胞内连环素在喉癌浸润和转移中的作用
作者：王苹 付仲鹰 刘欣梅 杜宝东 郭晓峰
单位：王苹(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；付仲鹰(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；刘欣梅(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；杜宝东(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；郭晓峰(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，30021)
关键词：
临床耳鼻咽喉科杂志000914 喉癌是头颈部的恶性肿瘤，癌细胞向周围组织的快速浸润和淋巴结转移是影响患者预后的主要原因。有关E-CD(E-cadherin)的基因突变及E-CD蛋白表达与喉癌的相关性已被报道，但研究发现E-CD 表达正常的肿瘤也有高转移的倾向。胞内连环素通过与E-CD结合共同参与细胞间粘附，本文对与E-CD胞内部分相连的α、β连环素在喉癌分化和转移中的作用做初步研究。
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集我院1990～1998年喉癌住院手术患者的石蜡标本52例，病理分级为鳞状细胞癌Ⅰ级8例，Ⅱ级25例，Ⅲ级15例，Ⅳ级4例；TNM分期按UICC制定的标准，Ⅰ期8例，Ⅱ期10例，Ⅲ期24例，Ⅳ期10例。其中病理证实有淋巴结转移者28例，无转移者24例，复发癌2例。声带息肉10例，正常喉粘膜6例为对照组。
1.2 方法
采用免疫组化SABC法，α连环素抗体(兔抗)、β连环素(兔抗)均为Sigma产品，SABC试剂盒为博士德公司产品。操作步骤：石蜡切片常规脱蜡至水，H2O2阻断10 min，枸橼酸缓冲液修复抗原15 min，正常兔血清封闭20 min，滴加一抗(α-catenin或β-catenin)工作液，以PBS代替一抗为阴性对照。37℃ 1～2 h，PBS洗3次，滴加生物素化的羊抗兔IgG，37℃ 30 min，PBS洗，滴加SABC液，37℃ 30 min，DAB显色，苏木精复染。
, 百拇医药
1.3 结果判定及统计学处理
染色后的组织经计算机图像分析系统处理，任选5个视野，分析染色强度，强度单位以灰度值计算，统计学采用t检验。另外随机计数500个细胞，将有25%以上着色细胞的组织判定为表达(+)，少于25%的细胞着色或细胞着色与背景一致定位阴性。χ2检验连环素表达与淋巴结转移的关系。
2 结果
正常喉粘膜、声带息肉和Ⅰ级喉癌组织α、β连环素均呈高水平表达，两者细胞内分布相似，膜与胞浆内侧染色较深。随着肿瘤分化程度的降低，α、β连环素的表达程度下降(见表1)。
α连环素与β连环素在不同分化的喉癌组织中表达不平行。χ2分析β连环素的表达与喉癌转移密切相关(P<0.01)。比较淋巴结转移组和非转移组的α连环素表达，α连环素表达与转移无关(P>0.05)，见表2。将α连环素和β连环素的表达分为阴性或阳性，对淋巴结转移组的原发癌组织进行α、β连环素联合分析，结果见表3。在淋巴结转移组α-cat(+)/β-cat(-)和α-cat(-)/β-cat(-)的频率明显高于α-cat(-)/β-cat(+)和α-cat(+)/β-cat(+)，2例复发癌为α-cat(-)/β-cat(-)。
, 百拇医药
表1 喉癌的组织分化与α、β-连环素表达(灰度值)
±s 组织分型
例数
α-连环素
β-连环素
正常喉粘膜
6
152.4±11.6
153.7±20.5
声带息肉
10
154.7±15.9
, 百拇医药
152.9±23.1
喉癌
Ⅰ级
8
165.6±22.1
169.3±11.01)
Ⅱ级
25
169.6±14.4
178.5±10.51)
Ⅲ级
15
, 百拇医药
179.0±16.62)
189.9±32.21)
Ⅳ级
4
182.0±26.3
195.6±25.61)
与前一组比较，1)P<0.01；与Ⅰ、Ⅱ级比较，2)P<0.01表2 转移组与非转移组的α、β-连环素表达状况 分组
