c-fos、c-myb和c-erbB-2与大鼠卵巢颗粒细胞生孕酮调控关系的研究
作者：郑月慧 钟志胜 方廉 金萱 况海斌
单位：江西医学院生殖研究室，南昌 330006
关键词：
中国应用生理学杂志000320 摘要 目的和方法：用离体细胞体外孵育法，观察反义c-fos、c-myb和c-erbB-2 寡脱氧核苷酸(c-fos ODN、c-myb ODN和c-erbB-2 ODN)对hCG诱导大鼠颗粒细胞孕酮产 生的影响,同时观察内皮素-1、γ-氨基丁酸和钙离子通道阻断剂维拉帕米对颗粒细胞中c -fos、c-myb和c-erbB-2蛋白的影响。结果：反义c-fos、c-myb和c-erbB -2 ODN均明显抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生，并伴有各自癌基因蛋白染色阳性的颗粒细 胞百分率下降；而无义tat ODN没有相应的作用。2×10-7mol/L内皮素-1和5×10 -6mol/L γ-氨基丁酸能显著抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生，同时使c-fos、c-my b和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降；而1×10-6mol/L维拉帕米对hCG 诱导颗粒细胞孕酮的产生和c-fos、c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率均 无明显影响。结论：c-fos、c-myb和c-erbB-2与hCG诱导颗粒细胞孕酮 的产生密切相关；内皮素-1、γ-氢基丁酸能通过调节这些癌基因在颗粒细胞中的表达而 影响hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生；而Ca2+无相应的作用。
, 百拇医药
关键词： 癌基因； 反义寡脱氧核苷酸； 颗粒细胞； 孕酮
中图分类号： R335·5
文献标识码:A
文章编号: 1000-6834(2000)03-0268-04
THE INVERSTIGATION OF c-fos、c-myb、c-erbB-2 ON THE REGULATION OF HCG-INDUCED PROGESTERONE PRODUCTION IN RAT GRANULOSA CELLS
ZHENG Yue-hui, ZHONG Zhi-shen, FANG Lian, JIN Xian, Kuang H ai-bing
, 百拇医药 (Department of physiology, Jiangxi Medical College,Nanchang 33000 6)
ABSTRACT
Aim and methods:The effects of c-fos、c-myb and c-erbB-2 antisense o ligodeoxynucleotides(antisense c-fos、c-myb、c-erbB-2 ODN) on the hCG-indu ced progesterone production of isolated rat granulosa cells and the effect of en dothelin-1, γ-GABA and Ca2+ on c-fos、c-myb、c-erbB-2 oncoprotein in granulosa cels were investigated. Results: All of the antisense c-fos、c-myb and c-erbB-2 ODN inhibited the hCG-induced progesterone produc tion significantly, the percentges of granulosa cells stained for their oncoprot ein were also decreased remarkably. Nonsense that ODN had no similar effects on granulosa cells. Further experiments showed that 2×10-7 mol/L of endothe lin-1 and 5×10-6 mol/L of γ-GABA decreased the percentage of granulosa cells stained for c-fos、c-myb、c-erbB-2 protein, and decreased the hCG-in duced progesterone content. However, 10-6mol/L of verapamil had no effects on c-fos、c-myb、c-erbB-2 expression and hCG-induced progesterone producti on. Conclusion: c-fos、c-myb and c-erbB-2 play an improtant role in hCG-induced progesterone production of rat granulosa cells.
