬化腹水大鼠肾 脏iNOS表达显著增高，肾脏NO途径可能参与了肝硬化钠潴留的发生机制。
中图法分类号 R575.2， R442.5， R322.6， R392.31
, http://www.100md.com
Immunohistochemical Study of Nitric Oxid e Synthase in Kidney of
Cirrhotic Rats with Ascites
Tan Kai
(Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Zhang Pengyu
(Department of Internal Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080)
, http://www.100md.com Wang Tiancai
(Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract To investigate the pathogenesis of sodium retention in cirrhotic rats with ascites, comparative studies on the expression of endotheli al nitric oxide synthase (eNOS) and inducible NOS (iNOS) in kidney of biliary ci rrhotic rats with ascites induced by bile duct ligation (BDL) and sham-operated rats were performed by using immunohistochemical method. It was found that ther e was no significant difference in the expression of eNOS between the two groups . The expression of iNOS in kidney of cirrhotic rats with ascites was strong pos itive, but it was negative in sham-operated rats. It was suggested that the exp ression of iNOS in kidney of biliary cirrhotic rats with ascites was significant ly increased. NO in kidney may participate in the pathogenesis of sodium retenti on of cirrhosis.
, http://www.100md.com
Key words cirrhosis; ascites; kidney; nitric oxide synthase; immunohistochemistry
业已证明，NO在肝硬化全身和肾脏改变中起重要作用，NO抑制可引起高动力循环的逆转和肾 排泄功能的改善[1]。然而，直接论证实验型或临床型肝硬化肾脏NO产生增加的文 献极少 ，在国内尚未见报道。因而本实验采用免疫组织化学法研究肝硬化腹水大鼠和假手术大鼠肾 脏一氧化氮合酶(NOS)的表达，旨在探讨肾脏NO途径是否参与了肝硬化钠水潴留的发生机 制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠，体重为195～245 g(由同济医科大学实验动物学部提供)。分两组：肝硬化组 (CIR)和假手术组(SO)。
, http://www.100md.com
1.2 模型制备
参照文献[2]采用胆管结扎复制肝硬化模型。氯胺酮(100 mg/kg,im)麻 醉后开腹，游离出胆管，用丝线双重结扎并从中剪断。关腹后给予长效青霉素(苄星青霉素 3万U/只)肌注。于第28 d处死大鼠，取少许肝组织，用100 ml/L甲醛固定24 h。常规石蜡 包埋，切片。HE染色后用光学显微镜观察。SO组仅分离出胆管，不结扎和剪断，其余步骤同 CIR组。
1.3 取材和切片
氯胺酮麻醉后，取3只肝硬化腹水大鼠和3只假手术大鼠肾脏，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，切开 冷藏于液氮待进一步处理。标本于恒温切片机行连续冰冻切片(厚约6 μm)，用冷丙酮 固定10 min，取出吹干，30 min后转入低温冰箱保存。
SABC法进行NOS的免疫组化研究(试剂盒购自博士德生物工程有限公司)。室温下切片经 30 g/L H2O2-甲醇溶液孵育30 min，以阻断内源性过氧化物酶及用100 g/L正常羊血清 孵育1 h，以清除非特异性背景染色。切片直接滴加适当稀释的一抗(兔IgG)，孵育48～72 h(4℃)。再依次用生物素标记羊抗兔IgG孵育1 h及SABC孵育1～2 h。继用DAB显色5～8 min。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。最后将切片贴附 在覆有明胶膜的载玻片上，空气干燥，以苏木素复染细胞核，蒸馏水冲洗，逐级酒精脱水， 二甲苯透明，松脂胶封片。以非免疫的正常兔血清代替一抗进行染色作为阴性对照。
