HPLC法测定头孢噻肟钠的含量
作者：朱会琴 明金兰▲
单位：明金兰 朱会琴(宁夏药品检验所 银川 750004)
关键词：
药物分析杂志000423 头孢噻肟钠(CTX-Na)为第三代半合成头孢类抗生素，临床上广泛用于治疗革兰氏阴性菌引起的各种感染性疾病。国内有关HPLC法测定CTX-Na含量的文献[1，2]均采用磷酸盐缓冲液作为流动相的水相，柱压高(1.725×107～2.185×107 P a)，有的磷酸盐 缓冲液pH高(7.41～7.80)，长时间使用对柱子的寿命、柱效影响大。本文建立的HPLC外标法 ，以醋酸盐缓冲液(pH为5.0)-甲醇-乙腈(84∶16∶10)为流动相，柱压低(6.76×106～9. 8×106Pa)，并且有较好的分离效果，峰形对称，在4.9～99 μg·mL-1范围内，线性关系良好，灵敏度高。
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1 仪器、药品及试剂
D-2500型色谱数据处理器；L-6200A智能泵；L-4200H紫外可见分光光度计。
注射用CTX-Na(批号：971105，980102，980501，980302)均为市售；CTX-Na标准品、乙酰 苯胺(批号：9403)均为中国药品生物制品检定所提供；乙腈、甲醇均为色谱纯；其余试剂均为 分析纯。
2 色谱条件
色谱柱：YWG-C18(10 μm,250 mm×4.6mm)；流动相：乙腈-甲醇-醋酸盐缓冲液(称 取无水醋酸钠1.23 g，加水溶解并稀释至1 000mL，用冰醋酸调pH为5.0)(10∶16∶84)； 流 速：0.8 mL·min-1；检测波长：254nm;AUFS：0.05；定量进样环20 μL；室温。
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3 方法与结果
3.1 线性实验 精密称取CTX-Na标准品用水溶解，制成约0.5 mg·mL-1的溶液，精密量取此溶液0.1，0.5，1，1.5，2.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，在本文的色谱条件下进行测定，色谱图见图1-A，以头孢噻肟(CTX)的浓度和相应峰面积进行回归，得回归方程为：
A=4.61×104C+6.77×105 r=0.9996
结果表明，CTX在4.9～99 μg·mL-1范围内线性关系良好。用逐步稀释法测得CTX的检测限为2.4 ng(S/N=2)。
, 百拇医药 图1 CTX-Na标准品(A)与样品(B)色谱图
1.CTX(6.02min) 2，3.未知物质
3.2 稳定性实验 在本实验条件下，样品溶液室温放置8 h，CTX的含量 基本不变。
3.3 加样回收实验 精密称取注射用CTX-Na约25 mg，精密加入CTX-Na 标准品约25mg，置100 mL量瓶中，用水溶解，稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液5 mL，照样品测定项下操作，计算回收率，平均回收率为99.5%，RSD为1.2%(n=5)。
3.4 重现性实验 同一批样品平行测定5份，平均含量为98.8%，RSD为0.59%。
3.5 样品测定 精密称取CTX-Na标准品和注射用CTX-Na各50 mg，分别 置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液5 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得标准品溶液和样品溶液。分别取上述2种溶液进样，以外标法计算样品的含量，结果971105，980102，980501，980302批样品中CTX-Na含量(标示量%)分别为101.3%，99.4%，98.8%，98.9%，n=5。样品的色谱图 见图1-B。
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4 讨论
4.1 流动相pH对色谱分离的影响 分别配制pH为3.0，4.1，5.1，6.2，7.0的流动相，考察不同pH的流动相对色谱分离的影响。结果表明，流动相pH在3.0～7.0的范围内，pH增大，CTX的保留时间缩短，CTX与杂质峰2的分离度下降。CTX与杂质峰3的分离度在pH 5.1时最大，在pH 7.0时最小。CTX属弱酸弱碱两性化合物，故pH在一定范围内增加时，溶液中-COO-离子增多，极性增加，易被洗脱。pH对CTX与相邻杂质峰2、峰3 的分离度影响不大。考虑到CTX的保留时间为6.02 min，在pH 4.5～6.5时最稳定，故将流动相的pH定在5.0±0.1。