, 百拇医药
KEY WORDS: oncogene; antisense oligodeoxynucleotide ; granulosa cells; progesterone
有资料表明，原癌基因参与性腺功能的调控[1]。在大鼠离体黄体细胞的体外 实验中，我们已观察到c-myc、c-myb和c-fos与hCG诱导黄体细胞生孕酮和雌二醇的功能 密切相关[2-4]，并发现c-erbB-2也参与黄体细胞内分泌功能的调控(待发表)。 在大鼠颗粒细胞的体外实验中，Delidow等发现c-myc和c-fos可能是促性腺激素调节颗粒 细胞功能重要的细胞内分子机制[5]，但是c-myb和c-erbB-2与颗粒细胞功能有 何关系尚不明了，这些癌基因如c-fos、c-myb和c-erbB-2与一些目前认为在调节卵巢功 能中起重要作用的物质如内皮素[6]、γ-氨基丁酸[7]和钙离子等有何关 系还不清楚。为此本文观察了反义c-fos、c-myb和c-erbB-2 ODN对大鼠排卵前卵泡颗粒 细胞生孕酮作用的影响，并探讨了内皮素-1、γ-氨基丁酸和维拉帕米对颗粒细胞中c-fo s c-myb和c-erbB-2表达的影响，以进一步了解卵巢的生理调控机制。
, 百拇医药
1 材科和方法
1.1 主要试剂
孕马血清促性腺激素(PMSG)(天津实验动物中心产品)；人绒毛膜促性腺激素(hCG)(日本 三共I-N药品株式会社产品)；MEM(minimum essential medium)培养液(美国Life Techn ologies 提供)，内加25 mmol/L Hepes和0.5% BSA，用7.6% NaHCO3调节至pH 7.2～7 .4；寡脱氧核苷酸(ODN)(上海生物工程中心合成)。反义c-fos ODN序列为5'-ATGTTCTCG GGTTTCAAC-3'；反义c-myb ODN序列为5'-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3'；反义c-erb B-2 O DN 序列为5'-CAGCTCCATGGTGCT-3'；无义tat ODN序列为5'CATTTCT-TGCTCTCC-3'，以之 作为对照。上述ODN均硫代磷酸修饰；内皮素-1(ET-1)分子量为2491.9(Sigma公司产品); γ-氨基丁酸(γ-GABA)分子量为103.12(Sigma公司产品)；维拉帕米(Verapamil)分子量 为491.1(Sigma公司产品)。上述试剂使用时用MEM培养液配成所需浓度。
, 百拇医药
1.2 动物模型及颗粒细胞孵育
选用25～29 d龄未成年健康雌性SD大白鼠，每鼠皮下注射(SC)PMSG 50 IU，48 h后断 头 处死，迅速取出卵巢，放在冰冷的MEM培养液中，用眼科手术刀或针尖刺破卵泡后再轻轻挤 压，释放颗粒细胞于MEM培养液内，此后操作按文献[8]进行。分装成每管含活细胞5×10 8个/L，预孵育15 min后，加入处理试剂，继续孵育4 h，将细胞悬液 4℃，250 g离心10 min，取上清液贮于-20℃待测孕酮；细胞沉淀涂于玻片上，用2%的多聚甲醛固定，干后， 贮于4℃待测细胞内相应的癌基因蛋白。
1.3 测试方法
(1)细胞活力： 用0.2%台盼蓝染液测定。活力一般为37～40%，与以前结果基本一 致[8]。(2) 孕酮：用放射免疫分析法(RIA)测定，放免药盒由天津九鼎医学生物工 程有限公司提供。测定时设有内、外部质量控制血清，批间及批内变异系数分别<10%和5 %。(3)细胞内c-fos、c-myb和c-erbB-2癌基因蛋白：用LSAB(labelled streptavid in biotin)免疫细胞化学方法测定。试剂盒为丹麦DAKO公司产品。其中c-fos、c-myb和c -erbB-2一抗均为兔抗鼠多克隆抗体，二抗为生物素标记的猪抗兔免疫球蛋白，三抗为 过氧化酶标记的抗生蛋白链菌素(LSAB)。基本步骤为：细胞固定后，用3%H2O2封闭内源 性过氧化酶和10%正常血清封闭非特性抗原，滴加1∶100一抗4℃24 h时，阴性对照用正常 兔血清替代。然后分别滴加二抗(1∶200)和三抗各60 min，再用二氨联苯胺(diaminobens idine，DAB)显色4～5 min，以上各步之间用PBS充分浸洗。最后脱水、透明、封片、镜检。 染色阳性细胞为深棕色，每片至少计算100个细胞算出染色阳性细胞的百分率。
, 百拇医药
1.4 统计处理
结果以均数±标准差(
±s)表示，应用组间均数双侧t检验检查其显著 性差异。
2 结果
2.1 反义c-fos、c-myb和c-erbB-2寡脱氧核苷酸对hCG诱导大鼠颗粒细胞 孕酮生成的影响
排卵前卵泡颗粒细胞在孵育4 h后，基础孕酮分泌量为16.24±3.73 ng/5×105个细胞 ，1 250 IU/L hCG使孕酮分泌量增至58.44±3.25 ng/5×105个细胞，两者比较有非常 显 著的差异(P<0.01，n=6)，表明颗粒细胞对hCG反应良好。20 μmol/L反义c-fos O DN、c-myb ODN和c-erbB-2 ODN分别使hCG诱导的孕酮产生量下降了49.30%、54.87 %和30.47%，与单独用hCG组比较均有非常显著的差异(P<0.01,表1)。
