不同pH及封闭氨基端对甘氨酸拮抗内毒素作用的影响
作者：孙 葳 陆大祥 丁 勇 李楚杰
单位：暨南大学医学院病理生理学教研室(广州 510632)
关键词：甘氨酸；内毒素类；氢离子浓度
摘 要 目的和方法 摘 要 目的和方法：用封闭群新西兰家兔56只，分为7组，注射不同pH(4.0，6.0，7.4，10.0)的甘氨酸和内毒素混合液，观察注射后体温变化，由此反映出不同pH对甘氨酸拮抗内毒素致热作用的影响。结果：甘氨酸的拮抗效果在碱性溶液中减弱、酸性溶液中增强，这种变化与pH对甘氨酸NH+3端解离程度的影响是一致的。进一步用氯甲酸苄脂封闭甘氨酸的氨基端，通过鲎试验方法观察到，封闭氨基端后甘氨酸对内毒素的拮抗作用消失。结论：甘氨酸拮抗内毒素的机制可能是通过其带正电荷的NH+3端实现的，NH+3与内毒素脂质A上的PO4结合，干扰了内毒素的正常结构，从而达到拮抗内毒素生物活性的效果。
, 百拇医药
Influence of different pH and sealing of its amino terminal
on the anti-endotoxin effect of glycine
SUN Wei, LU Da-Xiang, DING Yong, LI Chu-Jie
Department of Pathophysiology, Medical College, Jinan University Guangzhou (510632)
Abstract AIM and METHODS: Fifty-six healthy New Zealand rabbits were randomly divided into 7 groups. The body temperature changes of rabbits were observed after intravenous injection of mixed solution of glycine-endotoxin with different pH values (4.0、6.0、7.4、10.0). RESULTS：The effect of glycine on endotoxin was decreased in basic solution and increased in acidic solution, which was in accordance with the effect of pH on the dissociation of glycine amino terminal (NH+3). Furthermore, using TAL test method, it was found that the anti-endotoxin effect of glycine disappeared after sealing of its amino terminal.CONCLUSION:The mechanism of antagonism of glycine against endotoxin may be attributed to its positive amino terminal which may combine with the PO4 group of lipid A of endotoxin and interfere with structural integrity of endotoxin.
, 百拇医药
MeSH Glycine; Endotoxins. Hydrogen, ion concentration
如何防治内毒素(endotoxin, ET)性疾病，清除ET污染，一直是医学科学的重要任务。但迄今尚无一种药物能成为有效的ET拮抗剂而广泛应用于临床实践[1]。本室陆大祥等[2]在对ET拮抗剂的研究过程中发现甘氨酸(glycine, Gly)不仅能拮抗ET的致热活性，还能抑制ET激活单核细胞产生IL-1、TNF等细胞因子。在深入探究Gly拮抗ET机制的实验中，我们还观察到[3]：Gly能够在一定程度上破坏ET的超微结构，从而干扰了ET的活性，降低了ET与单核细胞的结合率。为了进一步研究Gly究竟以何种方式影响ET的正常结构，本实验应用体内及体外实验方法进行了深入研究。
材料与方法
一、不同pH对Gly拮抗ET致热性的影响：
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(一)动物：健康封闭群新西兰家兔(本校动物所提供)56只，体重2.0～3.0kg，雌雄兼有。颗粒饲料单笼喂养，自由饮水。实验前模拟正式实验条件，将动物置发热实验室特别实验架上适应3 d，室温保持在(20±1)℃。