4.2 流动相中醋酸钠浓度对色谱分离的影响 试验了0，0.01 1，0.015，0.021 mol·L-1的醋酸钠溶液配制的流动相，结果表明，醋酸钠浓度增加，CTX与杂质峰峰2、3的分离度增大，CTX的保留时间延长，峰形稍拖尾。为了达到好的分离度，同时得到对称的峰形，故流动相中醋酸钠的浓度选用0.015 mol·L-1。
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4.3 流动相中乙腈浓度对色谱分离的影响 试验了乙腈浓度为 0%，5%，9%，15%的流动相，结果表明，乙腈浓度增大，CTX的保留时间明显缩短，样品峰与杂质峰的分离度也在逐渐减小，柱压由乙腈浓度为0%时的1.382×106 Pa降至乙腈浓度为15%时的7 .742×105Pa。兼顾色谱有效分离与分析速度的提高，流动相的乙腈浓度采用9%较为合 适。
4.4 流动相中甲醇浓度对色谱分离的影响 试验了甲醇浓度为 0%，10%，15%，27%的流动相，结果表明，甲醇浓度增加，CTX的保留时间变化不大，CTX与相邻杂质峰的分离度增大，但甲醇浓度增至一定值后，CTX与相邻杂质峰分离度下降。为了保持较好的分离度，甲醇浓度选为15%。
4.5 色谱系统的专属性 在本实验流动相系统下，参照USPⅩⅩⅢ[3]CTX-Na含量测定项下的分离度溶液的制备方法，制备去乙酰CTX、CTX溶液，同时加入适量的乙酰苯胺溶液，取混合溶液进样，去乙酰CTX、CTX、乙酰苯胺的保留时间分别为3.70，6.04，10.24 min。由此可见，CTX中可能存在的杂质去乙酰CTX对CTX的定量无影响，且可以乙酰苯胺为内标，测定CTX-Na的含量。由于外标法简单，又应用了定量进样环，故本文采用外标法。
参考文献
1.中国药典1995年版1998年增补本.114
2.金少鸿，王小玲.高效液相色谱法分离测定氨噻肟头孢菌素.抗生素，1986， 11(1)：20
3.USP.ⅩⅩⅢ.299
(本文于1999年5月24日收到), 百拇医药
单位：明金兰 朱会琴(宁夏药品检验所 银川 750004)
关键词：
药物分析杂志000423 头孢噻肟钠(CTX-Na)为第三代半合成头孢类抗生素，临床上广泛用于治疗革兰氏阴性菌引起的各种感染性疾病。国内有关HPLC法测定CTX-Na含量的文献[1，2]均采用磷酸盐缓冲液作为流动相的水相，柱压高(1.725×107～2.185×107 P a)，有的磷酸盐 缓冲液pH高(7.41～7.80)，长时间使用对柱子的寿命、柱效影响大。本文建立的HPLC外标法 ，以醋酸盐缓冲液(pH为5.0)-甲醇-乙腈(84∶16∶10)为流动相，柱压低(6.76×106～9. 8×106Pa)，并且有较好的分离效果，峰形对称，在4.9～99 μg·mL-1范围内，线性关系良好，灵敏度高。
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1 仪器、药品及试剂
D-2500型色谱数据处理器；L-6200A智能泵；L-4200H紫外可见分光光度计。
注射用CTX-Na(批号：971105，980102，980501，980302)均为市售；CTX-Na标准品、乙酰 苯胺(批号：9403)均为中国药品生物制品检定所提供；乙腈、甲醇均为色谱纯；其余试剂均为 分析纯。
2 色谱条件
色谱柱：YWG-C18(10 μm,250 mm×4.6mm)；流动相：乙腈-甲醇-醋酸盐缓冲液(称 取无水醋酸钠1.23 g，加水溶解并稀释至1 000mL，用冰醋酸调pH为5.0)(10∶16∶84)； 流 速：0.8 mL·min-1；检测波长：254nm;AUFS：0.05；定量进样环20 μL；室温。
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3 方法与结果
3.1 线性实验 精密称取CTX-Na标准品用水溶解，制成约0.5 mg·mL-1的溶液，精密量取此溶液0.1，0.5，1，1.5，2.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，在本文的色谱条件下进行测定，色谱图见图1-A，以头孢噻肟(CTX)的浓度和相应峰面积进行回归，得回归方程为：