, 百拇医药
Tab.1 Effects of c-fos、c-myb and c -erbB-2 antisense
oligodeoxynucleotide on hCG-induced progesterone
production in rat granulosa cells(±s，n=6) Group
Progesterone
(ng/5×105cells)
hCG(1250IU/L)
58.44±3.25
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hCG+antisense c-fos ODN(20 μmol/L)
29.63±6.32* *
hCG+antisense c-myb ODN(20 μmol/L)
26.37±3.53* *
hCG+antisense c-erbB-2 ODN(20μ mol/L)
40.63±7.42* *
hCG+nonsense tat ODN(20 μmol/L)
55.09±11.27
, 百拇医药
* * P<0.01 compared with hCG
2.2 反义c-fos、c-myb和c-erbB-2寡脱氧核苷酸对大鼠颗粒细胞 中各自癌基因蛋白的影响
与hCG组比较，20 μmol/L反义c-fos ODN使颗粒细胞中c-fos癌基因蛋白下降了45.3 1%(P<0.01)；20 μmol/L反义c-myb ODN使颗粒细胞中c-myb癌基因蛋白下降了50.9 9%(P<0.01)；20 μmol/L反义c-erbB-2 ODN使颗粒细胞中c-erbB-2癌基因蛋 白下降了24.94%(P<0.05，表2)。
Tab.2 Effects of c-fos、c-myb and c -erbB-2 antisense oligodeoxynucleotide on the percentages of
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positive staining granulosa cells for its nocoprotein(±s，n =4) Group
% of Positive stained ceIls
c-fos
c-myb
c-erbB-2
hCG(1250IU/L)
31.43±3.96
37.56±2.87
28.43±4.35
, 百拇医药
hCG+antisense c-fos ODN(20 μmol/L)
17.32±2.13* *
-
-
hCG+antisense c-myb ODN(20 μmol/L)
-
18.41±4.15**
-
hCG+antisense c-erbB-2 ODN(20 μ mol/L)
-
, http://www.100md.com
-
21.34 ±2.16*
* P<0.05,* * P<0.01 compared with hCG
2.3 内皮素-1、γ-氨基丁酸和维拉帕米对hCG诱导颗粒细胞 生孕酮和c-fos、c-myb和c-erbB-2癌基因蛋白的影响
2×10-7mol/L ET-1可极显著地抑制hCG诱导大鼠颗粒细胞孕酮的产生(P< 0.01)，并使c-fos c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率分别下降了26 .06%(P<0.05)、29.39%(P<0.01)和20.89%(P<0.05)；5×10-6mol /L γ-GABA也可显著地抑制hCG诱导大鼠颗粒细胞孕酮的产生(P<0.05)，并导致c-fos、 c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分数分别下降了18.99%(P<0.05)、21.8 6%(P<0.05)和13.23%；1×10-6mol/L维拉帕米对hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生和 c-fos、c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分数均无影响(表3)。
, 百拇医药
Tab.3 Effects of endothelin-1、γ-GAB A an d verapamil on hCG induced progesterone production in rat granulosa cells and
the percentages of positive staining granulosa cells for c-fos、c-myb a nd c-erbB-2 protein(±s，n=4) Group
Progesterone
(ng/5×105cells)
Po sitive staind cell(%)
, 百拇医药
