超声在基因治疗中应用的探索性研究
作者：于廷和 江森 王智彪
单位：王智彪(400016 重庆医科大学医学超声工程研究所)；于廷和(山东医科大学研究生)；江森(山东医科大学附属医院)
关键词：
中华超声影像学杂志000620
超声医学与基因治疗学近年迅猛发展。基因治疗被认为是许多疾病治愈的希望。随着超声理论的研究，仪器的改进和完善，生物学效应研究的深入，超声医学已超出经典超声影像学的范畴,在基因治疗中已显示出广阔的应用前景。
无论是体内还是体外基因治疗，目的基因的转化和表达是治疗能否成功的关键。基因转化可分体内转化和体外转化，体内基因治疗时还需控制转入基因的表达范围和表达程度。
一、促进基因转化和表达
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超声可影响细胞膜的通透性，其提高细胞膜通透性存在阈值剂量。在合理控制超声辐照的条件下，既能使膜通透性可逆性增加，又不致使细胞明显受损。细胞膜通透性改变是基因转化的前提。Wyber等[1]报道20 kHz、2.0 W/cm2的超声辐照 30 s使质粒转入酵母为对照的20倍。
Kim 等[2]以插入LacZ或neo基因的质粒转化鼠成纤维细胞和软骨细胞，发现最大转化率时的超声条件为 1 MHz、声压(411±189)kPa的连续波辐照 20 s或 30 s，或 1 MHz、声压(319±157)kPa的连续波辐照 40 s或 60 s，成纤维细胞和软骨细胞平均转化率分别为 0.34%和 2.40%，而用 3.5 MHz的声波辐照则未见转化，他认为主要应归结于超声的空化效应，而声压与空化密切相关。Tata等[3]以前列腺癌细胞激素敏感株LnCap和不敏感株PC-3为受体细胞，以超声转化插入GFP的质粒，净受辐照能量为328.5 J。分别采用连续波和包络音频(tone-burst)的脉冲超声波(简称：长脉冲超声)，连续波频率 932.7 kHz、ISATP 为 1.67 W/cm2 ；长脉冲超声ISATA为 0.33 W/cm2、ISATP 为 1.67 W/cm2 ，正弦波载波频率 932.7 kHz，工作周期(duty cycle)20%，每一脉冲所包络的频率(tone burst repetition frequency)为 10 Hz～10 kHz。结果发现：在LnCap细胞，转化率在长脉冲包络频率低时高，10 Hz时可达65%，连续波的转化率也达50%，而当长脉冲包络频率为 1 kHz时则未见转化；转染后2 d以流式细胞术检测基因表达，发现长脉冲包络频率为 10 Hz～150 Hz时表达率为20%～30%，100Hz时最高，高于 150 Hz表达率反而下降，1 kHz和连续波则无表达，而在PC-3细胞，长脉冲包络频率为 50 Hz时表达率增加。此提示使用超声转化时，高转化率并不一定意味着高表达率。
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虽然机械作用和空化效应均可影响细胞膜通透性，但许多学者认为超声提高细胞膜通透性主要源于空化效应。压力波作用于细胞，仍是通过引起惯性空化(inertial cavitation)而致细胞结构和(或)功能变化[4]。Liu等[5]在研究超声致细胞膜通透性改变时提出以声压估计膜通透性改变的程度，认为这种压力参数可以反映超声的空化特征。超声的空化效应有细胞毒作用，可以损伤DNA，采用超声切割基因组DNA建立基因文库时即利用了超声的这种作用[6]，且在多糖存在、DNA甲基化，内切酶难以完全消化时效果尤佳。这可能也是超声转化时高转化率未致高表达率的原因之一。许多研究试图提高DNA在超声作用下的稳定性，以保证基因片段的完整性。采用阳离子脂质体是效果确切的方法。7.2 kb的ρCMVβ质粒与不同的阳离子脂质体混合后予以超声辐照，发现超声不仅可使形成的脂质体微粒体积减小，分布更均匀，更对DNA的完整性有保护作用，DNA/脂质体复合物微粒中，DNA的完整性与[DNA]/[脂]相关[7]。Lawrie等[8]以插入荧光素酶基因的质粒转化培养的牛血管平滑肌细胞和内皮细胞，超声 1 MHz、0.4 W/cm2辐照 60 s或 30 min,48 h后发现在血管平滑肌细胞荧光素酶活力分别增加 7.5 倍和 2.4 倍，内皮细胞内增加 3.3 倍。这提示超声这种非病毒的基因导入方法对哺乳动物细胞基因转化确切有效。