, 百拇医药
2 结果
4周后，肝硬化组所有大鼠均出现显著黄疸、胃肠淤血、脾脏肿大及腹水。肝脏表面呈细 颗粒状，被胆汁染成绿褐色。组织学检查显示胆汁性肝硬化特征性表现。研究中假手术和肝 硬化腹水大鼠肾脏eNOS均呈阳性表达，二者没有显著性差异。而肾脏iNOS在假手术组未见表 达，在肝硬化腹水组则呈强阳性表达(见图1、2)。
图1 肝硬化腹水大鼠肾脏iNOS呈阳性表达(×100)
图2 假手术大鼠肾脏iNOS未见表达(×100)
3 讨论
在过去的几十年中，肝硬化钠潴留的发生机制一直是众多学者研究的热点，然而却缺乏 最终的定论[3]。推测很可能是参与维持体内钠平衡的多个系统调节失衡的结果。 最近的研究强有力地证明，NO可能参与了肝硬化钠潴留的发生机制。
, 百拇医药
NO是具有多种生物活性的物质，它与血管扩张、肾功能调节、胃肠运动、神经信息传递 、免疫、抗肿瘤、血小板聚积、蛋白质合成等有关。已知内源性NO是L-精氨酸(L-Arg) 在N OS催化及辅因子的作用下，脱去胍基末端氮原子与氧结合而成。NO产生后，渗出细胞膜，经 旁分泌形式作用于靶细胞。NOS有三种亚型：神经型(nNOS)、诱导型(iNOS)及内皮型(e NOS)。其中nNOS与eNOS合称为结构型NOS(cNOS)，它依赖于钙-钙调蛋白，正常情况存在 于神经系统和血管内皮等处；iNOS不依赖于钙-钙调蛋白，在内毒素和(或)细胞因子诱导下 产生于许多种类细胞(如血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、肝细胞、Kupffer细胞 、Ito细胞等)。
众所周知，血管内皮是NO产生的主要来源。但近来有研究[1，4]表明，肾脏亦有较 大的产 生NO的能力。Criado等[1]证实，自胆管结扎肝硬化大鼠分离的肾小球基础NO量是 增加的 ，而引起NO产生增加的主要原因则是iNOS的诱导激活。Bosch等[5]还证明，用四氯 化碳诱 导的肝硬化腹水大鼠肾脏eNOS蛋白表达显著增加。这些结果表明，肝硬化腹水大鼠肾脏NO产 生是增加的。已有学者[6，7]通过微穿刺研究和观察离体灌注肾发现，NO合成抑制 可减少肾小管钠重吸收，表明了NO在肾小管钠转运方面的直接效应。
, 百拇医药
新近又有学者提出[8]，钠水潴留的主要始动因素是内脏循环中的外周动脉血管扩 张，它 通过激活压力感受器介导的血管收缩反应、抗钠尿排泄反应和制尿反应，以相反地调节动脉 循环的相对充盈不足。动物实验已证实，肝硬化时体内NO产生是增加的，这将引起以外周动 脉血管扩张、心率加快和心输出量增高为特征的高动力循环。另有学者[9]通过持 续使用 低剂量L-NAME观察到，肝硬化腹水大鼠出现显著的肾钠水排泄增加和有效的负钠平衡及腹 水减少。
我们的研究显示，假手术和肝硬化腹水大鼠肾脏eNOS均呈阳性表达，二者没有显著性差异。 而iNOS在肝硬化腹水大鼠肾脏呈强阳性表达，在假手术组则为阴性。这与Criado等人的研究 相一致。肝硬化(尤其是胆汁性肝硬化)时，血中升高的内毒素、TNFα及IL-1等共同作用 于多种细胞，诱导产生iNOS，催化生成大量NO，使得肝硬化大鼠血中及肾脏NO产生增加，继 而通过全身和局部作用来影响肾钠排泄。
, http://www.100md.com 综上所述，在肝硬化腹水大鼠钠水潴留的发生机制中存在着NO 途径。NO不仅通过作为 全身血管舒张剂代表促进具有抗钠性质的内源性血管收缩剂的活性，而且还可通过局部作用 来直接影响肾小管的钠排泄。
国家自然科学基金资助项目(No.39670348)
谭凯，女，1964年生，主治医师
参 考 文 献
1，Criado M，Flores O，Ortiz M C et al. Elevated glomerular and blo od mononuclear lymphocyte nitric oxide production in rats with chronic bile duct ligation：Role of inducible nitric oxide synthase activation. Hepatology，1997, 26(2)：268
, 百拇医药
2，Kountouras J, Billing B H, Scheuer P J. Prolonged bile duct obstr uction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Path, 19 84, 65: 305
3，Jimenez W, Arroyo V. Pathogenesis of sodium retention in cirrhosis. J Hepatology, 1993, 18: 147
4，Marsden P A, Brenner B M. Nitric oxide endothelins: novel autocrine/ paracrine regulators of the circulation. Semin Nephrol, 1991, 11(2): 169
, http://www.100md.com 5，Basch-Marce M, Morales-Ruiz M, Jemenez W et al. Increased rena l expression of nitric oxide synthase type III in cirrhotic rats with ascites. Hepatology, 1998, 27: 1191