c-fos
c-myb
c-erbB-2
hCG(1250 IU/L)
58.44±3.25a
31.43±3.96
37.56±2.87
28.43±4.35
hCG+ET-1(2×10-7mol/L)
41.53±8.66* *b
, 百拇医药 23.2 4±3.63* *
26.52±3.19* *
22.49±1.94*
hCG+γ-GABA(5×10-6mol/L
51.09±5.71* *c
25.46 ±2. 63*
29.35 ±4.67*
24.67±3.23
hCG+verapamil(1×10-6mol/L)
, 百拇医药
56.23±9.23b
32.56±4.77
36. 08±5.96
31.09±4.76
* P<0.05，* * P<0.01 compared wit h hCG a:n=6；b:n=12；c:n=7
3 讨论
在大鼠离体黄体细胞的体外实验中，我们已经观察到一些表达产物为DNA结合蛋白的核 内癌基因，如c-myc、c-fos、c-myb和表达产物具有酪氨酸专一的蛋白激酶(PTK)活性的 癌基因，如c-erbB-2等均参与hCG诱导黄体细胞内分泌功能的调控。Delidow等观察到c- myc和c-fos也参与颗粒细胞内分泌功能的调节[5],但其他癌基因如c-myb、c-e rbB-2等与颗粒细胞内分泌功能有何关系尚不清楚。本文利用人工合成的反义寡脱氧核苷酸 技术，观察到反义c-fos ODN、c-myb ODN和c-erbB-2 ODN均能抑制hCG诱导大鼠颗粒细 胞孕酮的产生，同时使各自癌基因蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率明显下降，而无义tat OD N没有类似的作用。表明c-fos、c-myb和c-erbB-2均与hCG调节卵巢颗粒细胞孕酮分泌功 能有关，这种作用是序列特异性的，是通过它们表达的癌基因蛋白产物而实现的。
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卵巢颗粒细胞的功能处在复杂的激素、神经递质和体内多种生物活性肽的调控之中，这诸多的细胞外调节物通过怎样的细胞内信号系统调节颗粒细胞的功能尚处于探索之中，是否与癌基因参与的跨膜信号传递有关还有待阐明。但已有研究结果提示，促性腺激素和胰岛素 样生长因子能通过诱导c-fos、c-myc、c-jun等的表达而调控颗粒细胞的分化和甾体激素 分泌功能[5,9，10]。本文研究了ET-1和γ-GABA对颗粒细胞中c-fos、c-myb和 c-erbB-2癌基因表达的影响。结果发现，2×10-7mol/L ET-1和5×10-6mo l/L γ-GABA均使c-fos、c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降；同时 显著抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生，提示ET-1和γ-GABA可通过影响c-fos、c-myb和 c-erbB-2的表达而影响颗粒细胞的内分泌功能。Ca2+不仅是细胞内重要的信使物质 ，近年来发现Ca2+还参与某些癌基因表达的调控。已有报道，Ca2+对诱导大鼠 睾丸支持细胞和脑海马细胞中c-fos的表达是必需的[11,12]。我们也观察到，用 维拉帕米阻断Ca2+内流后，大鼠黄体细胞中c-fos、c-myb和c-erbB-2的表达下降 ，并伴有hCG诱导黄体细胞孕酮生成的抑制[3,4]。但是，Ca2+对颗粒细胞中 c-fos、c-myb和c-erbB-2表达有何影响尚未见报道。本研究发现，用1×10-6mo l/L维拉帕米阻断颗粒细胞中Ca2+的内流后，c-fos、c-myb和c-erbB-2表达阳性 的颗粒细胞百分率无明显改变，表明，Ca2+可能与颗粒细胞中c-fos、c-myb和c- erbB-2的表达无关。还值得注意的是，此时hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生也无明显影响，提 示，Ca2+有可能因对c-fos、c-myb和c-erbB-2的表达无影响从而不影响颗粒细胞 的内分泌功能。
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39660027)
作者简介:郑月慧(1964-),女，江西，教授，硕土，从事生殖内分泌和计 划生育研究。
参考文献
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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收稿日期:1998-12-15;修回日期:2000-01-07, http://www.100md.com
单位：江西医学院生殖研究室，南昌 330006
关键词：