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有学者试图用人工空化(artificial cavitation)的方法提高超声基因转化的效率。Bao等[9]采用声学造影剂Albunex为空化核，超声频率为 2.25 MHz，辐照 1 min，以插入荧光素酶基因的pGL2转化CHO细胞，在培养液中加入10% Albunex，声压 0.28 MPa时荧光素酶产生明显增加，0.8 MPa时可达 0.13 ng/106细胞，如果溶液中含10%胎牛血清，则在 0.2 MPa时即增加，0.8 MPa时达 0.33 ng/106细胞；但如去除Albunex，在0.8 MPa时荧光酶仅为 3.1×10-5 ng/106细胞。人工增强的空化明显提高转化率也表明在超声转化中空化效应起重要作用，血清对基因转化有明显影响的原因有待进一步阐明。Greenleaf等[10]采用超声转化软骨细胞，以Albunex增强空化，发现相似结果，辐照前加入Albunex 50×106气泡/ml，转化率可达43%。高于一些经典的转化方案。
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超声基因转化的成功率决定于超声辐照条件、受体细胞和基因的特性、DNA浓度、DNA/脂质体以及有无增强空化的因素存在；但对转化后基因表达而言，则决定于超声致细胞损伤与致细胞死亡之间的平衡及DNA的完整性。Liu指出超声辐照致细胞膜通透性改变决定于其1/2驱动频率时的声压及超谐波[5]，这可用于超声基因转化时确定辐照条件。基于超声生物学效应的基因导入方法为非生物性，其转化效率高，因而无论从生物防护的角度还是从转化的有效性，超声转化均为一种很有前途的转化途径。在实际应用中，应根据各种可能的影响因素综合考虑，确定最佳条件。在用于体内基因转化时，尚需考虑声波在传播过程中的衰减和生物组织的其他声学特性。
以超声行基因转化，无论对对数生长期细胞还是静止期细胞，均能有效转化，且同一种细胞在对数生长期和静止期转化结果无差异[9]。机体内某些组织处于分裂期的细胞比例低，以逆转录病毒载体转染不能满足治疗需要，而超声转化对细胞所处周期并无特殊要求，这也显示超声用于体内基因转化的优越性。干细胞属相对静止细胞，因而超声可用于干细胞基因转化。超声基因转化既可用于贴壁生长细胞，也可用于悬浮细胞，因而超声可应用于基于造血干细胞基因转化的治疗方案，如转染mdr1 以提高机体对化疗的耐受力。
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超声转化是通过声波提高细胞膜通透性实现的，因而控制超声辐照条件以控制膜通透性受影响的程度，可使大片段基因，如携带调控序列的核酸片段，转入受体细胞，而大片段基因的转化是基因治疗中的一个难题。
Yang等[11]报道 50 mW/cm2的超声可增强实验性骨折鼠aggrecan基因的表达。Forytokova等[12]也指出 800 kHz、0.1 W/cm2的连续波可促进Ehrich腹水瘤细胞DNA生物合成。Zur等[13]发现 0.5 W/cm2和 3.0 W/cm2超声能促进人妊娠中期羊水细胞RNA生物合成，并认为这可能是由于超声空化使DNA双螺旋间氢键断裂， DNA解链而诱发RNA合成。这些结果提示适当的超声辐照能促进基因表达，使蛋白质合成增加。Unger等[14]研究超声对阳离子脂质体转化的基因表达的影响，采用 Hela、NIH/3T3、C127I细胞，以氯霉素乙酰基转移酶为目的基因，发现受频率为 1 MHz、0.5 W/cm2连续波辐照 5 s或 30 s、48 h后三种细胞基因表达均明显增加,提示相对低强度超声可促进转化基因的表达，但未能得出其确切机制。
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聚焦超声的靶向升温被用于肿瘤治疗。1998年Madio等[15]报道MRI引导下以聚焦超声升温 5 ℃～8 ℃，使鼠受辐照区及周围区域HSP70 mRNA 增加3～67倍，由于HSP的启动子对温度敏感，因此如采用此类对温度敏感的启动子，利用聚焦超声的热效应能较好控制目的基因的表达水平，为基因治疗中控制目的基因表达提供了一种思路。而聚焦超声的升温，随着超声理论的研究和应用，必将更为精确。