(二)试剂和仪器：精制大肠杆菌ET(E.coli O111:B4):上海生物制品研究所产品，批号940101， 800EU/安瓶；甘氨酸：上海生物制品研究所产品，AP；无热原生理盐水：暨南大学华侨医院制剂室；ST-1型数字温度计：上海医用仪表厂制造。
(三)实验方法：
1.配制不同pH的Gly、ET溶液：将ET(终浓度40EU/mL)和Gly(终浓度15%)共同溶解于NS中，测得溶液pH6.0；将这些溶液分成4份，用0.01mol/L HCl或NaOH分别将pH调整为4.0、6.0(原液)、7.4、10.0的溶液。另外单独用NS配制出ET溶液(浓度4×104EU/L)和Gly溶液(浓度15%)作为对照液。上述溶液均以1mL/kg剂量经耳缘静脉注射。
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2.动物分组及处理条件：56只家兔随机分成7组，每组8只，分批实验，每批各组等数。7个组的注射物分别为：NS、Gly、ET、ET+Gly，pH值分别为10.0、7.4、6.0、4.0。每组注射剂量均为1 mL/kg，注射后记录体温变化。
3.体温测定：各组动物置实验架上，由肛门插入体温计探头，深10cm。待体温稳定后连续测结肠温度3次，每次间隔10min，取均数值作为基础体温。注射完毕记录结肠温度4h，观察其变化，绘制体温反应曲线，计算最大体温高度(ΔT℃)和体温反应指数(TRI4)。实验数据用
±s表示，并用Student t检验判定均数差异显著性。
二、封闭Gly的氨基端对其拮抗ET作用的影响:
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(一)试剂：N-甲酸苄脂甘氨酸(Cbz-Gly)：分子式为：
，其中氨基已被N-甲酸苄脂封闭，AP，美国Sigma公司产品；Gly:上海生物制品研究所产品；鲎试剂(TAL，每支用0.5 mL无热原水稀释)和ET工作标准品(10EU/支)，均为厦门鲎试剂厂产品。
(二)实验方法：Gly、Cbz-Gly、ET均用共同溶剂(20%乙醇)溶解。根据已做过的预实验结果：0.03 mol/L的Gly能明显拮抗2.5×103 EU/L的ET，以此用鲎试验方法进一步观察封闭Gly的氨基后对其拮抗ET作用的影响。
如下操作：
1号管：ET与TAL的反应。
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2号管：ET和Gly(pH6.0)共同作用后，与TAL反应。
3号管：ET和Cbz-Gly共作用后，与TAL反应。
4号管：观察Gly对鲎试验反应有无影响。
5号管：观察Cbz-Gly对鲎试验反应有无影响。
6号管：为阴性对照，检测溶剂(体积分数为20%乙醇)对鲎试验的影响。每管重复20次，(以上各反应物用量均为0.1mL，ET浓度为2.5×103 EU/L，Gly和Cbz-Gly均为0.03mol/L)。
所有试管置37℃恒温水溶中静置60min，取出并在室温放置约5 min后，慢慢倾斜试管至180℃，观察结果[4]。
(三)结果判定：TAL与ET反应时，可观察到粘度和不透明度增加直至形成凝胶。
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阳性(+)：表示形成坚实的固体凝胶或虽在翻转试管时，凝胶从管壁脱落，但仍为一实体。
阴性(-)：表示除阳性外的其它一切情况，如检品无变化，或虽有混浊、粘度增加等现象出现，但仍为液体、能流动者。
结 果
一、不同pH对Gly拮抗ET致热性的影响：
如表1、图1所示，注射不同pH的溶液后，家兔体温升高的幅度从高到低依次为：pH10.0组，pH7.4组、pH6.0组、pH4.0组。这4组间两两比较ΔT和TRI4.0：pH10.0组与pH7.4组相比(P<0.05)，与pH6.0组相比(P<0.01)、与pH4.0组相比(P<0.01)；pH7.4组与pH6.0组相比(P<0.05)、与pH4.0组相比(P<0.01)；pH6.0组与pH4.0相比(P<0.05)，均有显著或非常显著差异。ET组与NS对照组有非常显著差异(P<0.01)，与pH4.0组有非常显著差异(P<0.01)，与pH6.0组及pH7.4组也有显著差异(P<0.05)，但与pH10.0组相比无显著差异(P>0.05)。Gly与NS组相比无显著差异(P>0.05)。