例数
α-连环素表达/例
阴性率/%
, 百拇医药
β-连环素表达/例
阴性率/%
-
+
-
+
转移组
28
12
16
42.86
18
10
, 百拇医药 64.291)
非转移组
24
9
17
37.50
8
16
33.33
与非转移组比较，1)P<0.01表3 α、β连环素表达与喉癌转移例 分型
(α-cat/β-cat)
例数
, 百拇医药
淋巴结转移
非转移
+/-
15
101)
5
-/-
11
81)
3
-/+
8
4
, http://www.100md.com
14
+/+
18
6
12
与-/+、+/+组比较，1)P<0.013 讨论
E-CD是Ca2+依赖型细胞粘附因子，是一个跨膜糖蛋白，主要分布于上皮组织中，是维持上皮完整和极化的关键分子之一。E-CD表达的下降或功能的丧失，可使细胞间粘附丧失，导致癌细胞扩散。在一些癌症中，E-CD的表达与肿瘤细胞的粘附能力有关，然而某些E-CD表达正常的肿瘤细胞却不能形成紧密连接，转移频率较高。最近的研究表明，E-CD的胞内部分与胞浆内连环素α、β或γ结合形成E-CD/cat复合物，共同参与细胞间粘附。复合体中的任何组成成分的表达异常、结构改变都可能破坏复合体与细胞骨架的连接，细胞解离。本文研究发现，正常组织和良性病变α、β连环素均呈强阳性表达，阳性细胞数在90%以上，并且染色较深。喉癌组织中α连环素的表达与细胞分化有关，喉癌Ⅰ和Ⅱ级、Ⅲ和Ⅳ级之间α连环素表达有差别，而组间无差异。β连环素表达与喉癌分级密切相关，并且组间差别明显，与Andrews等(1997)的研究不完全一致。推测在喉肿瘤细胞α、β连环素的表达增强，尤其是β连环素的表达增强，使肿瘤的恶性程度增加，向周围组织浸润的速度增快。对淋巴结转移组和非转移组的分析发现，α连环素表达与转移无明显相关，而β连环素在喉癌的转移中有重要作用，转移组β连环素的阴性率为64.29%。
, http://www.100md.com
对淋巴结转移组28例喉癌组织的α、β连环素横向分析，结果显示，α-cat(+)/β-cat(-)10例为35.71%，α-cat(-)/β-cat(-) 8例为28.57%。这两种类型在转移组的频率高于α-cat(-)/β-cat(+)和α-cat(+)/β-cat(+) 。有研究证明，E-CD功能的正常发挥与α、β或-连环素的调节分不开。在一些肿瘤的体内体外实验中，分别检测α、β或-连环素，结果E-CD/cat系统的任何一种成分异常，均可引起细胞间粘附丧失。细胞内产生的E-CD首先与β或连环素结合，形成复合体，最后与α连环素结合，由α连环素锚定于细胞骨架上，使相邻的细胞形成稳定的连接。我们的实验结果表明，尽管α、β连环素在喉癌的浸润转移过程中与细胞获得运动性有关，但β连环素是细胞粘附的中心调节物。转移组有4例为α-cat(-)/β-cat(+)型，可能是由α连环素本身缺失所引起的转移。有6例为α-cat(+)/β-cat(+)型，占21.43%。原因可能有两方面：一方面可能是E-CD表达异常，据报道含有E-CD突变体的成纤维细胞，由于E-CD缺乏与β连环素的连接位点，细胞间不能形成紧密连接。而且E-CD基因突变已在多种肿瘤中证实。另一方面，癌基因被激活后，细胞内产生的一些细胞因子，引起β连环素的酪氨酸磷酸化，使E-CD不能与之结合，丧失复合体的粘附功能。另外α-cat(-)/β-cat(-)表达形式增加喉癌的复发率，在2例复发癌组织中，α、β连环素均呈阴性表达。
E-CD /cat粘附系统在喉癌的发生、发展中有重要作用。α、β连环素的表达下调或缺失，其结果是使细胞间粘附丧失，生长失去接触抑制，无限制增生，细胞结构松散，易于向周围组织浸润，导致肿瘤转移。但α、β连环素的表达下降以及E-CD的缺失都可以导致细胞失粘附，也可能是两种或两种以上的组成成分均异常的结果。Takatoshi等的研究证实了E-CD与α连环素的共同缺失导致肿瘤恶性度的增加。由于我们的研究中未对E-CD和连环素做平行分析，因此无法得出确切的结论，尚待进一步研究。
(收稿 1999-07-05), 百拇医药