连续波和非连续波超声对基因转化和表达的影响，在不同学者的研究中差异颇大，由于各报道的实验条件不尽相同，给相互间比较带来困惑。除受体细胞和目的基因的特性，超声波系统和辐照方法可能也是造成差异的重要原因。由于声强表示方法和辐照剂量计量方法的多样性，辐照时采用何种透声介质，以及受辐照过程中容器是否旋转及旋转频率等因素,通过对声波波形、声压以及传播过程中的衰减等作用而影响净受辐照剂量。Bao发现即使人工空化存在，在受辐照过程旋转试管与否其转化结果迥异[9]。特别当基因导入和基因表达均试图应用超声时，更应充分考虑这些因素的影响。
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二、提高基因治疗的靶向性
目前用于基因治疗的基因，许多与正常组织仅有量的差异，因而基因治疗的靶向性关系到基因治疗能否应用于临床实践。提高其靶向性，既能有效治疗疾患，又不致因目的基因导入而影响正常细胞、组织的生理功能。
超声引导下的基因导入是基因治疗中的常用方法[16]，其实质是介入超声在基因治疗中的应用，仍属于超声影像学的范畴。Wang等[17]报道妊娠 28 d的兔在超声引导下行胎心穿刺注射插入β-半乳糖苷酶基因的腺病毒，发现出生后在部分动物肝细胞酶阳性率达40%,这为胎儿肝疾患的基因治疗提供了有益的尝试。同样，超声引导下也可向其他脏器注射基因片段。Rochitz等[18]报道超声引导下注射分泌IL-2的成纤维细胞治疗晚期实体瘤，结果令人鼓舞。
局部小血管内注射是提高目的基因在靶组织内浓度的方法之一，但其操作复杂，且DNA并不一定能通过血管壁到达组织。Price等[19]报道 2.3 MHz、机械指数(mechanical index)为0.7 的超声辐照鼠肌肉，并经血管注射 503 nm和 205 nm 的聚合物微囊，发现其在肌肉中平均扩散面积分别为 24.2×103 mm2和 27.2×103 mm2，这是由于超声与微血管内微气泡相互作用，引发血管壁损伤、破裂而使胶体微粒穿过血管内皮。该技术如与基因注射相结合，采用脂质体微囊导入基因，能有效提高 DNA/脂质体穿越微血管到达目标组织，将对提高病变组织中治疗基因的浓度，提高治疗效果和减小副作用有利。而在DNA/脂质体制备过程中应用超声，可使微粒更细微,分布更均匀，也有利于提高穿透率而提高转化率。
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Pillai等[20]采用超声雾化将插入目的基因的质粒/阳离子脂复合物导入肺，在实验动物肺获得了目的基因的表达，提示超声在呼吸道疾患基因治疗中的应用前景。这种作用可能与超声使雾化粒子更小、更均匀，更易于到达肺上皮细胞，而阳离子脂又保护了基因片段的完整性有关。
采用对温度敏感的启动子作为目的基因的启动子，以聚焦超声靶向升温也能控制目的基因表达的区域性，能很好地保证基因治疗的安全性，而聚焦超声精确的靶向性则是合理控制目的基因表达区域性的关键。
基因治疗的监测和部分疗效判定亦可使用超声诊断技术，客观的评价有助于确定治疗的最佳方案。超声也可用于从组织标本中分离DNA、RNA行分子生物学诊断而进行治疗前的确诊和协助判断疗效。
分子生物学的发展提供了越来越多的可用于基因治疗的DNA片段，使基因治疗可应用的范围更加广泛，同一疾病治疗的侯选基因种类也将增多，而超声医学则提供了一种新手段。二者有机结合，将有助于基因治疗的研究和应用；探索结合的最适点，将是该研究的重点。
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参 考 文 献
1，Wyber JA, Andrews J,D'Emanuele A. The use of sonication for the efficient delivery of plasmid DNA into cells. Pharm Res, 1997,14:750-756.
