北豆根总碱对环磷酰胺模型小鼠的免疫调节作用
作者：徐静华 于庆海 魏韶华 蔡 爽
单位：徐静华 于庆海 沈阳药科大学中药系，沈阳 110015；魏韶华 沈阳志鹰制药厂，沈阳 110015；蔡 爽 中国医科大学附属第一临床医院药剂科，沈阳 110001
关键词：北豆根总碱；环磷酰胺；免疫；DNA
沈阳药科大学学报990105 摘 要 从非特异性免疫功能及特异性免疫功能方面研究了北豆根总碱对环磷酰胺所致的免疫功能低下模型小鼠的免疫调节作用.实验结果表明，北豆根总碱25 mg/kg、50 mg/kg 腹腔注射能显著增强模型小鼠单核巨噬细胞吞噬功能、迟发型超敏反应及增加其外周血淋巴细胞ANAE阳性百分率；北豆根总碱25 mg/kg 腹腔注射能显著提高模型鼠血清溶血素生成能力.初步机理研究表明，北豆根总碱50 mg/kg 腹腔注射能显著拮抗环磷酰胺对小鼠胸腺DNA含量的抑制作用，提示北豆根总碱可能通过促进DNA合成而达到增强免疫功能的作用.
, http://www.100md.com
分类号 R96
Immunomodulatory Effects of Total Alkaloid of Menispermum on Cyclophosphamide Model Mice
Xu Jinghua,Yu Qinghai,Wei Shaohua,Cai Shuang
Department of Traditional Chinese Medicines,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract In the present paper,the immunomodulatory effects of total alkaloid of Menispermum(TAM)on cyclophosphamide model mice were studied from the nonspecific,specific immune functions.Furthermore,the mechanism of TAM on immunomodulation was investigated.The experimental results showed that TAM ip. 25 mg/kg or 50 mg/kg significantly strengthened phagocytosing function of the monocyte-macrophage system,delayed type hypersensitivity(DTH) reaction and ANAE(+) cell percentage of peripheral blood lymphocytes in mice treated by cyclophosphamide.TAM ip. 25 mg/kg notably increased the development of serum hemolysin in model mice.Furthermore,TAM ip. 50mg/kg remarkably enhanced the DNA content of thymus in cyclophosphamide-treated mice.It was suggested that the immunomodulatory mechanism of TAM was associated with its promotion of the synthesis of DNA.
, 百拇医药
Key words total alkaloid of Menispermum;cyclophosphamide;immunity;DNA
北豆根系防己科植物蝙蝠葛(menispermum dauricum DC.)的干燥根茎，味苦、性寒，有清热解毒、消肿止痛等功效〔1〕，其中所含有效成分为生物碱.北豆根总碱(以下简称总碱)即是从蝙蝠葛的根茎中提取出的总生物碱，主要含有蝙蝠葛碱(menisperine)、粉防己碱(tetrandrine)、山豆根碱(daurincine)等十多种生物碱.目前，对总碱的免疫药理学研究报道尚少.近几年来，我们开展了总碱抗变态反应作用的研究，用多种体内、体外实验方法较深入地探讨了总碱对抗Ⅰ～Ⅳ型变态反应的作用机理〔2〕.本研究就是在已取得的实验结果基础上探讨总碱对环磷酰胺致免疫功能低下模型小鼠的免疫调节作用.
1 药品与动物
, 百拇医药
北豆根总碱(简称总碱)鞍山第一制药厂，经苯精制提纯后总碱含量达89.4%.实验时用0.1 mol/L稀盐酸配成溶液，调节pH为6.8～7.0，再用生理盐水稀释成不同浓度的溶液备用.环磷酰胺，950727，沈阳药科大学制药厂；2，4-二硝基氯苯(DNCB)，850112，天津市化学试剂一厂；α-醋酸萘酯，880601，上海试剂一厂；脱氧核糖核酸，931201，上海长阳制药厂.
昆明种小白鼠，体重19～21g，雌雄兼用，由沈阳药科大学实验动物中心提供.