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二、封闭氨基对Gly拮抗ET作用的影响：
结果如表2所示。2.5×103EU/L的ET与TAL反应呈阳性；加入Gly后，出现了明显的对ET拮抗效果，鲎试验反应呈阴性；而Cbz-Gly(即Gly的氨基被封闭之后)对ET的拮抗效果消失，鲎试验反应仍为阳性。Gly和Cbz-Gly均不与TAL反应，体积分数20%乙醇作为阴性对照也未与TAL发生反应。以上结果表明：封闭Gly的氨基之后，其对ET的拮抗作用消失。
表1 不同pH对甘氨酸拮抗内毒素致热性的影响
Tab 1 Colonic temperature response to the iv injection
of ET+Gly with different pH(n=8,±s)
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Group
TRI4
△T(℃)
NS
0.08±0.23
0.10±0.07
Gly
0.04±0.31
0.08±0.18
ET
10.61±2.21
1.23±0.28
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ET+Gly(pH10.0)
10.02±3.08
1.20±0.21
ET+Gly(pH7.4)
7.96±2.76*
0.93±0.29*
ET+Gly(pH6.0)
5.87±1.98*
0.71±0.28*
ET+Gly(pH4.0)
3.55±2.01**
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0.42±0.31*
Fig 1 Mean thermo-response curves (n=8,±s)
图1 各组平均体温反应曲线
讨 论
甘氨酸是中性氨基酸，在溶液中其分子式为NH+3-CH2-COO，氨基端有带正电荷的NH+3，羧基端为带负电的COO，等电点(pI)为5.97；不同pH会影响甘氨酸两端的解离程度，从而改变其净电荷量。在第一部分实验中发现：在本实验剂量条件下，甘氨酸的拮抗效果在碱性溶液中较在中性溶液中减弱；而在酸性溶液中，甘氨酸的拮抗效果较在中性溶液中增强，且酸性越强，效果也越强(pH4.0>6.0)。由此我们设想：甘氨酸的拮抗作用可能是通过其带正电荷的NH+3端实现的，因为，在酸性溶液中，NH+3端解离增强，带正电荷增多，此时其拮抗效果也较强；而在碱性溶液中，NH+3端解离受抑制，带正电荷减少，其拮抗效果也较弱。David等在对内毒素拮抗剂的研究中[5]发现有带正电基团的药物(如PMXB带多个游离氨基[6]，戊双脒带正电的脒基)就是通过其带正电荷的集团与内毒素脂质A上的PO4结合，从而破坏了内毒素的结构而起到拮抗内毒素活性的效果。为验证此设想，在第二部分实验中用氯甲酸苄脂(Cbz)封闭甘氨酸的氨基，形成N-甲酸苄脂甘氨酸(Cbz-Gly)，这样就使带正电荷的氨基端不能游离，也就不能与内毒素上的PO4结合。结果表明：甘氨酸的氨基被封闭之后，其对内毒素的拮抗作用消失。此结果为先前的设想提供了一个有力的证据，即甘氨酸可能是通过其带正电荷的NH+3与内毒素脂质A上带负电荷的PO4结合，从而起到拮抗内毒素的作用。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助(39570308)
参考文献
1 Corriveau CC, Danner RL. Antiendotoxin therapies for septic schock. Infect Agents Dis, 1993, 2(1):44.
2 陆大祥，李楚杰，付咏梅，等.甘氨酸对内毒素致热性的拮抗作用研究.中国病理生理杂志，1996，12(3)：235.
3 孙 葳，陆大祥，丁 勇，等.甘氨酸对内毒素与单核细胞结合率及内毒素构型的影响.中国病理生理杂志，1998，14(4)：219.
4 吴伟洪主编.鲎与鲎试验法论文汇编.第4版.厦门：厦门鲎试剂出版，1997.17～22.
, http://www.100md.com
5 David SA, Bechtel-B, Annaiah C, et al. Inteaction of cationic amphiphilic drugs with lipid A: implications for development of endotoxin antagonists. Biochem Biophys Acta, 1994, 1212(2):167.