中国应用生理学杂志000320 摘要 目的和方法：用离体细胞体外孵育法，观察反义c-fos、c-myb和c-erbB-2 寡脱氧核苷酸(c-fos ODN、c-myb ODN和c-erbB-2 ODN)对hCG诱导大鼠颗粒细胞孕酮产 生的影响,同时观察内皮素-1、γ-氨基丁酸和钙离子通道阻断剂维拉帕米对颗粒细胞中c -fos、c-myb和c-erbB-2蛋白的影响。结果：反义c-fos、c-myb和c-erbB -2 ODN均明显抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生，并伴有各自癌基因蛋白染色阳性的颗粒细 胞百分率下降；而无义tat ODN没有相应的作用。2×10-7mol/L内皮素-1和5×10 -6mol/L γ-氨基丁酸能显著抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生，同时使c-fos、c-my b和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降；而1×10-6mol/L维拉帕米对hCG 诱导颗粒细胞孕酮的产生和c-fos、c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率均 无明显影响。结论：c-fos、c-myb和c-erbB-2与hCG诱导颗粒细胞孕酮 的产生密切相关；内皮素-1、γ-氢基丁酸能通过调节这些癌基因在颗粒细胞中的表达而 影响hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生；而Ca2+无相应的作用。
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关键词： 癌基因； 反义寡脱氧核苷酸； 颗粒细胞； 孕酮
中图分类号： R335·5
文献标识码:A
文章编号: 1000-6834(2000)03-0268-04
THE INVERSTIGATION OF c-fos、c-myb、c-erbB-2 ON THE REGULATION OF HCG-INDUCED PROGESTERONE PRODUCTION IN RAT GRANULOSA CELLS
ZHENG Yue-hui, ZHONG Zhi-shen, FANG Lian, JIN Xian, Kuang H ai-bing
, 百拇医药 (Department of physiology, Jiangxi Medical College,Nanchang 33000 6)
ABSTRACT
Aim and methods:The effects of c-fos、c-myb and c-erbB-2 antisense o ligodeoxynucleotides(antisense c-fos、c-myb、c-erbB-2 ODN) on the hCG-indu ced progesterone production of isolated rat granulosa cells and the effect of en dothelin-1, γ-GABA and Ca2+ on c-fos、c-myb、c-erbB-2 oncoprotein in granulosa cels were investigated. Results: All of the antisense c-fos、c-myb and c-erbB-2 ODN inhibited the hCG-induced progesterone produc tion significantly, the percentges of granulosa cells stained for their oncoprot ein were also decreased remarkably. Nonsense that ODN had no similar effects on granulosa cells. Further experiments showed that 2×10-7 mol/L of endothe lin-1 and 5×10-6 mol/L of γ-GABA decreased the percentage of granulosa cells stained for c-fos、c-myb、c-erbB-2 protein, and decreased the hCG-in duced progesterone content. However, 10-6mol/L of verapamil had no effects on c-fos、c-myb、c-erbB-2 expression and hCG-induced progesterone producti on. Conclusion: c-fos、c-myb and c-erbB-2 play an improtant role in hCG-induced progesterone production of rat granulosa cells.