2 方法与结果
2.1 对单核巨噬细胞吞噬功能的影响
昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分组.总碱按25 mg/kg、50 mg/kg腹腔注射给药，每天1次，连续7天.给药第三天、第五天除生理盐水组外，其它各组小鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg.末次给药1 h后，每鼠尾静脉注射1∶5稀释的印度墨汁0.1 ml/20 g体重，按文献方法〔3〕测定各组小鼠对炭粒的吞噬指数K及吞噬系数α.结果见表1.结果表明，环磷酰胺模型小鼠炭粒廓清能力与生理盐水组相比显著降低，K值及α值均显著减少；总碱25 mg/kg、50 mg/kg均能显著增强环磷酰胺致免疫功能低下小鼠炭粒廓清能力，K值及α值均显著提高.
, 百拇医药
表1 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的抑制作用/
±s 组别
剂量/mg.kg-1
动物数/n
K值
α值
生理盐水组
——
10
0.036±
0.005
, http://www.100md.com 5.64±
0.68
环磷酰胺模型组
20
10
0.023±
0.004△△△
4.86±
0.68△
总碱+环磷酰胺组
25+20
10
, http://www.100md.com
0.041±
0.005
5.97±
0.93
总碱+环磷酰胺组
50+20
10
0.044±
0.005
6.41±
0.55
, 百拇医药
与生理盐水组相比 △P<0.05，△△△P<0.001； 与环磷酰胺模型组相比 P<0.01，P<0.001
2.2 对DNCB诱导的迟发型超敏反应的影响
昆明种小鼠48只，雌雄各半，随机分组.总碱给药同“2.1”项.给药当天将50 μL 1%的DNCB丙酮溶液涂于各组小鼠腹部去毛部位致敏.致敏当天及第二天除生理盐水组外，其它各组小鼠腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg.末次给药1 h后，按文献方法〔4〕测定各组小鼠耳肿胀度.耳肿胀度表示迟发型超敏反应的强度.结果见表2.结果表明，环磷酰胺模型小鼠耳肿胀度与生理盐水组相比显著降低(P<0.05)；总碱25 mg/kg、50 mg/kg能显著增加环磷酰胺致免疫功能低下小鼠耳肿胀度.表2 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠迟发型超敏反应的抑制作用/±s 组别
, http://www.100md.com
剂量/mg.kg-1
动物数/n
耳肿胀度/mg
生理盐水组
——
12
2.45±1.91
环磷酰胺模型组
40
12
0.92±0.51△
总碱+环磷酰胺组
, http://www.100md.com
25+40
12
1.86±1.06
总碱+环磷酰胺组
50+40
12
2.44±1.25
与生理盐水组相比 △P<0.05； 与环磷酰胺模型组相比 P<0.05，P<0.01
2.3 对外周血淋巴细胞酸性α-醋酸萘酯酯酶染色率的影响
昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分组.总碱给药同“2.1”项.除生理盐水组小鼠外，其它各组小鼠于给药第三天、第五天腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg.末次给药1 h后采尾末梢血涂片，空气干燥60 min，将干燥后的涂片浸入孵育液中室温浸染120 min[孵育液临用前配制：取1/15 mol/L pH7.6的磷酸缓冲液89 mL，加入染色缸中，缓缓加入六代偶氮副品红溶液6 mL，充分混匀后再慢慢滴入2% α-醋酸萘酯溶液2.5 mL，充分混匀后，调pH至6.2]，取出用流动水充分冲洗玻片上的沉淀物，用1%孔雀绿复染5 min，流动水冲洗染色液，空气干燥，油镜下计数100个淋巴细胞，按下列标准计算α-醋酸萘酯酯酶(ANAE)阳性淋巴细胞百分数(即T淋巴细胞百分数)：T淋巴细胞胞浆中呈现大小不同、数量不等的黑红色颗粒(一般约3～5个)，B淋巴细胞胞浆中无黑红色颗粒.结果见表3.结果表明，环磷酰胺模型组小鼠外周血ANAE阳性细胞百分率与生理盐水组相比显著降低(P<0.001)，总碱两个剂量均能显著提高环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的外周血ANAE阳性细胞百分率.表3 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠T淋巴细胞染色率的抑制作用/±s 组别