6 Marks DH. Effect of polymyxin B on hemoglobin-mediated hepatotoxicity. Milit Med, 1989, 154(4):180.
7 Anderson GW, McGregor AC. Protein and amino acids. J Am Chem Soc, 1957, 79:6180.
收稿日期：1997年8月30日
修稿日期：1998年3月20日, 百拇医药
单位：暨南大学医学院病理生理学教研室(广州 510632)
关键词：甘氨酸；内毒素类；氢离子浓度
摘 要 目的和方法 摘 要 目的和方法：用封闭群新西兰家兔56只，分为7组，注射不同pH(4.0，6.0，7.4，10.0)的甘氨酸和内毒素混合液，观察注射后体温变化，由此反映出不同pH对甘氨酸拮抗内毒素致热作用的影响。结果：甘氨酸的拮抗效果在碱性溶液中减弱、酸性溶液中增强，这种变化与pH对甘氨酸NH+3端解离程度的影响是一致的。进一步用氯甲酸苄脂封闭甘氨酸的氨基端，通过鲎试验方法观察到，封闭氨基端后甘氨酸对内毒素的拮抗作用消失。结论：甘氨酸拮抗内毒素的机制可能是通过其带正电荷的NH+3端实现的，NH+3与内毒素脂质A上的PO4结合，干扰了内毒素的正常结构，从而达到拮抗内毒素生物活性的效果。
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Influence of different pH and sealing of its amino terminal
on the anti-endotoxin effect of glycine
SUN Wei, LU Da-Xiang, DING Yong, LI Chu-Jie
Department of Pathophysiology, Medical College, Jinan University Guangzhou (510632)
Abstract AIM and METHODS: Fifty-six healthy New Zealand rabbits were randomly divided into 7 groups. The body temperature changes of rabbits were observed after intravenous injection of mixed solution of glycine-endotoxin with different pH values (4.0、6.0、7.4、10.0). RESULTS：The effect of glycine on endotoxin was decreased in basic solution and increased in acidic solution, which was in accordance with the effect of pH on the dissociation of glycine amino terminal (NH+3). Furthermore, using TAL test method, it was found that the anti-endotoxin effect of glycine disappeared after sealing of its amino terminal.CONCLUSION:The mechanism of antagonism of glycine against endotoxin may be attributed to its positive amino terminal which may combine with the PO4 group of lipid A of endotoxin and interfere with structural integrity of endotoxin.
, 百拇医药
MeSH Glycine; Endotoxins. Hydrogen, ion concentration
如何防治内毒素(endotoxin, ET)性疾病，清除ET污染，一直是医学科学的重要任务。但迄今尚无一种药物能成为有效的ET拮抗剂而广泛应用于临床实践[1]。本室陆大祥等[2]在对ET拮抗剂的研究过程中发现甘氨酸(glycine, Gly)不仅能拮抗ET的致热活性，还能抑制ET激活单核细胞产生IL-1、TNF等细胞因子。在深入探究Gly拮抗ET机制的实验中，我们还观察到[3]：Gly能够在一定程度上破坏ET的超微结构，从而干扰了ET的活性，降低了ET与单核细胞的结合率。为了进一步研究Gly究竟以何种方式影响ET的正常结构，本实验应用体内及体外实验方法进行了深入研究。
材料与方法
一、不同pH对Gly拮抗ET致热性的影响：