2，Kim HJ, Greenleaf JF, Kinnick RR, et al. Ultrasound-mediated transfection of mammalian cells. Hum Gene Ther, 1996,7:1339-1346.
3，Tata DB, Dunn F, Tindall DJ. Selective clinical ultrasound signals mediate differential gene transfer and expression in two human prostate cancer cell line: LnCap and PC-3. Biochem Biophys Res Commun, 1997,234:64-67.
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4，Miller MW, Miller DL, Brayman AA. A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. Ultrasound Med Biol, 1996,22:1131-1154.
5，Liu J, Lewis TN, Prausnitz MR. Non-invasive assessment and control of ultrasound-mediated membrane permeabilization. Pharm Res,1998,15:918-924.
6，Kawata Y, Yano S, Thanappan AK,et al. Prepration of a genomic library using a TA vector .Prep Biochem Biotechnol, 1999,29:91-100.
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7，Wasan EK, Reimer DL, Bally MB. Plasmid DNA is protected against ultrasonic cavitation-induced damage when complexed to cationic liposomes. J Pharm Sci, 1996,85:427-433.
8，Lawrie A, Brisken AF, Francis SE,et al. Ultrasound enhances reporter gene expression after transfection of vascular cells in vitro. Circulation, 1999,99:2617-2620.
9，Bao S,Thrall BD, Miller DL. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. Ultrasound Med Biol, 1997,23:953-959.
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10，Greenleaf WJ, Bolander ME, Sarkar G, et al. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound Med Biol, 1998,24:587-595.
11，Yang KH, Parkizi J, Wang SJ, et al. Exposure to low-intensity ultrasound increases aggrecan gene expression in a rat femur fracture model. J Orthop Res, 1996,14:802-809.
12，Forytokova L, Hrazdira I, Mornstein V. Effect of ultrasound on DNA synthesis in tumor cells. Ultrasound Med Biol, 1995,21:585-592.
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13，Zur O, Shneyour Y, Dan U, et al. A possible effects of ultrsasound on RNA synthesis in cultured amniocytes. Acta Obstet Gynecol Scand,1993,72:243-245.
14，Unger EC, McCreery TP, Sweitzer RH. Ultrasound enhances gene expression of liposomal transfection. Invest Radiol, 1997,32:723-727.
15，Madio DP, van Gelderen P, DesPres D,et al. On the feasibility of MRI-guided focused ultrasound for local induction of gene expression. J Magn Reson Imaging, 1998,8:101-104.
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16，Voss SD, Kruskal JB. Gene therapy: a primer for radiologists. Radiographics, 1998,18:1343-1372.
17，Wang G, Williamson R, Mueller G, et al. Ultrasound-guided gene transfer to hepatocytes in utero. Fetal Diagn Ther, 1998,13:197-205.
18，Rochlitz C, Jantscheff P, Bongartz G, et al. Gene therapry study of cytokine-transfected xenogeneic cells (Vero-interleukin-2) in patients with metastatic solid tumors. Cancer Gene Ther,1999,6:271-281.
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19，Price RJ, Skyba DM, Kaul S, et al. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures by targed microbubble destruction with ultrasound. Circulation, 1998,98:1264-1267.
20，Pillai R, Petrak K, Blezinger P, et al. Ultrasonic nebulization of cationic lipid-based gene delivery system for airway administration. Pharm Res, 1998,15:1743-1747.