, 百拇医药
剂量/mg.kg-1
动物数/n
ANAE阳性百分率
生理盐水组
——
10
66.4±2.9
环磷酰胺模型组
40
10
46.1±3.5△△△
总碱+环磷酰胺组
, 百拇医药
25+40
10
50.9±1.8
总碱+环磷酰胺组
50+40
10
57.2±3.4
与生理盐水组相比，△△△P<0.001； 与环磷酰胺模型组相比，P<0.01，P<0.001
2.4 对血清溶血素含量的影响
昆明种小鼠39只，雌雄兼用，随机分组.总碱给药同“2.1”项.实验第三天将绵羊红细胞用生理盐水洗涤，洗涤后以3∶5(V∶V)用生理盐水稀释，每鼠腹腔注射绵羊红细胞悬液0.2 mL致敏.致敏当天，除生理盐水组外，其它各组小鼠腹腔注射环磷酰胺20 mg/kg.免疫4天后，按文献方法〔5〕测定各组小鼠血清溶血素半数溶血值HC50.结果见表4.结果表明，环磷酰胺模型组小鼠HC50值与生理盐水组相比显著降低(P<0.001)，总碱25 mg/kg能显著增加环磷酰胺致免疫功能低下小鼠HC50值(P<0.01).表4 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠血清溶血素生成的抑制作用/±s 组别
, 百拇医药
剂量/mg.kg-1
动物数/n
HC50
生理盐水组
——
10
48.40±14.30
环磷酰胺模型组
20
9
12.75±9.21△△△
, http://www.100md.com 总碱+环磷酰胺组
25+20
11
29.06±12.29
总碱+环磷酰胺组
50+20
9
14.12±8.07
与生理盐水组相比，△△△P<0.001； 与环磷酰胺模型组相比，P<0.01
2.5 对胸腺DNA含量的影响(二苯胺法)
昆明种小鼠43只，雌雄兼用，随机分组.总碱给药同“2.1”项.除生理盐水组小鼠外，其它各组小鼠于给药第三天、第五天腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg.末次给药1 h后制备核酸提取液：剖取胸腺，准确称重后置于盛有5 mL无水乙醇的小瓶中，3 h后弃无水乙醇，胸腺自然干燥后放入盛有5 mL无水乙醚的小瓶中，3 h后弃无水乙醚.干燥后的胸腺用2% HClO4溶液5 mL制成匀浆，置4℃冰箱中，20 min后3 000 r/min离心，重复一次，合并两次上清液，即为核酸提取液.测定DNA含量时，取核酸提取液0.5 mL，加蒸馏水1.5 mL，二苯胺液4 mL，混匀，置60℃水浴中温育1 h，冷却后于600 nm波长处测定吸光度值，从标准曲线上查出测定液中的DNA量(μg).然后按下列公式计算小鼠胸腺DNA含量(%)[DNA(%)=测定液中DNA量(μg)×提取液总量(mL)/胸腺重(g)×106×测定所用提取液量(mL)×100%].结果见表5.结果表明，环磷酰胺模型小鼠胸腺DNA含量与生理盐水组相比显著降低(P<0.001)，总碱50 mg/kg能显著增加环磷酰胺致免疫功能低下小鼠胸腺DNA含量(P<0.05).表5 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠胸腺DNA含量的抑制作用/±s 组别
, 百拇医药
剂量/mg.kg-1
动物数/n
DNA含量
生理盐水组
——
11
3.12±0.34
环磷酰胺模型组
40
10
1.72±0.35△△△
总碱+环磷酰胺组
, 百拇医药
25+40
11
1.94±0.17
总碱+环磷酰胺组
50+40
11
2.29±0.65
与生理盐水组相比， △△△P<0.001； 与环磷酰胺模型组相比，P<0.05
3 讨论
有学者认为〔6〕，中药的作用有其病理性和整体性等特点，机体的自稳态(内环境恒定)未被破坏之前，其储备能力极强，除非是药性极偏的大热、大寒、大毒的中药，一般药性不太偏的药物对健康人或正常动物的影响不很显著，因此研究中药对免疫系统的影响，应以病态模型进行研究.
, 百拇医药
在中药免疫药理学研究中，较常用的动物模型是用环磷酰胺造成免疫功能低下状态.