6，Radermacher J, Klanke B, Schurek H J, et al. Importance of NO/ED RF for glomerular and tubular function: studies in the isolated perfused rat ki dney. Kidney Int, 1992, 41: 1549
7，De Nicola L, Blantz R C, Gabbai F B. Nitric oxide and angiotensin II . Glomerular and tubular interaction in the rat. J Clin Invest, 1992, 89: 1248[ ZK)
, http://www.100md.com
8，Bataller R, Sort P, Ginès P et al. Hepatorenal syndrome: Defini tion, pathophysiology, clinical features and management. Kidney International, 1 998, 53(Suppl.66): PP.S47
9，Martin P-Y, Ohara M, Ginès P et al. Nitric oxide synthase inhi bition for one week improves renal sodium and water excretion in cirrhotic rats with ascites. J Clin Invest, 1998, 101(10): 235
(1999-12-17 收稿), 百拇医药
单位：谭凯 王天才 唐望先 梁扩寰(同济医科大学附属同济医院内科，武汉 430030)；张鹏宇(上海市第一人民医院内科，上海 200080)
关键词：肝硬变；腹水；肾脏；一氧化氮合酶；免疫组织化学
同济医科大学学报000413 摘要 为探讨肝硬化腹水大鼠钠潴留的发生机制，应用免疫组织化学法对胆管结扎诱导的胆 汁性肝硬化腹水大鼠和假手术大鼠肾组织内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及诱导型一氧化氮合 酶(iNOS)的表达进行比较性研究。结果显示二组大鼠肾组织eNOS表达无显著性差异，而iN OS在肝硬化腹水大鼠呈强阳性表达，在假手术大鼠则为阴性。提示胆汁性肝硬化腹水大鼠肾 脏iNOS表达显著增高，肾脏NO途径可能参与了肝硬化钠潴留的发生机制。
中图法分类号 R575.2， R442.5， R322.6， R392.31
, http://www.100md.com
Immunohistochemical Study of Nitric Oxid e Synthase in Kidney of
Cirrhotic Rats with Ascites
Tan Kai
(Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Zhang Pengyu
(Department of Internal Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080)
, http://www.100md.com Wang Tiancai
(Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract To investigate the pathogenesis of sodium retention in cirrhotic rats with ascites, comparative studies on the expression of endotheli al nitric oxide synthase (eNOS) and inducible NOS (iNOS) in kidney of biliary ci rrhotic rats with ascites induced by bile duct ligation (BDL) and sham-operated rats were performed by using immunohistochemical method. It was found that ther e was no significant difference in the expression of eNOS between the two groups . The expression of iNOS in kidney of cirrhotic rats with ascites was strong pos itive, but it was negative in sham-operated rats. It was suggested that the exp ression of iNOS in kidney of biliary cirrhotic rats with ascites was significant ly increased. NO in kidney may participate in the pathogenesis of sodium retenti on of cirrhosis.