(收稿日期:1999-09-27), http://www.100md.com
单位：王智彪(400016 重庆医科大学医学超声工程研究所)；于廷和(山东医科大学研究生)；江森(山东医科大学附属医院)
关键词：
中华超声影像学杂志000620
超声医学与基因治疗学近年迅猛发展。基因治疗被认为是许多疾病治愈的希望。随着超声理论的研究，仪器的改进和完善，生物学效应研究的深入，超声医学已超出经典超声影像学的范畴,在基因治疗中已显示出广阔的应用前景。
无论是体内还是体外基因治疗，目的基因的转化和表达是治疗能否成功的关键。基因转化可分体内转化和体外转化，体内基因治疗时还需控制转入基因的表达范围和表达程度。
一、促进基因转化和表达
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超声可影响细胞膜的通透性，其提高细胞膜通透性存在阈值剂量。在合理控制超声辐照的条件下，既能使膜通透性可逆性增加，又不致使细胞明显受损。细胞膜通透性改变是基因转化的前提。Wyber等[1]报道20 kHz、2.0 W/cm2的超声辐照 30 s使质粒转入酵母为对照的20倍。
Kim 等[2]以插入LacZ或neo基因的质粒转化鼠成纤维细胞和软骨细胞，发现最大转化率时的超声条件为 1 MHz、声压(411±189)kPa的连续波辐照 20 s或 30 s，或 1 MHz、声压(319±157)kPa的连续波辐照 40 s或 60 s，成纤维细胞和软骨细胞平均转化率分别为 0.34%和 2.40%，而用 3.5 MHz的声波辐照则未见转化，他认为主要应归结于超声的空化效应，而声压与空化密切相关。Tata等[3]以前列腺癌细胞激素敏感株LnCap和不敏感株PC-3为受体细胞，以超声转化插入GFP的质粒，净受辐照能量为328.5 J。分别采用连续波和包络音频(tone-burst)的脉冲超声波(简称：长脉冲超声)，连续波频率 932.7 kHz、ISATP 为 1.67 W/cm2 ；长脉冲超声ISATA为 0.33 W/cm2、ISATP 为 1.67 W/cm2 ，正弦波载波频率 932.7 kHz，工作周期(duty cycle)20%，每一脉冲所包络的频率(tone burst repetition frequency)为 10 Hz～10 kHz。结果发现：在LnCap细胞，转化率在长脉冲包络频率低时高，10 Hz时可达65%，连续波的转化率也达50%，而当长脉冲包络频率为 1 kHz时则未见转化；转染后2 d以流式细胞术检测基因表达，发现长脉冲包络频率为 10 Hz～150 Hz时表达率为20%～30%，100Hz时最高，高于 150 Hz表达率反而下降，1 kHz和连续波则无表达，而在PC-3细胞，长脉冲包络频率为 50 Hz时表达率增加。此提示使用超声转化时，高转化率并不一定意味着高表达率。
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虽然机械作用和空化效应均可影响细胞膜通透性，但许多学者认为超声提高细胞膜通透性主要源于空化效应。压力波作用于细胞，仍是通过引起惯性空化(inertial cavitation)而致细胞结构和(或)功能变化[4]。Liu等[5]在研究超声致细胞膜通透性改变时提出以声压估计膜通透性改变的程度，认为这种压力参数可以反映超声的空化特征。超声的空化效应有细胞毒作用，可以损伤DNA，采用超声切割基因组DNA建立基因文库时即利用了超声的这种作用[6]，且在多糖存在、DNA甲基化，内切酶难以完全消化时效果尤佳。这可能也是超声转化时高转化率未致高表达率的原因之一。许多研究试图提高DNA在超声作用下的稳定性，以保证基因片段的完整性。采用阳离子脂质体是效果确切的方法。7.2 kb的ρCMVβ质粒与不同的阳离子脂质体混合后予以超声辐照，发现超声不仅可使形成的脂质体微粒体积减小，分布更均匀，更对DNA的完整性有保护作用，DNA/脂质体复合物微粒中，DNA的完整性与[DNA]/[脂]相关[7]。Lawrie等[8]以插入荧光素酶基因的质粒转化培养的牛血管平滑肌细胞和内皮细胞，超声 1 MHz、0.4 W/cm2辐照 60 s或 30 min,48 h后发现在血管平滑肌细胞荧光素酶活力分别增加 7.5 倍和 2.4 倍，内皮细胞内增加 3.3 倍。这提示超声这种非病毒的基因导入方法对哺乳动物细胞基因转化确切有效。