由于环磷酰胺对免疫细胞抑制程度不同，因此实验中所用环磷酰胺剂量也不同.从本文的实验结果来看，总碱两个剂量能显著拮抗环磷酰胺对小鼠炭粒廓清能力、迟发型超敏反应及 小鼠外周血T淋巴细胞ANAE染色率的抑制作用；总碱25 mg/kg能显著拮抗环磷酰胺对小鼠血清溶血素水平的抑制作用，而50 mg/kg对其影响不显著，分析其可能原因有二：其一，有文献报道〔7〕环磷酰胺对B淋巴细胞的抑制作用比对T淋巴细胞强；其二，总碱对细胞免疫的作用强而对体液免疫的作用弱.环磷酰胺作为最强的烷化剂类免疫抑制剂，它进入体内后在肝脏微粒体酶与细胞色素P450作用下，氧化裂环变成具有强大活性的中间代谢物，进而通过与DNA两链的交叉联结来破坏DNA，从而杀伤淋巴细胞产生免疫抑制效应〔7〕.那么总碱是否通过促进DNA合成而达到增强免疫功能呢?
为此，本文采用二苯胺显色法考察了总碱对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠胸腺DNA含量的影响.胸腺是生物体的一个重要免疫中枢，是T淋巴细胞分化与成熟的核心组织，同时又是产生多种免疫因子的基地；胸腺上皮细胞产生与释放胸腺肽，对前体T淋巴细胞分化为成熟免疫活性T细胞具有重要作用.因此，测定胸腺组织中DNA含量的变化不仅能直接反映胸腺细胞的结构和功能状态，而且对研究药物的免疫调节作用机制也有重要的意义.本文实验结果表明，环磷酰胺能显著地抑制胸腺组织中DNA合成，减少DNA含量，而总碱50 mg/kg能显著拮抗环磷酰胺的此种抑制作用.这就为总碱免疫调节作用的可能机制提供了药理学实验依据.有关其作用 的确切机制尚有待于实验的进一步进行.
, 百拇医药
参考文献
[1] 石淑琴，耿成国，罗远武等.北豆根总碱制剂中生物碱含量测定方法的研究.中成药，1991，13(1)：11～12
[2] 徐涛，于庆海.北豆根总碱的抗变态反应作用.中药药理与临床，1996，12(4)：27～29
[3] 陈奇等.中药药理研究方法学.北京：人民卫生出版社，1993.757～759
[4] Corsini AC.A simple method of evaluating delayed type hypersensitivity in mice.J Immunol Methods，1979，30：195～197
[5] 徐学瑛.一个改进的体液免疫测定方法——溶血素测定法.药学学报，1979，14(7)：443～445
[6] 沈自尹.中医药对免疫功能影响的综述与评析.中国中西医结合杂志，1992，12(7)：443～446
[7] 竺心影.药理学.第3版.北京：人民卫生出版社，1993.412～413
收稿日期:1998-06-26, http://www.100md.com
单位：徐静华 于庆海 沈阳药科大学中药系，沈阳 110015；魏韶华 沈阳志鹰制药厂，沈阳 110015；蔡 爽 中国医科大学附属第一临床医院药剂科，沈阳 110001
关键词：北豆根总碱；环磷酰胺；免疫；DNA
沈阳药科大学学报990105 摘 要 从非特异性免疫功能及特异性免疫功能方面研究了北豆根总碱对环磷酰胺所致的免疫功能低下模型小鼠的免疫调节作用.实验结果表明，北豆根总碱25 mg/kg、50 mg/kg 腹腔注射能显著增强模型小鼠单核巨噬细胞吞噬功能、迟发型超敏反应及增加其外周血淋巴细胞ANAE阳性百分率；北豆根总碱25 mg/kg 腹腔注射能显著提高模型鼠血清溶血素生成能力.初步机理研究表明，北豆根总碱50 mg/kg 腹腔注射能显著拮抗环磷酰胺对小鼠胸腺DNA含量的抑制作用，提示北豆根总碱可能通过促进DNA合成而达到增强免疫功能的作用.