单位：王苹(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；付仲鹰(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；刘欣梅(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；杜宝东(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；郭晓峰(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，30021)
关键词：
临床耳鼻咽喉科杂志000914 喉癌是头颈部的恶性肿瘤，癌细胞向周围组织的快速浸润和淋巴结转移是影响患者预后的主要原因。有关E-CD(E-cadherin)的基因突变及E-CD蛋白表达与喉癌的相关性已被报道，但研究发现E-CD 表达正常的肿瘤也有高转移的倾向。胞内连环素通过与E-CD结合共同参与细胞间粘附，本文对与E-CD胞内部分相连的α、β连环素在喉癌分化和转移中的作用做初步研究。
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集我院1990～1998年喉癌住院手术患者的石蜡标本52例，病理分级为鳞状细胞癌Ⅰ级8例，Ⅱ级25例，Ⅲ级15例，Ⅳ级4例；TNM分期按UICC制定的标准，Ⅰ期8例，Ⅱ期10例，Ⅲ期24例，Ⅳ期10例。其中病理证实有淋巴结转移者28例，无转移者24例，复发癌2例。声带息肉10例，正常喉粘膜6例为对照组。
1.2 方法
采用免疫组化SABC法，α连环素抗体(兔抗)、β连环素(兔抗)均为Sigma产品，SABC试剂盒为博士德公司产品。操作步骤：石蜡切片常规脱蜡至水，H2O2阻断10 min，枸橼酸缓冲液修复抗原15 min，正常兔血清封闭20 min，滴加一抗(α-catenin或β-catenin)工作液，以PBS代替一抗为阴性对照。37℃ 1～2 h，PBS洗3次，滴加生物素化的羊抗兔IgG，37℃ 30 min，PBS洗，滴加SABC液，37℃ 30 min，DAB显色，苏木精复染。
, 百拇医药
1.3 结果判定及统计学处理
染色后的组织经计算机图像分析系统处理，任选5个视野，分析染色强度，强度单位以灰度值计算，统计学采用t检验。另外随机计数500个细胞，将有25%以上着色细胞的组织判定为表达(+)，少于25%的细胞着色或细胞着色与背景一致定位阴性。χ2检验连环素表达与淋巴结转移的关系。
2 结果
正常喉粘膜、声带息肉和Ⅰ级喉癌组织α、β连环素均呈高水平表达，两者细胞内分布相似，膜与胞浆内侧染色较深。随着肿瘤分化程度的降低，α、β连环素的表达程度下降(见表1)。
α连环素与β连环素在不同分化的喉癌组织中表达不平行。χ2分析β连环素的表达与喉癌转移密切相关(P<0.01)。比较淋巴结转移组和非转移组的α连环素表达，α连环素表达与转移无关(P>0.05)，见表2。将α连环素和β连环素的表达分为阴性或阳性，对淋巴结转移组的原发癌组织进行α、β连环素联合分析，结果见表3。在淋巴结转移组α-cat(+)/β-cat(-)和α-cat(-)/β-cat(-)的频率明显高于α-cat(-)/β-cat(+)和α-cat(+)/β-cat(+)，2例复发癌为α-cat(-)/β-cat(-)。
, 百拇医药
表1 喉癌的组织分化与α、β-连环素表达(灰度值)
±s 组织分型例数
α-连环素
β-连环素
正常喉粘膜
6
152.4±11.6
153.7±20.5
声带息肉
10
154.7±15.9
, 百拇医药
152.9±23.1
喉癌
Ⅰ级
8
165.6±22.1
169.3±11.01)
Ⅱ级
25
169.6±14.4
178.5±10.51)
Ⅲ级
15
, 百拇医药
179.0±16.62)
189.9±32.21)
Ⅳ级
4
182.0±26.3
195.6±25.61)
与前一组比较，1)P<0.01；与Ⅰ、Ⅱ级比较，2)P<0.01表2 转移组与非转移组的α、β-连环素表达状况 分组
例数
α-连环素表达/例
阴性率/%
, 百拇医药
β-连环素表达/例
阴性率/%
-
+
-
+
转移组
28
12
16
42.86
18
10
