不同来源的抗乙肝免疫核糖核酸对慢性乙型肝炎患者的免疫调节作用
作者：余永胜 陈有华
单位：皖南医学院弋矶山医院传染科,芜湖 241001
关键词：乙型肝炎乙肝保护抗体免疫核糖核酸淋巴细胞增殖反应
中国临床药理学与治疗学000306
目的 探讨HBV感染后乙肝保护抗体抗-HBs产生机体外周淋巴细胞iRNA(h-iRNA)对慢性乙型肝炎的免疫调节作用，并与目前单用HBsAg免疫动物来源的抗乙肝iRNA(a-iRNA)相比较。方法 利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察h-iRNA对慢性乙肝患者外周淋巴细胞HBV抗原特异增殖反应的影响。结果 在HBsAg刺激组中，h-iRNA、a-iRNA对慢性乙肝患者外周HBsAg特异淋巴细胞增殖反应皆有一定程度的增强作用；但HBcAg刺激组中，h-iRNA对慢性乙肝患者HBcAg特异淋巴细胞增殖反应具有增强作用，与a-iRNA相比，差异有显著性意义。结论 HBV感染后保护抗体产生机体外周淋巴细胞iRNA具有增强慢性乙型肝炎患者淋巴细胞对HBV抗原的特异增殖反应，对主要靶抗原HBcAg特异淋巴细胞增殖反应的增强作用，有利于清除肝内HBV。目前单用HBsAg免疫动物的抗乙肝iRNA，不具有对HBV其它抗原的免疫信息，尤其是不能对免疫细胞识别肝细胞内HBV的主要靶抗原HBcAg产生有效免疫作用，可能是影响其疗效的重要原因。
, 百拇医药
中图分类号 R512.62
Immune modulation of anti-HBV iRNA from different sources in patients with chronic hepatitis B
YU Yong-Sheng CHEN You-Hua
(Yijishan Hospital, Wannan Medical College,Wuhu 241001)
Aim To explore the function of immune modulation of anti-HBV iRNA in patients with chronic hepatitis B(CHB) Methods Peripheral blood lymphocyte iRNA was prepared from anti-HBs positive human body with HBV complete clearance after HBV infection(h-iRNA). The effect of h-iRNA on HBV specific lymphocyte proliferative response of peripheral lymphocyte from patients with CHB was observed by using MTT method and was compared with that by HBV specific iRNA from animal immunized only by HBsAg(a-iRNA).Results Both h-iRNA and a-iRNA increased the level of peripheral lymphocyte proliferative response to HBsAg in patients with CHB to some degree. In group of HBcAg, only h-iRNA showed its enhancement of HBcAg specific lymphocyte proliferative response.Conclusions h-iRNA can increase HBV specific lymphocyte proliferative response in patients with CHB and the function of increasing HBcAg specific lymphocyte proliterative response contributes to HBV clearance.
, 百拇医药
Key words hepatitis B； HBV protective antibody； iRNA； lymphocyte proliferative response
HBV感染后，部分感染者HBV被清除，抗-HBs产生，提示机体对HBV有特异性免疫力。作者试图将这部分HBV感染后痊愈机体的外周淋巴细胞输注给HBV慢性感染者，以期对HBV产生有效免疫能力。由于特异性细胞免疫存在HLA限制，难以产生有效的细胞免疫作用。利用此类机体外周淋巴细胞制备免疫核糖核酸(h-iRNA)，观察其对HBV慢性感染者外周血淋巴细胞增殖反应的影响，并比较此类iRNA与目前使用的单用HBsAg免疫动物来源的抗乙肝免疫核糖核酸(a-iRNA)的免疫调节作用。
1材料与方法
1.1h-iRNA制备选择HBV感染后，HBV清除，抗HBs产生，HBV血清学指标及HBV-DNA阴性，肝功能正常，未曾注射乙肝疫苗，近期无其它病原感染，并排除免疫有关疾病患者。留取抗凝血，分离外周淋巴细胞。iRNA提取采用碱缓冲液饱和酚