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分类号 R96
Immunomodulatory Effects of Total Alkaloid of Menispermum on Cyclophosphamide Model Mice
Xu Jinghua,Yu Qinghai,Wei Shaohua,Cai Shuang
Department of Traditional Chinese Medicines,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract In the present paper,the immunomodulatory effects of total alkaloid of Menispermum(TAM)on cyclophosphamide model mice were studied from the nonspecific,specific immune functions.Furthermore,the mechanism of TAM on immunomodulation was investigated.The experimental results showed that TAM ip. 25 mg/kg or 50 mg/kg significantly strengthened phagocytosing function of the monocyte-macrophage system,delayed type hypersensitivity(DTH) reaction and ANAE(+) cell percentage of peripheral blood lymphocytes in mice treated by cyclophosphamide.TAM ip. 25 mg/kg notably increased the development of serum hemolysin in model mice.Furthermore,TAM ip. 50mg/kg remarkably enhanced the DNA content of thymus in cyclophosphamide-treated mice.It was suggested that the immunomodulatory mechanism of TAM was associated with its promotion of the synthesis of DNA.
, 百拇医药
Key words total alkaloid of Menispermum;cyclophosphamide;immunity;DNA
北豆根系防己科植物蝙蝠葛(menispermum dauricum DC.)的干燥根茎，味苦、性寒，有清热解毒、消肿止痛等功效〔1〕，其中所含有效成分为生物碱.北豆根总碱(以下简称总碱)即是从蝙蝠葛的根茎中提取出的总生物碱，主要含有蝙蝠葛碱(menisperine)、粉防己碱(tetrandrine)、山豆根碱(daurincine)等十多种生物碱.目前，对总碱的免疫药理学研究报道尚少.近几年来，我们开展了总碱抗变态反应作用的研究，用多种体内、体外实验方法较深入地探讨了总碱对抗Ⅰ～Ⅳ型变态反应的作用机理〔2〕.本研究就是在已取得的实验结果基础上探讨总碱对环磷酰胺致免疫功能低下模型小鼠的免疫调节作用.
1 药品与动物
, 百拇医药
北豆根总碱(简称总碱)鞍山第一制药厂，经苯精制提纯后总碱含量达89.4%.实验时用0.1 mol/L稀盐酸配成溶液，调节pH为6.8～7.0，再用生理盐水稀释成不同浓度的溶液备用.环磷酰胺，950727，沈阳药科大学制药厂；2，4-二硝基氯苯(DNCB)，850112，天津市化学试剂一厂；α-醋酸萘酯，880601，上海试剂一厂；脱氧核糖核酸，931201，上海长阳制药厂.
昆明种小白鼠，体重19～21g，雌雄兼用，由沈阳药科大学实验动物中心提供.
2 方法与结果
2.1 对单核巨噬细胞吞噬功能的影响
昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分组.总碱按25 mg/kg、50 mg/kg腹腔注射给药，每天1次，连续7天.给药第三天、第五天除生理盐水组外，其它各组小鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg.末次给药1 h后，每鼠尾静脉注射1∶5稀释的印度墨汁0.1 ml/20 g体重，按文献方法〔3〕测定各组小鼠对炭粒的吞噬指数K及吞噬系数α.结果见表1.结果表明，环磷酰胺模型小鼠炭粒廓清能力与生理盐水组相比显著降低，K值及α值均显著减少；总碱25 mg/kg、50 mg/kg均能显著增强环磷酰胺致免疫功能低下小鼠炭粒廓清能力，K值及α值均显著提高.