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(一)动物：健康封闭群新西兰家兔(本校动物所提供)56只，体重2.0～3.0kg，雌雄兼有。颗粒饲料单笼喂养，自由饮水。实验前模拟正式实验条件，将动物置发热实验室特别实验架上适应3 d，室温保持在(20±1)℃。
(二)试剂和仪器：精制大肠杆菌ET(E.coli O111:B4):上海生物制品研究所产品，批号940101， 800EU/安瓶；甘氨酸：上海生物制品研究所产品，AP；无热原生理盐水：暨南大学华侨医院制剂室；ST-1型数字温度计：上海医用仪表厂制造。
(三)实验方法：
1.配制不同pH的Gly、ET溶液：将ET(终浓度40EU/mL)和Gly(终浓度15%)共同溶解于NS中，测得溶液pH6.0；将这些溶液分成4份，用0.01mol/L HCl或NaOH分别将pH调整为4.0、6.0(原液)、7.4、10.0的溶液。另外单独用NS配制出ET溶液(浓度4×104EU/L)和Gly溶液(浓度15%)作为对照液。上述溶液均以1mL/kg剂量经耳缘静脉注射。
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2.动物分组及处理条件：56只家兔随机分成7组，每组8只，分批实验，每批各组等数。7个组的注射物分别为：NS、Gly、ET、ET+Gly，pH值分别为10.0、7.4、6.0、4.0。每组注射剂量均为1 mL/kg，注射后记录体温变化。
3.体温测定：各组动物置实验架上，由肛门插入体温计探头，深10cm。待体温稳定后连续测结肠温度3次，每次间隔10min，取均数值作为基础体温。注射完毕记录结肠温度4h，观察其变化，绘制体温反应曲线，计算最大体温高度(ΔT℃)和体温反应指数(TRI4)。实验数据用
±s表示，并用Student t检验判定均数差异显著性。二、封闭Gly的氨基端对其拮抗ET作用的影响:
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(一)试剂：N-甲酸苄脂甘氨酸(Cbz-Gly)：分子式为：
，其中氨基已被N-甲酸苄脂封闭，AP，美国Sigma公司产品；Gly:上海生物制品研究所产品；鲎试剂(TAL，每支用0.5 mL无热原水稀释)和ET工作标准品(10EU/支)，均为厦门鲎试剂厂产品。(二)实验方法：Gly、Cbz-Gly、ET均用共同溶剂(20%乙醇)溶解。根据已做过的预实验结果：0.03 mol/L的Gly能明显拮抗2.5×103 EU/L的ET，以此用鲎试验方法进一步观察封闭Gly的氨基后对其拮抗ET作用的影响。
如下操作：
1号管：ET与TAL的反应。
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2号管：ET和Gly(pH6.0)共同作用后，与TAL反应。
3号管：ET和Cbz-Gly共作用后，与TAL反应。
4号管：观察Gly对鲎试验反应有无影响。
5号管：观察Cbz-Gly对鲎试验反应有无影响。
6号管：为阴性对照，检测溶剂(体积分数为20%乙醇)对鲎试验的影响。每管重复20次，(以上各反应物用量均为0.1mL，ET浓度为2.5×103 EU/L，Gly和Cbz-Gly均为0.03mol/L)。
所有试管置37℃恒温水溶中静置60min，取出并在室温放置约5 min后，慢慢倾斜试管至180℃，观察结果[4]。
(三)结果判定：TAL与ET反应时，可观察到粘度和不透明度增加直至形成凝胶。
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阳性(+)：表示形成坚实的固体凝胶或虽在翻转试管时，凝胶从管壁脱落，但仍为一实体。
阴性(-)：表示除阳性外的其它一切情况，如检品无变化，或虽有混浊、粘度增加等现象出现，但仍为液体、能流动者。
结 果
一、不同pH对Gly拮抗ET致热性的影响：
如表1、图1所示，注射不同pH的溶液后，家兔体温升高的幅度从高到低依次为：pH10.0组，pH7.4组、pH6.0组、pH4.0组。这4组间两两比较ΔT和TRI4.0：pH10.0组与pH7.4组相比(P<0.05)，与pH6.0组相比(P<0.01)、与pH4.0组相比(P<0.01)；pH7.4组与pH6.0组相比(P<0.05)、与pH4.0组相比(P<0.01)；pH6.0组与pH4.0相比(P<0.05)，均有显著或非常显著差异。ET组与NS对照组有非常显著差异(P<0.01)，与pH4.0组有非常显著差异(P<0.01)，与pH6.0组及pH7.4组也有显著差异(P<0.05)，但与pH10.0组相比无显著差异(P>0.05)。Gly与NS组相比无显著差异(P>0.05)。
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二、封闭氨基对Gly拮抗ET作用的影响：