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有学者试图用人工空化(artificial cavitation)的方法提高超声基因转化的效率。Bao等[9]采用声学造影剂Albunex为空化核，超声频率为 2.25 MHz，辐照 1 min，以插入荧光素酶基因的pGL2转化CHO细胞，在培养液中加入10% Albunex，声压 0.28 MPa时荧光素酶产生明显增加，0.8 MPa时可达 0.13 ng/106细胞，如果溶液中含10%胎牛血清，则在 0.2 MPa时即增加，0.8 MPa时达 0.33 ng/106细胞；但如去除Albunex，在0.8 MPa时荧光酶仅为 3.1×10-5 ng/106细胞。人工增强的空化明显提高转化率也表明在超声转化中空化效应起重要作用，血清对基因转化有明显影响的原因有待进一步阐明。Greenleaf等[10]采用超声转化软骨细胞，以Albunex增强空化，发现相似结果，辐照前加入Albunex 50×106气泡/ml，转化率可达43%。高于一些经典的转化方案。
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超声基因转化的成功率决定于超声辐照条件、受体细胞和基因的特性、DNA浓度、DNA/脂质体以及有无增强空化的因素存在；但对转化后基因表达而言，则决定于超声致细胞损伤与致细胞死亡之间的平衡及DNA的完整性。Liu指出超声辐照致细胞膜通透性改变决定于其1/2驱动频率时的声压及超谐波[5]，这可用于超声基因转化时确定辐照条件。基于超声生物学效应的基因导入方法为非生物性，其转化效率高，因而无论从生物防护的角度还是从转化的有效性，超声转化均为一种很有前途的转化途径。在实际应用中，应根据各种可能的影响因素综合考虑，确定最佳条件。在用于体内基因转化时，尚需考虑声波在传播过程中的衰减和生物组织的其他声学特性。
以超声行基因转化，无论对对数生长期细胞还是静止期细胞，均能有效转化，且同一种细胞在对数生长期和静止期转化结果无差异[9]。机体内某些组织处于分裂期的细胞比例低，以逆转录病毒载体转染不能满足治疗需要，而超声转化对细胞所处周期并无特殊要求，这也显示超声用于体内基因转化的优越性。干细胞属相对静止细胞，因而超声可用于干细胞基因转化。超声基因转化既可用于贴壁生长细胞，也可用于悬浮细胞，因而超声可应用于基于造血干细胞基因转化的治疗方案，如转染mdr1 以提高机体对化疗的耐受力。
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超声转化是通过声波提高细胞膜通透性实现的，因而控制超声辐照条件以控制膜通透性受影响的程度，可使大片段基因，如携带调控序列的核酸片段，转入受体细胞，而大片段基因的转化是基因治疗中的一个难题。
Yang等[11]报道 50 mW/cm2的超声可增强实验性骨折鼠aggrecan基因的表达。Forytokova等[12]也指出 800 kHz、0.1 W/cm2的连续波可促进Ehrich腹水瘤细胞DNA生物合成。Zur等[13]发现 0.5 W/cm2和 3.0 W/cm2超声能促进人妊娠中期羊水细胞RNA生物合成，并认为这可能是由于超声空化使DNA双螺旋间氢键断裂， DNA解链而诱发RNA合成。这些结果提示适当的超声辐照能促进基因表达，使蛋白质合成增加。Unger等[14]研究超声对阳离子脂质体转化的基因表达的影响，采用 Hela、NIH/3T3、C127I细胞，以氯霉素乙酰基转移酶为目的基因，发现受频率为 1 MHz、0.5 W/cm2连续波辐照 5 s或 30 s、48 h后三种细胞基因表达均明显增加,提示相对低强度超声可促进转化基因的表达，但未能得出其确切机制。