, http://www.100md.com
Key words cirrhosis; ascites; kidney; nitric oxide synthase; immunohistochemistry
业已证明，NO在肝硬化全身和肾脏改变中起重要作用，NO抑制可引起高动力循环的逆转和肾 排泄功能的改善[1]。然而，直接论证实验型或临床型肝硬化肾脏NO产生增加的文 献极少 ，在国内尚未见报道。因而本实验采用免疫组织化学法研究肝硬化腹水大鼠和假手术大鼠肾 脏一氧化氮合酶(NOS)的表达，旨在探讨肾脏NO途径是否参与了肝硬化钠水潴留的发生机 制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠，体重为195～245 g(由同济医科大学实验动物学部提供)。分两组：肝硬化组 (CIR)和假手术组(SO)。
, http://www.100md.com
1.2 模型制备
参照文献[2]采用胆管结扎复制肝硬化模型。氯胺酮(100 mg/kg,im)麻 醉后开腹，游离出胆管，用丝线双重结扎并从中剪断。关腹后给予长效青霉素(苄星青霉素 3万U/只)肌注。于第28 d处死大鼠，取少许肝组织，用100 ml/L甲醛固定24 h。常规石蜡 包埋，切片。HE染色后用光学显微镜观察。SO组仅分离出胆管，不结扎和剪断，其余步骤同 CIR组。
1.3 取材和切片
氯胺酮麻醉后，取3只肝硬化腹水大鼠和3只假手术大鼠肾脏，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，切开 冷藏于液氮待进一步处理。标本于恒温切片机行连续冰冻切片(厚约6 μm)，用冷丙酮 固定10 min，取出吹干，30 min后转入低温冰箱保存。
SABC法进行NOS的免疫组化研究(试剂盒购自博士德生物工程有限公司)。室温下切片经 30 g/L H2O2-甲醇溶液孵育30 min，以阻断内源性过氧化物酶及用100 g/L正常羊血清 孵育1 h，以清除非特异性背景染色。切片直接滴加适当稀释的一抗(兔IgG)，孵育48～72 h(4℃)。再依次用生物素标记羊抗兔IgG孵育1 h及SABC孵育1～2 h。继用DAB显色5～8 min。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。最后将切片贴附 在覆有明胶膜的载玻片上，空气干燥，以苏木素复染细胞核，蒸馏水冲洗，逐级酒精脱水， 二甲苯透明，松脂胶封片。以非免疫的正常兔血清代替一抗进行染色作为阴性对照。
, 百拇医药
2 结果
4周后，肝硬化组所有大鼠均出现显著黄疸、胃肠淤血、脾脏肿大及腹水。肝脏表面呈细 颗粒状，被胆汁染成绿褐色。组织学检查显示胆汁性肝硬化特征性表现。研究中假手术和肝 硬化腹水大鼠肾脏eNOS均呈阳性表达，二者没有显著性差异。而肾脏iNOS在假手术组未见表 达，在肝硬化腹水组则呈强阳性表达(见图1、2)。
图1 肝硬化腹水大鼠肾脏iNOS呈阳性表达(×100)
图2 假手术大鼠肾脏iNOS未见表达(×100)
3 讨论
在过去的几十年中，肝硬化钠潴留的发生机制一直是众多学者研究的热点，然而却缺乏 最终的定论[3]。推测很可能是参与维持体内钠平衡的多个系统调节失衡的结果。 最近的研究强有力地证明，NO可能参与了肝硬化钠潴留的发生机制。
, 百拇医药
NO是具有多种生物活性的物质，它与血管扩张、肾功能调节、胃肠运动、神经信息传递 、免疫、抗肿瘤、血小板聚积、蛋白质合成等有关。已知内源性NO是L-精氨酸(L-Arg) 在N OS催化及辅因子的作用下，脱去胍基末端氮原子与氧结合而成。NO产生后，渗出细胞膜，经 旁分泌形式作用于靶细胞。NOS有三种亚型：神经型(nNOS)、诱导型(iNOS)及内皮型(e NOS)。其中nNOS与eNOS合称为结构型NOS(cNOS)，它依赖于钙-钙调蛋白，正常情况存在 于神经系统和血管内皮等处；iNOS不依赖于钙-钙调蛋白，在内毒素和(或)细胞因子诱导下 产生于许多种类细胞(如血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、肝细胞、Kupffer细胞 、Ito细胞等)。
众所周知，血管内皮是NO产生的主要来源。但近来有研究[1，4]表明，肾脏亦有较 大的产 生NO的能力。Criado等[1]证实，自胆管结扎肝硬化大鼠分离的肾小球基础NO量是 增加的 ，而引起NO产生增加的主要原因则是iNOS的诱导激活。Bosch等[5]还证明，用四氯 化碳诱 导的肝硬化腹水大鼠肾脏eNOS蛋白表达显著增加。这些结果表明，肝硬化腹水大鼠肾脏NO产 生是增加的。已有学者[6，7]通过微穿刺研究和观察离体灌注肾发现，NO合成抑制 可减少肾小管钠重吸收，表明了NO在肾小管钠转运方面的直接效应。
, 百拇医药