A=4.61×104C+6.77×105 r=0.9996
结果表明，CTX在4.9～99 μg·mL-1范围内线性关系良好。用逐步稀释法测得CTX的检测限为2.4 ng(S/N=2)。
, 百拇医药 图1 CTX-Na标准品(A)与样品(B)色谱图
1.CTX(6.02min) 2，3.未知物质
3.2 稳定性实验 在本实验条件下，样品溶液室温放置8 h，CTX的含量 基本不变。
3.3 加样回收实验 精密称取注射用CTX-Na约25 mg，精密加入CTX-Na 标准品约25mg，置100 mL量瓶中，用水溶解，稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液5 mL，照样品测定项下操作，计算回收率，平均回收率为99.5%，RSD为1.2%(n=5)。
3.4 重现性实验 同一批样品平行测定5份，平均含量为98.8%，RSD为0.59%。
3.5 样品测定 精密称取CTX-Na标准品和注射用CTX-Na各50 mg，分别 置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液5 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得标准品溶液和样品溶液。分别取上述2种溶液进样，以外标法计算样品的含量，结果971105，980102，980501，980302批样品中CTX-Na含量(标示量%)分别为101.3%，99.4%，98.8%，98.9%，n=5。样品的色谱图 见图1-B。
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4 讨论
4.1 流动相pH对色谱分离的影响 分别配制pH为3.0，4.1，5.1，6.2，7.0的流动相，考察不同pH的流动相对色谱分离的影响。结果表明，流动相pH在3.0～7.0的范围内，pH增大，CTX的保留时间缩短，CTX与杂质峰2的分离度下降。CTX与杂质峰3的分离度在pH 5.1时最大，在pH 7.0时最小。CTX属弱酸弱碱两性化合物，故pH在一定范围内增加时，溶液中-COO-离子增多，极性增加，易被洗脱。pH对CTX与相邻杂质峰2、峰3 的分离度影响不大。考虑到CTX的保留时间为6.02 min，在pH 4.5～6.5时最稳定，故将流动相的pH定在5.0±0.1。
4.2 流动相中醋酸钠浓度对色谱分离的影响 试验了0，0.01 1，0.015，0.021 mol·L-1的醋酸钠溶液配制的流动相，结果表明，醋酸钠浓度增加，CTX与杂质峰峰2、3的分离度增大，CTX的保留时间延长，峰形稍拖尾。为了达到好的分离度，同时得到对称的峰形，故流动相中醋酸钠的浓度选用0.015 mol·L-1。
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4.3 流动相中乙腈浓度对色谱分离的影响 试验了乙腈浓度为 0%，5%，9%，15%的流动相，结果表明，乙腈浓度增大，CTX的保留时间明显缩短，样品峰与杂质峰的分离度也在逐渐减小，柱压由乙腈浓度为0%时的1.382×106 Pa降至乙腈浓度为15%时的7 .742×105Pa。兼顾色谱有效分离与分析速度的提高，流动相的乙腈浓度采用9%较为合 适。
4.4 流动相中甲醇浓度对色谱分离的影响 试验了甲醇浓度为 0%，10%，15%，27%的流动相，结果表明，甲醇浓度增加，CTX的保留时间变化不大，CTX与相邻杂质峰的分离度增大，但甲醇浓度增至一定值后，CTX与相邻杂质峰分离度下降。为了保持较好的分离度，甲醇浓度选为15%。
4.5 色谱系统的专属性 在本实验流动相系统下，参照USPⅩⅩⅢ[3]CTX-Na含量测定项下的分离度溶液的制备方法，制备去乙酰CTX、CTX溶液，同时加入适量的乙酰苯胺溶液，取混合溶液进样，去乙酰CTX、CTX、乙酰苯胺的保留时间分别为3.70，6.04，10.24 min。由此可见，CTX中可能存在的杂质去乙酰CTX对CTX的定量无影响，且可以乙酰苯胺为内标，测定CTX-Na的含量。由于外标法简单，又应用了定量进样环，故本文采用外标法。
参考文献
1.中国药典1995年版1998年增补本.114
2.金少鸿，王小玲.高效液相色谱法分离测定氨噻肟头孢菌素.抗生素，1986， 11(1)：20
3.USP.ⅩⅩⅢ.299
(本文于1999年5月24日收到), 百拇医药