, 百拇医药
法，参照HBsAg免疫动物制备抗乙肝iRNA过程。
1.2临床资料根据1995年第5次全国传染病寄生虫学术会议病毒性肝炎分类标准诊断为慢性乙型肝炎患者32例，年龄21～45岁，男26例，女6例，HBV血清学指标HBsAg、HBeAg或抗HBe、抗HBc阳性，其中慢性轻度7例，慢性中度16例，慢性重度9例，并排除其他病毒混合感染。
1.3HBV抗原肽选择HBV抗原包括HBsAg、Pre-s、HBcAg等。由于目前使用的动物源性抗乙肝iRNA(a-iRNA)为单用HBsAg免疫后制备，HBcAg为免疫清除肝内HBV的主要靶抗原，故选用基因工程HBsAg；HBcAg为HBV抗原肽，两者可刺激淋巴细胞HBV抗原特异增殖反应。
1.4iRNA对HBV感染者外周淋巴细胞HBV特异性增殖反应的影响采用MTT法。将分离的慢性乙型肝炎患者外周淋巴细胞调整浓度为25×105/ml，加入96孔板，每孔100μl，平行3孔，分别加入HBsAg10μg,对照组加等体积培养液，37℃，5%CO2温育72h，加四甲基偶氮唑盐10μl，37℃，6h，加盐酸异丙醇100μl，混匀，静置15min，测各孔A570值。重复以上过程，分别加入以下各组HBsAg与a-iRNA；HBsAg与h-iRNA；HBcAg与a-iRNA；HBcAg与h-iRNA，其中抗原肽均10μg，iRNA为100μg。增殖指数=实验组A值/对照组A值。
, http://www.100md.com
2结果
分别利用HBsAg、HBcAg刺激慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞，可引起不同程度的增殖反应，反应水平均较低，部分患者于刺激前后无明显变化，平均增殖指数见表1。
混入不同来源的抗乙肝有关iRNA，HBV抗原刺激淋巴细胞增殖反应程度变化不同，即同一HBV抗原刺激，a-iRNA、h-iRNA对慢性乙型肝炎患者外周淋巴细胞增殖反应的影响存在差异。在HBsAg刺激组中，加入a-iRNA后较单用HBsAg刺激，淋巴细胞增殖反应增强(P<0.05)，加入h_iRNA后较单用HBsAg刺激组亦增强(P<0.05)，但a_iRNA、h_iRNA两组之间差异无显著性(P>0.05)；在HBcAg刺激组中，加入a-iRNA后淋巴细胞增殖反应无明显改变(P>0.05),h-iRNA刺激后，HBcAg特异淋巴细胞增殖反应较单用HBcAg及加入a-iRNA相比，差异均有显著性(P<0.05)，结果见表1。
, 百拇医药 表1不同来源抗乙肝iRNA对慢性乙型肝炎外周淋巴细胞特异性增殖反应的影响(
±s,n=32) 组别
增殖指数
HBsAg
1.22±0.06
HBsAg+aiRNA
1.67±0.09*
HBsAg+h-IRNA
1.71±0.12*
HBsAg
1.26±1.11
, 百拇医药
HBsAg+aiRNA
1.29±0.20
HBsAg+h-IRNA
1.85±0.41△
与HBsAg组比较*P<0.05;与HBcAg组比较△P<0.05
3讨论
HBV感染后慢性化问题已成为治疗乙型肝炎的难题。机体对HBV特异免疫能力的低下是其重要原因，机体缺乏对HBV有效免疫是乙型肝炎患者慢性化的基础[1,2]。由于目前尚无特效抗乙肝病毒药物，因此如何寻找提高机体对乙肝病毒特异、有效的免疫调节方法成为清除HBV、治愈慢性乙肝的关键。临床中观察到，HBV感染后，虽有部分转化为慢性持续感染者，但部分感染者无明显症状，检查时呈现抗HBs阳性(未曾注射乙肝疫苗)，或者表现为急性发病过程，HBV被清除，抗HBs产生，表明这一类机体对HBV的免疫为有效免疫，是对HBV完整颗粒包括对靶抗原HBcAg产生的有效免疫。由于特异细胞免疫受HLA限制，淋巴细胞不能直接产生有效的过继免疫，免疫核糖核酸(iRNA)具有转移细胞免疫功能的能力。利用此类机体外周血淋巴细胞制备iRNA，研究其对HBV慢性感染者的免疫调节作用，结果表明此类iRNA具有增强HBV抗原特异增殖反应，特别是对免疫细胞识别肝细胞内HBV的主要靶抗原HBcAg特异淋巴细胞增殖反应的增强作用，有利于肝内HBV的清除。有资料表明，HBV感染者对HBV的免疫特别是对主要靶抗原HBcAg细胞免疫功能低下是HBV慢性感染的关键因素之一[3]。单用HBsAg免疫动物制备的抗乙肝HBcAg特异淋巴细胞增殖反应无调节作用。表明目前临床使用的iRNA来源于单一使用HBsAg免疫的动物，并非对HBV完整颗粒产生免疫作用，即其具有的免疫信息仅针对HBsAg，对HBV其它抗原特别是核心抗原(HBcAg)不具备有免疫作用，而机体细胞免疫清除肝组织HBV时，被免疫细胞识别的主要目标是HBcAg，即免疫细胞识别HBV的靶抗原是HBcAg，而不是HBsAg。因此，目前使用的抗乙肝iRNA虽然一定程度提高乙型肝炎患者对HBV的免疫力，但对肝内HBV不能产生有效作用，从根本上起不到有效的抗病毒效果。
, 百拇医药
本课题为安徽省重点科研项目(№99022016)
余永胜，男，34岁，主治医师，硕士，主要从事感染性疾病临床研究。
参考文献