, 百拇医药 64.291)
非转移组
24
9
17
37.50
8
16
33.33
与非转移组比较，1)P<0.01表3 α、β连环素表达与喉癌转移例 分型
(α-cat/β-cat)
例数
, 百拇医药
淋巴结转移
非转移
+/-
15
101)
5
-/-
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14
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18
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12
与-/+、+/+组比较，1)P<0.013 讨论
E-CD是Ca2+依赖型细胞粘附因子，是一个跨膜糖蛋白，主要分布于上皮组织中，是维持上皮完整和极化的关键分子之一。E-CD表达的下降或功能的丧失，可使细胞间粘附丧失，导致癌细胞扩散。在一些癌症中，E-CD的表达与肿瘤细胞的粘附能力有关，然而某些E-CD表达正常的肿瘤细胞却不能形成紧密连接，转移频率较高。最近的研究表明，E-CD的胞内部分与胞浆内连环素α、β或γ结合形成E-CD/cat复合物，共同参与细胞间粘附。复合体中的任何组成成分的表达异常、结构改变都可能破坏复合体与细胞骨架的连接，细胞解离。本文研究发现，正常组织和良性病变α、β连环素均呈强阳性表达，阳性细胞数在90%以上，并且染色较深。喉癌组织中α连环素的表达与细胞分化有关，喉癌Ⅰ和Ⅱ级、Ⅲ和Ⅳ级之间α连环素表达有差别，而组间无差异。β连环素表达与喉癌分级密切相关，并且组间差别明显，与Andrews等(1997)的研究不完全一致。推测在喉肿瘤细胞α、β连环素的表达增强，尤其是β连环素的表达增强，使肿瘤的恶性程度增加，向周围组织浸润的速度增快。对淋巴结转移组和非转移组的分析发现，α连环素表达与转移无明显相关，而β连环素在喉癌的转移中有重要作用，转移组β连环素的阴性率为64.29%。
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对淋巴结转移组28例喉癌组织的α、β连环素横向分析，结果显示，α-cat(+)/β-cat(-)10例为35.71%，α-cat(-)/β-cat(-) 8例为28.57%。这两种类型在转移组的频率高于α-cat(-)/β-cat(+)和α-cat(+)/β-cat(+) 。有研究证明，E-CD功能的正常发挥与α、β或-连环素的调节分不开。在一些肿瘤的体内体外实验中，分别检测α、β或-连环素，结果E-CD/cat系统的任何一种成分异常，均可引起细胞间粘附丧失。细胞内产生的E-CD首先与β或连环素结合，形成复合体，最后与α连环素结合，由α连环素锚定于细胞骨架上，使相邻的细胞形成稳定的连接。我们的实验结果表明，尽管α、β连环素在喉癌的浸润转移过程中与细胞获得运动性有关，但β连环素是细胞粘附的中心调节物。转移组有4例为α-cat(-)/β-cat(+)型，可能是由α连环素本身缺失所引起的转移。有6例为α-cat(+)/β-cat(+)型，占21.43%。原因可能有两方面：一方面可能是E-CD表达异常，据报道含有E-CD突变体的成纤维细胞，由于E-CD缺乏与β连环素的连接位点，细胞间不能形成紧密连接。而且E-CD基因突变已在多种肿瘤中证实。另一方面，癌基因被激活后，细胞内产生的一些细胞因子，引起β连环素的酪氨酸磷酸化，使E-CD不能与之结合，丧失复合体的粘附功能。另外α-cat(-)/β-cat(-)表达形式增加喉癌的复发率，在2例复发癌组织中，α、β连环素均呈阴性表达。
E-CD /cat粘附系统在喉癌的发生、发展中有重要作用。α、β连环素的表达下调或缺失，其结果是使细胞间粘附丧失，生长失去接触抑制，无限制增生，细胞结构松散，易于向周围组织浸润，导致肿瘤转移。但α、β连环素的表达下降以及E-CD的缺失都可以导致细胞失粘附，也可能是两种或两种以上的组成成分均异常的结果。Takatoshi等的研究证实了E-CD与α连环素的共同缺失导致肿瘤恶性度的增加。由于我们的研究中未对E-CD和连环素做平行分析，因此无法得出确切的结论，尚待进一步研究。
(收稿 1999-07-05), 百拇医药