, 百拇医药
表1 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的抑制作用/
±s 组别剂量/mg.kg-1
动物数/n
K值
α值
生理盐水组
——
10
0.036±
0.005
, http://www.100md.com 5.64±
0.68
环磷酰胺模型组
20
10
0.023±
0.004△△△
4.86±
0.68△
总碱+环磷酰胺组
25+20
10
, http://www.100md.com
0.041±
0.005
5.97±
0.93
总碱+环磷酰胺组
50+20
10
0.044±
0.005
6.41±
0.55
, 百拇医药
与生理盐水组相比 △P<0.05，△△△P<0.001； 与环磷酰胺模型组相比 P<0.01，P<0.001
2.2 对DNCB诱导的迟发型超敏反应的影响
昆明种小鼠48只，雌雄各半，随机分组.总碱给药同“2.1”项.给药当天将50 μL 1%的DNCB丙酮溶液涂于各组小鼠腹部去毛部位致敏.致敏当天及第二天除生理盐水组外，其它各组小鼠腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg.末次给药1 h后，按文献方法〔4〕测定各组小鼠耳肿胀度.耳肿胀度表示迟发型超敏反应的强度.结果见表2.结果表明，环磷酰胺模型小鼠耳肿胀度与生理盐水组相比显著降低(P<0.05)；总碱25 mg/kg、50 mg/kg能显著增加环磷酰胺致免疫功能低下小鼠耳肿胀度.表2 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠迟发型超敏反应的抑制作用/
±s 组别, http://www.100md.com
剂量/mg.kg-1
动物数/n
耳肿胀度/mg
生理盐水组
——
12
2.45±1.91
环磷酰胺模型组
40
12
0.92±0.51△
总碱+环磷酰胺组
, http://www.100md.com
25+40
12
1.86±1.06
总碱+环磷酰胺组
50+40
12
2.44±1.25
与生理盐水组相比 △P<0.05； 与环磷酰胺模型组相比 P<0.05，P<0.01
2.3 对外周血淋巴细胞酸性α-醋酸萘酯酯酶染色率的影响
昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分组.总碱给药同“2.1”项.除生理盐水组小鼠外，其它各组小鼠于给药第三天、第五天腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg.末次给药1 h后采尾末梢血涂片，空气干燥60 min，将干燥后的涂片浸入孵育液中室温浸染120 min[孵育液临用前配制：取1/15 mol/L pH7.6的磷酸缓冲液89 mL，加入染色缸中，缓缓加入六代偶氮副品红溶液6 mL，充分混匀后再慢慢滴入2% α-醋酸萘酯溶液2.5 mL，充分混匀后，调pH至6.2]，取出用流动水充分冲洗玻片上的沉淀物，用1%孔雀绿复染5 min，流动水冲洗染色液，空气干燥，油镜下计数100个淋巴细胞，按下列标准计算α-醋酸萘酯酯酶(ANAE)阳性淋巴细胞百分数(即T淋巴细胞百分数)：T淋巴细胞胞浆中呈现大小不同、数量不等的黑红色颗粒(一般约3～5个)，B淋巴细胞胞浆中无黑红色颗粒.结果见表3.结果表明，环磷酰胺模型组小鼠外周血ANAE阳性细胞百分率与生理盐水组相比显著降低(P<0.001)，总碱两个剂量均能显著提高环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的外周血ANAE阳性细胞百分率.表3 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠T淋巴细胞染色率的抑制作用/
±s 组别, 百拇医药
剂量/mg.kg-1
动物数/n
ANAE阳性百分率
生理盐水组
——
10
66.4±2.9
环磷酰胺模型组
40
10
46.1±3.5△△△
总碱+环磷酰胺组
, 百拇医药
25+40
10
50.9±1.8
总碱+环磷酰胺组
50+40
10
57.2±3.4
与生理盐水组相比，△△△P<0.001； 与环磷酰胺模型组相比，P<0.01，P<0.001
2.4 对血清溶血素含量的影响
昆明种小鼠39只，雌雄兼用，随机分组.总碱给药同“2.1”项.实验第三天将绵羊红细胞用生理盐水洗涤，洗涤后以3∶5(V∶V)用生理盐水稀释，每鼠腹腔注射绵羊红细胞悬液0.2 mL致敏.致敏当天，除生理盐水组外，其它各组小鼠腹腔注射环磷酰胺20 mg/kg.免疫4天后，按文献方法〔5〕测定各组小鼠血清溶血素半数溶血值HC50.结果见表4.结果表明，环磷酰胺模型组小鼠HC50值与生理盐水组相比显著降低(P<0.001)，总碱25 mg/kg能显著增加环磷酰胺致免疫功能低下小鼠HC50值(P<0.01).表4 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠血清溶血素生成的抑制作用/