1，Ferrari C, Penna A, Bertoletti A, et al. Cellular immune response to hepatitis B virus infection . J Immunol ， 1990;145:3442
2，Hecke EV, Paradijs T, Molitor C, et al. Hepatitis B virus specific cytoxic T lymphocyte response in patients with acute and chronic hepatitis B virus infections. J Hepatol ， 1994;20:514
3，Lohr H, Weber W, Schlaak J, et al. Proliferative response of CD4 T cells and hepatitis B virus clear-ance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants. Hepatology， 1995；22:11
2000-02-16收稿，2000-03-03修回, 百拇医药
单位：皖南医学院弋矶山医院传染科,芜湖 241001
关键词：乙型肝炎乙肝保护抗体免疫核糖核酸淋巴细胞增殖反应
中国临床药理学与治疗学000306
目的 探讨HBV感染后乙肝保护抗体抗-HBs产生机体外周淋巴细胞iRNA(h-iRNA)对慢性乙型肝炎的免疫调节作用，并与目前单用HBsAg免疫动物来源的抗乙肝iRNA(a-iRNA)相比较。方法 利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察h-iRNA对慢性乙肝患者外周淋巴细胞HBV抗原特异增殖反应的影响。结果 在HBsAg刺激组中，h-iRNA、a-iRNA对慢性乙肝患者外周HBsAg特异淋巴细胞增殖反应皆有一定程度的增强作用；但HBcAg刺激组中，h-iRNA对慢性乙肝患者HBcAg特异淋巴细胞增殖反应具有增强作用，与a-iRNA相比，差异有显著性意义。结论 HBV感染后保护抗体产生机体外周淋巴细胞iRNA具有增强慢性乙型肝炎患者淋巴细胞对HBV抗原的特异增殖反应，对主要靶抗原HBcAg特异淋巴细胞增殖反应的增强作用，有利于清除肝内HBV。目前单用HBsAg免疫动物的抗乙肝iRNA，不具有对HBV其它抗原的免疫信息，尤其是不能对免疫细胞识别肝细胞内HBV的主要靶抗原HBcAg产生有效免疫作用，可能是影响其疗效的重要原因。
, 百拇医药
中图分类号 R512.62
Immune modulation of anti-HBV iRNA from different sources in patients with chronic hepatitis B
YU Yong-Sheng CHEN You-Hua
(Yijishan Hospital, Wannan Medical College,Wuhu 241001)
Aim To explore the function of immune modulation of anti-HBV iRNA in patients with chronic hepatitis B(CHB) Methods Peripheral blood lymphocyte iRNA was prepared from anti-HBs positive human body with HBV complete clearance after HBV infection(h-iRNA). The effect of h-iRNA on HBV specific lymphocyte proliferative response of peripheral lymphocyte from patients with CHB was observed by using MTT method and was compared with that by HBV specific iRNA from animal immunized only by HBsAg(a-iRNA).Results Both h-iRNA and a-iRNA increased the level of peripheral lymphocyte proliferative response to HBsAg in patients with CHB to some degree. In group of HBcAg, only h-iRNA showed its enhancement of HBcAg specific lymphocyte proliferative response.Conclusions h-iRNA can increase HBV specific lymphocyte proliferative response in patients with CHB and the function of increasing HBcAg specific lymphocyte proliterative response contributes to HBV clearance.