结果如表2所示。2.5×103EU/L的ET与TAL反应呈阳性；加入Gly后，出现了明显的对ET拮抗效果，鲎试验反应呈阴性；而Cbz-Gly(即Gly的氨基被封闭之后)对ET的拮抗效果消失，鲎试验反应仍为阳性。Gly和Cbz-Gly均不与TAL反应，体积分数20%乙醇作为阴性对照也未与TAL发生反应。以上结果表明：封闭Gly的氨基之后，其对ET的拮抗作用消失。
表1 不同pH对甘氨酸拮抗内毒素致热性的影响
Tab 1 Colonic temperature response to the iv injection
of ET+Gly with different pH(n=8,
±s), http://www.100md.com
Group
TRI4
△T(℃)
NS
0.08±0.23
0.10±0.07
Gly
0.04±0.31
0.08±0.18
ET
10.61±2.21
1.23±0.28
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ET+Gly(pH10.0)
10.02±3.08
1.20±0.21
ET+Gly(pH7.4)
7.96±2.76*
0.93±0.29*
ET+Gly(pH6.0)
5.87±1.98*
0.71±0.28*
ET+Gly(pH4.0)
3.55±2.01**
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0.42±0.31*
Fig 1 Mean thermo-response curves (n=8,
±s)图1 各组平均体温反应曲线
讨 论
甘氨酸是中性氨基酸，在溶液中其分子式为NH+3-CH2-COO，氨基端有带正电荷的NH+3，羧基端为带负电的COO，等电点(pI)为5.97；不同pH会影响甘氨酸两端的解离程度，从而改变其净电荷量。在第一部分实验中发现：在本实验剂量条件下，甘氨酸的拮抗效果在碱性溶液中较在中性溶液中减弱；而在酸性溶液中，甘氨酸的拮抗效果较在中性溶液中增强，且酸性越强，效果也越强(pH4.0>6.0)。由此我们设想：甘氨酸的拮抗作用可能是通过其带正电荷的NH+3端实现的，因为，在酸性溶液中，NH+3端解离增强，带正电荷增多，此时其拮抗效果也较强；而在碱性溶液中，NH+3端解离受抑制，带正电荷减少，其拮抗效果也较弱。David等在对内毒素拮抗剂的研究中[5]发现有带正电基团的药物(如PMXB带多个游离氨基[6]，戊双脒带正电的脒基)就是通过其带正电荷的集团与内毒素脂质A上的PO4结合，从而破坏了内毒素的结构而起到拮抗内毒素活性的效果。为验证此设想，在第二部分实验中用氯甲酸苄脂(Cbz)封闭甘氨酸的氨基，形成N-甲酸苄脂甘氨酸(Cbz-Gly)，这样就使带正电荷的氨基端不能游离，也就不能与内毒素上的PO4结合。结果表明：甘氨酸的氨基被封闭之后，其对内毒素的拮抗作用消失。此结果为先前的设想提供了一个有力的证据，即甘氨酸可能是通过其带正电荷的NH+3与内毒素脂质A上带负电荷的PO4结合，从而起到拮抗内毒素的作用。
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*国家自然科学基金资助(39570308)
参考文献
1 Corriveau CC, Danner RL. Antiendotoxin therapies for septic schock. Infect Agents Dis, 1993, 2(1):44.
2 陆大祥，李楚杰，付咏梅，等.甘氨酸对内毒素致热性的拮抗作用研究.中国病理生理杂志，1996，12(3)：235.
3 孙 葳，陆大祥，丁 勇，等.甘氨酸对内毒素与单核细胞结合率及内毒素构型的影响.中国病理生理杂志，1998，14(4)：219.
4 吴伟洪主编.鲎与鲎试验法论文汇编.第4版.厦门：厦门鲎试剂出版，1997.17～22.
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5 David SA, Bechtel-B, Annaiah C, et al. Inteaction of cationic amphiphilic drugs with lipid A: implications for development of endotoxin antagonists. Biochem Biophys Acta, 1994, 1212(2):167.
6 Marks DH. Effect of polymyxin B on hemoglobin-mediated hepatotoxicity. Milit Med, 1989, 154(4):180.
7 Anderson GW, McGregor AC. Protein and amino acids. J Am Chem Soc, 1957, 79:6180.
收稿日期：1997年8月30日
修稿日期：1998年3月20日, 百拇医药