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KEY WORDS: oncogene; antisense oligodeoxynucleotide ; granulosa cells; progesterone
有资料表明，原癌基因参与性腺功能的调控[1]。在大鼠离体黄体细胞的体外 实验中，我们已观察到c-myc、c-myb和c-fos与hCG诱导黄体细胞生孕酮和雌二醇的功能 密切相关[2-4]，并发现c-erbB-2也参与黄体细胞内分泌功能的调控(待发表)。 在大鼠颗粒细胞的体外实验中，Delidow等发现c-myc和c-fos可能是促性腺激素调节颗粒 细胞功能重要的细胞内分子机制[5]，但是c-myb和c-erbB-2与颗粒细胞功能有 何关系尚不明了，这些癌基因如c-fos、c-myb和c-erbB-2与一些目前认为在调节卵巢功 能中起重要作用的物质如内皮素[6]、γ-氨基丁酸[7]和钙离子等有何关 系还不清楚。为此本文观察了反义c-fos、c-myb和c-erbB-2 ODN对大鼠排卵前卵泡颗粒 细胞生孕酮作用的影响，并探讨了内皮素-1、γ-氨基丁酸和维拉帕米对颗粒细胞中c-fo s c-myb和c-erbB-2表达的影响，以进一步了解卵巢的生理调控机制。
, 百拇医药
1 材科和方法
1.1 主要试剂
孕马血清促性腺激素(PMSG)(天津实验动物中心产品)；人绒毛膜促性腺激素(hCG)(日本 三共I-N药品株式会社产品)；MEM(minimum essential medium)培养液(美国Life Techn ologies 提供)，内加25 mmol/L Hepes和0.5% BSA，用7.6% NaHCO3调节至pH 7.2～7 .4；寡脱氧核苷酸(ODN)(上海生物工程中心合成)。反义c-fos ODN序列为5'-ATGTTCTCG GGTTTCAAC-3'；反义c-myb ODN序列为5'-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3'；反义c-erb B-2 O DN 序列为5'-CAGCTCCATGGTGCT-3'；无义tat ODN序列为5'CATTTCT-TGCTCTCC-3'，以之 作为对照。上述ODN均硫代磷酸修饰；内皮素-1(ET-1)分子量为2491.9(Sigma公司产品); γ-氨基丁酸(γ-GABA)分子量为103.12(Sigma公司产品)；维拉帕米(Verapamil)分子量 为491.1(Sigma公司产品)。上述试剂使用时用MEM培养液配成所需浓度。
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1.2 动物模型及颗粒细胞孵育
选用25～29 d龄未成年健康雌性SD大白鼠，每鼠皮下注射(SC)PMSG 50 IU，48 h后断 头 处死，迅速取出卵巢，放在冰冷的MEM培养液中，用眼科手术刀或针尖刺破卵泡后再轻轻挤 压，释放颗粒细胞于MEM培养液内，此后操作按文献[8]进行。分装成每管含活细胞5×10 8个/L，预孵育15 min后，加入处理试剂，继续孵育4 h，将细胞悬液 4℃，250 g离心10 min，取上清液贮于-20℃待测孕酮；细胞沉淀涂于玻片上，用2%的多聚甲醛固定，干后， 贮于4℃待测细胞内相应的癌基因蛋白。
1.3 测试方法
(1)细胞活力： 用0.2%台盼蓝染液测定。活力一般为37～40%，与以前结果基本一 致[8]。(2) 孕酮：用放射免疫分析法(RIA)测定，放免药盒由天津九鼎医学生物工 程有限公司提供。测定时设有内、外部质量控制血清，批间及批内变异系数分别<10%和5 %。(3)细胞内c-fos、c-myb和c-erbB-2癌基因蛋白：用LSAB(labelled streptavid in biotin)免疫细胞化学方法测定。试剂盒为丹麦DAKO公司产品。其中c-fos、c-myb和c -erbB-2一抗均为兔抗鼠多克隆抗体，二抗为生物素标记的猪抗兔免疫球蛋白，三抗为 过氧化酶标记的抗生蛋白链菌素(LSAB)。基本步骤为：细胞固定后，用3%H2O2封闭内源 性过氧化酶和10%正常血清封闭非特性抗原，滴加1∶100一抗4℃24 h时，阴性对照用正常 兔血清替代。然后分别滴加二抗(1∶200)和三抗各60 min，再用二氨联苯胺(diaminobens idine，DAB)显色4～5 min，以上各步之间用PBS充分浸洗。最后脱水、透明、封片、镜检。 染色阳性细胞为深棕色，每片至少计算100个细胞算出染色阳性细胞的百分率。
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1.4 统计处理
结果以均数±标准差(
±s)表示，应用组间均数双侧t检验检查其显著 性差异。2 结果
2.1 反义c-fos、c-myb和c-erbB-2寡脱氧核苷酸对hCG诱导大鼠颗粒细胞 孕酮生成的影响
排卵前卵泡颗粒细胞在孵育4 h后，基础孕酮分泌量为16.24±3.73 ng/5×105个细胞 ，1 250 IU/L hCG使孕酮分泌量增至58.44±3.25 ng/5×105个细胞，两者比较有非常 显 著的差异(P<0.01，n=6)，表明颗粒细胞对hCG反应良好。20 μmol/L反义c-fos O DN、c-myb ODN和c-erbB-2 ODN分别使hCG诱导的孕酮产生量下降了49.30%、54.87 %和30.47%，与单独用hCG组比较均有非常显著的差异(P<0.01,表1)。