新近又有学者提出[8]，钠水潴留的主要始动因素是内脏循环中的外周动脉血管扩 张，它 通过激活压力感受器介导的血管收缩反应、抗钠尿排泄反应和制尿反应，以相反地调节动脉 循环的相对充盈不足。动物实验已证实，肝硬化时体内NO产生是增加的，这将引起以外周动 脉血管扩张、心率加快和心输出量增高为特征的高动力循环。另有学者[9]通过持 续使用 低剂量L-NAME观察到，肝硬化腹水大鼠出现显著的肾钠水排泄增加和有效的负钠平衡及腹 水减少。
我们的研究显示，假手术和肝硬化腹水大鼠肾脏eNOS均呈阳性表达，二者没有显著性差异。 而iNOS在肝硬化腹水大鼠肾脏呈强阳性表达，在假手术组则为阴性。这与Criado等人的研究 相一致。肝硬化(尤其是胆汁性肝硬化)时，血中升高的内毒素、TNFα及IL-1等共同作用 于多种细胞，诱导产生iNOS，催化生成大量NO，使得肝硬化大鼠血中及肾脏NO产生增加，继 而通过全身和局部作用来影响肾钠排泄。
, http://www.100md.com 综上所述，在肝硬化腹水大鼠钠水潴留的发生机制中存在着NO 途径。NO不仅通过作为 全身血管舒张剂代表促进具有抗钠性质的内源性血管收缩剂的活性，而且还可通过局部作用 来直接影响肾小管的钠排泄。
国家自然科学基金资助项目(No.39670348)
谭凯，女，1964年生，主治医师
参 考 文 献
1，Criado M，Flores O，Ortiz M C et al. Elevated glomerular and blo od mononuclear lymphocyte nitric oxide production in rats with chronic bile duct ligation：Role of inducible nitric oxide synthase activation. Hepatology，1997, 26(2)：268
, 百拇医药
2，Kountouras J, Billing B H, Scheuer P J. Prolonged bile duct obstr uction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Path, 19 84, 65: 305
3，Jimenez W, Arroyo V. Pathogenesis of sodium retention in cirrhosis. J Hepatology, 1993, 18: 147
4，Marsden P A, Brenner B M. Nitric oxide endothelins: novel autocrine/ paracrine regulators of the circulation. Semin Nephrol, 1991, 11(2): 169
, http://www.100md.com 5，Basch-Marce M, Morales-Ruiz M, Jemenez W et al. Increased rena l expression of nitric oxide synthase type III in cirrhotic rats with ascites. Hepatology, 1998, 27: 1191
6，Radermacher J, Klanke B, Schurek H J, et al. Importance of NO/ED RF for glomerular and tubular function: studies in the isolated perfused rat ki dney. Kidney Int, 1992, 41: 1549
7，De Nicola L, Blantz R C, Gabbai F B. Nitric oxide and angiotensin II . Glomerular and tubular interaction in the rat. J Clin Invest, 1992, 89: 1248[ ZK)
, http://www.100md.com
8，Bataller R, Sort P, Ginès P et al. Hepatorenal syndrome: Defini tion, pathophysiology, clinical features and management. Kidney International, 1 998, 53(Suppl.66): PP.S47
9，Martin P-Y, Ohara M, Ginès P et al. Nitric oxide synthase inhi bition for one week improves renal sodium and water excretion in cirrhotic rats with ascites. J Clin Invest, 1998, 101(10): 235
(1999-12-17 收稿), 百拇医药