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聚焦超声的靶向升温被用于肿瘤治疗。1998年Madio等[15]报道MRI引导下以聚焦超声升温 5 ℃～8 ℃，使鼠受辐照区及周围区域HSP70 mRNA 增加3～67倍，由于HSP的启动子对温度敏感，因此如采用此类对温度敏感的启动子，利用聚焦超声的热效应能较好控制目的基因的表达水平，为基因治疗中控制目的基因表达提供了一种思路。而聚焦超声的升温，随着超声理论的研究和应用，必将更为精确。
连续波和非连续波超声对基因转化和表达的影响，在不同学者的研究中差异颇大，由于各报道的实验条件不尽相同，给相互间比较带来困惑。除受体细胞和目的基因的特性，超声波系统和辐照方法可能也是造成差异的重要原因。由于声强表示方法和辐照剂量计量方法的多样性，辐照时采用何种透声介质，以及受辐照过程中容器是否旋转及旋转频率等因素,通过对声波波形、声压以及传播过程中的衰减等作用而影响净受辐照剂量。Bao发现即使人工空化存在，在受辐照过程旋转试管与否其转化结果迥异[9]。特别当基因导入和基因表达均试图应用超声时，更应充分考虑这些因素的影响。
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二、提高基因治疗的靶向性
目前用于基因治疗的基因，许多与正常组织仅有量的差异，因而基因治疗的靶向性关系到基因治疗能否应用于临床实践。提高其靶向性，既能有效治疗疾患，又不致因目的基因导入而影响正常细胞、组织的生理功能。
超声引导下的基因导入是基因治疗中的常用方法[16]，其实质是介入超声在基因治疗中的应用，仍属于超声影像学的范畴。Wang等[17]报道妊娠 28 d的兔在超声引导下行胎心穿刺注射插入β-半乳糖苷酶基因的腺病毒，发现出生后在部分动物肝细胞酶阳性率达40%,这为胎儿肝疾患的基因治疗提供了有益的尝试。同样，超声引导下也可向其他脏器注射基因片段。Rochitz等[18]报道超声引导下注射分泌IL-2的成纤维细胞治疗晚期实体瘤，结果令人鼓舞。
局部小血管内注射是提高目的基因在靶组织内浓度的方法之一，但其操作复杂，且DNA并不一定能通过血管壁到达组织。Price等[19]报道 2.3 MHz、机械指数(mechanical index)为0.7 的超声辐照鼠肌肉，并经血管注射 503 nm和 205 nm 的聚合物微囊，发现其在肌肉中平均扩散面积分别为 24.2×103 mm2和 27.2×103 mm2，这是由于超声与微血管内微气泡相互作用，引发血管壁损伤、破裂而使胶体微粒穿过血管内皮。该技术如与基因注射相结合，采用脂质体微囊导入基因，能有效提高 DNA/脂质体穿越微血管到达目标组织，将对提高病变组织中治疗基因的浓度，提高治疗效果和减小副作用有利。而在DNA/脂质体制备过程中应用超声，可使微粒更细微,分布更均匀，也有利于提高穿透率而提高转化率。
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Pillai等[20]采用超声雾化将插入目的基因的质粒/阳离子脂复合物导入肺，在实验动物肺获得了目的基因的表达，提示超声在呼吸道疾患基因治疗中的应用前景。这种作用可能与超声使雾化粒子更小、更均匀，更易于到达肺上皮细胞，而阳离子脂又保护了基因片段的完整性有关。
采用对温度敏感的启动子作为目的基因的启动子，以聚焦超声靶向升温也能控制目的基因表达的区域性，能很好地保证基因治疗的安全性，而聚焦超声精确的靶向性则是合理控制目的基因表达区域性的关键。
基因治疗的监测和部分疗效判定亦可使用超声诊断技术，客观的评价有助于确定治疗的最佳方案。超声也可用于从组织标本中分离DNA、RNA行分子生物学诊断而进行治疗前的确诊和协助判断疗效。
分子生物学的发展提供了越来越多的可用于基因治疗的DNA片段，使基因治疗可应用的范围更加广泛，同一疾病治疗的侯选基因种类也将增多，而超声医学则提供了一种新手段。二者有机结合，将有助于基因治疗的研究和应用；探索结合的最适点，将是该研究的重点。
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参 考 文 献
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(收稿日期:1999-09-27), http://www.100md.com