, 百拇医药
Key words hepatitis B； HBV protective antibody； iRNA； lymphocyte proliferative response
HBV感染后，部分感染者HBV被清除，抗-HBs产生，提示机体对HBV有特异性免疫力。作者试图将这部分HBV感染后痊愈机体的外周淋巴细胞输注给HBV慢性感染者，以期对HBV产生有效免疫能力。由于特异性细胞免疫存在HLA限制，难以产生有效的细胞免疫作用。利用此类机体外周淋巴细胞制备免疫核糖核酸(h-iRNA)，观察其对HBV慢性感染者外周血淋巴细胞增殖反应的影响，并比较此类iRNA与目前使用的单用HBsAg免疫动物来源的抗乙肝免疫核糖核酸(a-iRNA)的免疫调节作用。
1材料与方法
1.1h-iRNA制备选择HBV感染后，HBV清除，抗HBs产生，HBV血清学指标及HBV-DNA阴性，肝功能正常，未曾注射乙肝疫苗，近期无其它病原感染，并排除免疫有关疾病患者。留取抗凝血，分离外周淋巴细胞。iRNA提取采用碱缓冲液饱和酚
, 百拇医药
法，参照HBsAg免疫动物制备抗乙肝iRNA过程。
1.2临床资料根据1995年第5次全国传染病寄生虫学术会议病毒性肝炎分类标准诊断为慢性乙型肝炎患者32例，年龄21～45岁，男26例，女6例，HBV血清学指标HBsAg、HBeAg或抗HBe、抗HBc阳性，其中慢性轻度7例，慢性中度16例，慢性重度9例，并排除其他病毒混合感染。
1.3HBV抗原肽选择HBV抗原包括HBsAg、Pre-s、HBcAg等。由于目前使用的动物源性抗乙肝iRNA(a-iRNA)为单用HBsAg免疫后制备，HBcAg为免疫清除肝内HBV的主要靶抗原，故选用基因工程HBsAg；HBcAg为HBV抗原肽，两者可刺激淋巴细胞HBV抗原特异增殖反应。
1.4iRNA对HBV感染者外周淋巴细胞HBV特异性增殖反应的影响采用MTT法。将分离的慢性乙型肝炎患者外周淋巴细胞调整浓度为25×105/ml，加入96孔板，每孔100μl，平行3孔，分别加入HBsAg10μg,对照组加等体积培养液，37℃，5%CO2温育72h，加四甲基偶氮唑盐10μl，37℃，6h，加盐酸异丙醇100μl，混匀，静置15min，测各孔A570值。重复以上过程，分别加入以下各组HBsAg与a-iRNA；HBsAg与h-iRNA；HBcAg与a-iRNA；HBcAg与h-iRNA，其中抗原肽均10μg，iRNA为100μg。增殖指数=实验组A值/对照组A值。
, http://www.100md.com
2结果
分别利用HBsAg、HBcAg刺激慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞，可引起不同程度的增殖反应，反应水平均较低，部分患者于刺激前后无明显变化，平均增殖指数见表1。
混入不同来源的抗乙肝有关iRNA，HBV抗原刺激淋巴细胞增殖反应程度变化不同，即同一HBV抗原刺激，a-iRNA、h-iRNA对慢性乙型肝炎患者外周淋巴细胞增殖反应的影响存在差异。在HBsAg刺激组中，加入a-iRNA后较单用HBsAg刺激，淋巴细胞增殖反应增强(P<0.05)，加入h_iRNA后较单用HBsAg刺激组亦增强(P<0.05)，但a_iRNA、h_iRNA两组之间差异无显著性(P>0.05)；在HBcAg刺激组中，加入a-iRNA后淋巴细胞增殖反应无明显改变(P>0.05),h-iRNA刺激后，HBcAg特异淋巴细胞增殖反应较单用HBcAg及加入a-iRNA相比，差异均有显著性(P<0.05)，结果见表1。
, 百拇医药 表1不同来源抗乙肝iRNA对慢性乙型肝炎外周淋巴细胞特异性增殖反应的影响(