±s 组别, 百拇医药
剂量/mg.kg-1
动物数/n
HC50
生理盐水组
——
10
48.40±14.30
环磷酰胺模型组
20
9
12.75±9.21△△△
, http://www.100md.com 总碱+环磷酰胺组
25+20
11
29.06±12.29
总碱+环磷酰胺组
50+20
9
14.12±8.07
与生理盐水组相比，△△△P<0.001； 与环磷酰胺模型组相比，P<0.01
2.5 对胸腺DNA含量的影响(二苯胺法)
昆明种小鼠43只，雌雄兼用，随机分组.总碱给药同“2.1”项.除生理盐水组小鼠外，其它各组小鼠于给药第三天、第五天腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg.末次给药1 h后制备核酸提取液：剖取胸腺，准确称重后置于盛有5 mL无水乙醇的小瓶中，3 h后弃无水乙醇，胸腺自然干燥后放入盛有5 mL无水乙醚的小瓶中，3 h后弃无水乙醚.干燥后的胸腺用2% HClO4溶液5 mL制成匀浆，置4℃冰箱中，20 min后3 000 r/min离心，重复一次，合并两次上清液，即为核酸提取液.测定DNA含量时，取核酸提取液0.5 mL，加蒸馏水1.5 mL，二苯胺液4 mL，混匀，置60℃水浴中温育1 h，冷却后于600 nm波长处测定吸光度值，从标准曲线上查出测定液中的DNA量(μg).然后按下列公式计算小鼠胸腺DNA含量(%)[DNA(%)=测定液中DNA量(μg)×提取液总量(mL)/胸腺重(g)×106×测定所用提取液量(mL)×100%].结果见表5.结果表明，环磷酰胺模型小鼠胸腺DNA含量与生理盐水组相比显著降低(P<0.001)，总碱50 mg/kg能显著增加环磷酰胺致免疫功能低下小鼠胸腺DNA含量(P<0.05).表5 总碱拮抗环磷酰胺对小鼠胸腺DNA含量的抑制作用/
±s 组别, 百拇医药
剂量/mg.kg-1
动物数/n
DNA含量
生理盐水组
——
11
3.12±0.34
环磷酰胺模型组
40
10
1.72±0.35△△△
总碱+环磷酰胺组
, 百拇医药
25+40
11
1.94±0.17
总碱+环磷酰胺组
50+40
11
2.29±0.65
与生理盐水组相比， △△△P<0.001； 与环磷酰胺模型组相比，P<0.05
3 讨论
有学者认为〔6〕，中药的作用有其病理性和整体性等特点，机体的自稳态(内环境恒定)未被破坏之前，其储备能力极强，除非是药性极偏的大热、大寒、大毒的中药，一般药性不太偏的药物对健康人或正常动物的影响不很显著，因此研究中药对免疫系统的影响，应以病态模型进行研究.
, 百拇医药
在中药免疫药理学研究中，较常用的动物模型是用环磷酰胺造成免疫功能低下状态.
由于环磷酰胺对免疫细胞抑制程度不同，因此实验中所用环磷酰胺剂量也不同.从本文的实验结果来看，总碱两个剂量能显著拮抗环磷酰胺对小鼠炭粒廓清能力、迟发型超敏反应及 小鼠外周血T淋巴细胞ANAE染色率的抑制作用；总碱25 mg/kg能显著拮抗环磷酰胺对小鼠血清溶血素水平的抑制作用，而50 mg/kg对其影响不显著，分析其可能原因有二：其一，有文献报道〔7〕环磷酰胺对B淋巴细胞的抑制作用比对T淋巴细胞强；其二，总碱对细胞免疫的作用强而对体液免疫的作用弱.环磷酰胺作为最强的烷化剂类免疫抑制剂，它进入体内后在肝脏微粒体酶与细胞色素P450作用下，氧化裂环变成具有强大活性的中间代谢物，进而通过与DNA两链的交叉联结来破坏DNA，从而杀伤淋巴细胞产生免疫抑制效应〔7〕.那么总碱是否通过促进DNA合成而达到增强免疫功能呢?
为此，本文采用二苯胺显色法考察了总碱对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠胸腺DNA含量的影响.胸腺是生物体的一个重要免疫中枢，是T淋巴细胞分化与成熟的核心组织，同时又是产生多种免疫因子的基地；胸腺上皮细胞产生与释放胸腺肽，对前体T淋巴细胞分化为成熟免疫活性T细胞具有重要作用.因此，测定胸腺组织中DNA含量的变化不仅能直接反映胸腺细胞的结构和功能状态，而且对研究药物的免疫调节作用机制也有重要的意义.本文实验结果表明，环磷酰胺能显著地抑制胸腺组织中DNA合成，减少DNA含量，而总碱50 mg/kg能显著拮抗环磷酰胺的此种抑制作用.这就为总碱免疫调节作用的可能机制提供了药理学实验依据.有关其作用 的确切机制尚有待于实验的进一步进行.
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参考文献
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收稿日期:1998-06-26, http://www.100md.com