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Tab.1 Effects of c-fos、c-myb and c -erbB-2 antisense
oligodeoxynucleotide on hCG-induced progesterone
production in rat granulosa cells(
±s，n=6) GroupProgesterone
(ng/5×105cells)
hCG(1250IU/L)
58.44±3.25
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hCG+antisense c-fos ODN(20 μmol/L)
29.63±6.32* *
hCG+antisense c-myb ODN(20 μmol/L)
26.37±3.53* *
hCG+antisense c-erbB-2 ODN(20μ mol/L)
40.63±7.42* *
hCG+nonsense tat ODN(20 μmol/L)
55.09±11.27
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* * P<0.01 compared with hCG
2.2 反义c-fos、c-myb和c-erbB-2寡脱氧核苷酸对大鼠颗粒细胞 中各自癌基因蛋白的影响
与hCG组比较，20 μmol/L反义c-fos ODN使颗粒细胞中c-fos癌基因蛋白下降了45.3 1%(P<0.01)；20 μmol/L反义c-myb ODN使颗粒细胞中c-myb癌基因蛋白下降了50.9 9%(P<0.01)；20 μmol/L反义c-erbB-2 ODN使颗粒细胞中c-erbB-2癌基因蛋 白下降了24.94%(P<0.05，表2)。
Tab.2 Effects of c-fos、c-myb and c -erbB-2 antisense oligodeoxynucleotide on the percentages of
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positive staining granulosa cells for its nocoprotein(
±s，n =4) Group% of Positive stained ceIls
c-fos
c-myb
c-erbB-2
hCG(1250IU/L)
31.43±3.96
37.56±2.87
28.43±4.35
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hCG+antisense c-fos ODN(20 μmol/L)
17.32±2.13* *
-
-
hCG+antisense c-myb ODN(20 μmol/L)
-
18.41±4.15**
-
hCG+antisense c-erbB-2 ODN(20 μ mol/L)
-
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-
21.34 ±2.16*
* P<0.05,* * P<0.01 compared with hCG
2.3 内皮素-1、γ-氨基丁酸和维拉帕米对hCG诱导颗粒细胞 生孕酮和c-fos、c-myb和c-erbB-2癌基因蛋白的影响
2×10-7mol/L ET-1可极显著地抑制hCG诱导大鼠颗粒细胞孕酮的产生(P< 0.01)，并使c-fos c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率分别下降了26 .06%(P<0.05)、29.39%(P<0.01)和20.89%(P<0.05)；5×10-6mol /L γ-GABA也可显著地抑制hCG诱导大鼠颗粒细胞孕酮的产生(P<0.05)，并导致c-fos、 c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分数分别下降了18.99%(P<0.05)、21.8 6%(P<0.05)和13.23%；1×10-6mol/L维拉帕米对hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生和 c-fos、c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分数均无影响(表3)。
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Tab.3 Effects of endothelin-1、γ-GAB A an d verapamil on hCG induced progesterone production in rat granulosa cells and