±s,n=32) 组别增殖指数
HBsAg
1.22±0.06
HBsAg+aiRNA
1.67±0.09*
HBsAg+h-IRNA
1.71±0.12*
HBsAg
1.26±1.11
, 百拇医药
HBsAg+aiRNA
1.29±0.20
HBsAg+h-IRNA
1.85±0.41△
与HBsAg组比较*P<0.05;与HBcAg组比较△P<0.05
3讨论
HBV感染后慢性化问题已成为治疗乙型肝炎的难题。机体对HBV特异免疫能力的低下是其重要原因，机体缺乏对HBV有效免疫是乙型肝炎患者慢性化的基础[1,2]。由于目前尚无特效抗乙肝病毒药物，因此如何寻找提高机体对乙肝病毒特异、有效的免疫调节方法成为清除HBV、治愈慢性乙肝的关键。临床中观察到，HBV感染后，虽有部分转化为慢性持续感染者，但部分感染者无明显症状，检查时呈现抗HBs阳性(未曾注射乙肝疫苗)，或者表现为急性发病过程，HBV被清除，抗HBs产生，表明这一类机体对HBV的免疫为有效免疫，是对HBV完整颗粒包括对靶抗原HBcAg产生的有效免疫。由于特异细胞免疫受HLA限制，淋巴细胞不能直接产生有效的过继免疫，免疫核糖核酸(iRNA)具有转移细胞免疫功能的能力。利用此类机体外周血淋巴细胞制备iRNA，研究其对HBV慢性感染者的免疫调节作用，结果表明此类iRNA具有增强HBV抗原特异增殖反应，特别是对免疫细胞识别肝细胞内HBV的主要靶抗原HBcAg特异淋巴细胞增殖反应的增强作用，有利于肝内HBV的清除。有资料表明，HBV感染者对HBV的免疫特别是对主要靶抗原HBcAg细胞免疫功能低下是HBV慢性感染的关键因素之一[3]。单用HBsAg免疫动物制备的抗乙肝HBcAg特异淋巴细胞增殖反应无调节作用。表明目前临床使用的iRNA来源于单一使用HBsAg免疫的动物，并非对HBV完整颗粒产生免疫作用，即其具有的免疫信息仅针对HBsAg，对HBV其它抗原特别是核心抗原(HBcAg)不具备有免疫作用，而机体细胞免疫清除肝组织HBV时，被免疫细胞识别的主要目标是HBcAg，即免疫细胞识别HBV的靶抗原是HBcAg，而不是HBsAg。因此，目前使用的抗乙肝iRNA虽然一定程度提高乙型肝炎患者对HBV的免疫力，但对肝内HBV不能产生有效作用，从根本上起不到有效的抗病毒效果。
, 百拇医药
本课题为安徽省重点科研项目(№99022016)
余永胜，男，34岁，主治医师，硕士，主要从事感染性疾病临床研究。
参考文献
1，Ferrari C, Penna A, Bertoletti A, et al. Cellular immune response to hepatitis B virus infection . J Immunol ， 1990;145:3442
2，Hecke EV, Paradijs T, Molitor C, et al. Hepatitis B virus specific cytoxic T lymphocyte response in patients with acute and chronic hepatitis B virus infections. J Hepatol ， 1994;20:514
3，Lohr H, Weber W, Schlaak J, et al. Proliferative response of CD4 T cells and hepatitis B virus clear-ance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants. Hepatology， 1995；22:11
2000-02-16收稿，2000-03-03修回, 百拇医药