the percentages of positive staining granulosa cells for c-fos、c-myb a nd c-erbB-2 protein(
±s，n=4) GroupProgesterone
(ng/5×105cells)
Po sitive staind cell(%)
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c-fos
c-myb
c-erbB-2
hCG(1250 IU/L)
58.44±3.25a
31.43±3.96
37.56±2.87
28.43±4.35
hCG+ET-1(2×10-7mol/L)
41.53±8.66* *b
, 百拇医药 23.2 4±3.63* *
26.52±3.19* *
22.49±1.94*
hCG+γ-GABA(5×10-6mol/L
51.09±5.71* *c
25.46 ±2. 63*
29.35 ±4.67*
24.67±3.23
hCG+verapamil(1×10-6mol/L)
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56.23±9.23b
32.56±4.77
36. 08±5.96
31.09±4.76
* P<0.05，* * P<0.01 compared wit h hCG a:n=6；b:n=12；c:n=7
3 讨论
在大鼠离体黄体细胞的体外实验中，我们已经观察到一些表达产物为DNA结合蛋白的核 内癌基因，如c-myc、c-fos、c-myb和表达产物具有酪氨酸专一的蛋白激酶(PTK)活性的 癌基因，如c-erbB-2等均参与hCG诱导黄体细胞内分泌功能的调控。Delidow等观察到c- myc和c-fos也参与颗粒细胞内分泌功能的调节[5],但其他癌基因如c-myb、c-e rbB-2等与颗粒细胞内分泌功能有何关系尚不清楚。本文利用人工合成的反义寡脱氧核苷酸 技术，观察到反义c-fos ODN、c-myb ODN和c-erbB-2 ODN均能抑制hCG诱导大鼠颗粒细 胞孕酮的产生，同时使各自癌基因蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率明显下降，而无义tat OD N没有类似的作用。表明c-fos、c-myb和c-erbB-2均与hCG调节卵巢颗粒细胞孕酮分泌功 能有关，这种作用是序列特异性的，是通过它们表达的癌基因蛋白产物而实现的。
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卵巢颗粒细胞的功能处在复杂的激素、神经递质和体内多种生物活性肽的调控之中，这诸多的细胞外调节物通过怎样的细胞内信号系统调节颗粒细胞的功能尚处于探索之中，是否与癌基因参与的跨膜信号传递有关还有待阐明。但已有研究结果提示，促性腺激素和胰岛素 样生长因子能通过诱导c-fos、c-myc、c-jun等的表达而调控颗粒细胞的分化和甾体激素 分泌功能[5,9，10]。本文研究了ET-1和γ-GABA对颗粒细胞中c-fos、c-myb和 c-erbB-2癌基因表达的影响。结果发现，2×10-7mol/L ET-1和5×10-6mo l/L γ-GABA均使c-fos、c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降；同时 显著抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生，提示ET-1和γ-GABA可通过影响c-fos、c-myb和 c-erbB-2的表达而影响颗粒细胞的内分泌功能。Ca2+不仅是细胞内重要的信使物质 ，近年来发现Ca2+还参与某些癌基因表达的调控。已有报道，Ca2+对诱导大鼠 睾丸支持细胞和脑海马细胞中c-fos的表达是必需的[11,12]。我们也观察到，用 维拉帕米阻断Ca2+内流后，大鼠黄体细胞中c-fos、c-myb和c-erbB-2的表达下降 ，并伴有hCG诱导黄体细胞孕酮生成的抑制[3,4]。但是，Ca2+对颗粒细胞中 c-fos、c-myb和c-erbB-2表达有何影响尚未见报道。本研究发现，用1×10-6mo l/L维拉帕米阻断颗粒细胞中Ca2+的内流后，c-fos、c-myb和c-erbB-2表达阳性 的颗粒细胞百分率无明显改变，表明，Ca2+可能与颗粒细胞中c-fos、c-myb和c- erbB-2的表达无关。还值得注意的是，此时hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生也无明显影响，提 示，Ca2+有可能因对c-fos、c-myb和c-erbB-2的表达无影响从而不影响颗粒细胞 的内分泌功能。
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39660027)
作者简介:郑月慧(1964-),女，江西，教授，硕土，从事生殖内分泌和计 划生育研究。
参考文献
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收稿日期:1998-12-15;修回日期:2000-01-07, http://www.100md.com