程序性细胞死亡在小鼠腭突发育及腭裂形成中的意义
作者：李鑫 金岩 董绍忠 朱萧玲
单位：250031 济南军区总医院口腔科(李 鑫),第四军医大学口腔医学院病理科(金 岩,董绍忠,朱萧玲)
关键词：程序性死亡；腭裂；腭突；维甲酸；原位末端转移酶标记
华西口腔学杂志990407 摘要 目的:明确程序性细胞死亡在腭裂形成中的作用。进一步探讨调控程序性细胞死亡的相关基因在腭裂形成中的变化及分子生物学机制。方法:将16只妊娠10 d(GD10)的C57BL/6N系小鼠随机分为实验组和对照组。实验组管饲维甲酸80 mg/kg,对照组管饲等体积植物油。分别于GD1314(妊娠第13天第14小时,下同),GD1322,GD148,GD1414,GD1422,GD158,GD1522,GD168 d处死孕鼠取胚鼠。胚鼠头部切片做原位末端转移酶标记(TUNEL)染色。结果:在腭突垂直生长期及定向移动期，两组腭间质细胞发生程序性死亡的数量有明显的差异(P<0.05)。结论:经外源性维甲酸作用后的小鼠腭突间质细胞发生大量程序性死亡，腭突体积发育瘦小，未能在中线相互融合而导致腭裂。
, 百拇医药
Significance of Programmed Cell Death in C57BL/6N Strain Mouse Palate Process Development and Cleft Palate Formation
Li Xin, Jin Yan, Dong Shaozhong, et al
Department of Oral Pathology, Stomatology College,the Fourth Military Medical University
Abstract
Objective: To observe the changes of programmed cell death (PCD) in C57BL/6N strain mouse cleft palate formation and study related gene of PCD in future.Methods: 16 mice (gestation of 10 days,GD10) were divided into the experimental and control groups randomly,then the mice of the experimental group were dosed with retinoic acid(RA) 80 mg/kg,and the tissue slices of the embryo mouse were prepared for TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)staining at GD1314(the 14th hour of the 13th day gestation), GD1322,GD148,GD1414,GD1422,GD158,GD1522 and GD168 respectively.Results: In the early development of palate process, the positive index of PCD was significantly higher in the experimental group than in the control group (P<0.05).Conclusion:The effects of RA on mesenchymal cells of the early development of palate process in the experimental group induce PCD, which result in the formation of small palate process and failure of fusing of the shelves.
, 百拇医药
Key words: programmed cell death cleft palate palate process retinoic acid TdT-mediated dUTP nick end labeling
程序性细胞死亡( program cell death，PCD)又称细胞凋亡(apoptosis)，在保障机体正常发育、维持机体内环境的稳定[1]中发挥着重要作用。在腭裂发生机制的深入研究中，建立了各种动物的腭裂模型。其中致畸率最高、腭裂发生最稳定的是维甲酸诱导的C57BL/6近交小鼠[2]，但国内尚见到这种小鼠腭裂模型的研究报道。本研究利用维甲酸诱导建立C57BL/6N系小鼠腭裂模型，并用原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)方法，探讨程序性细胞死亡在腭突发育过程中的作用及对腭裂形成的影响。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 实验动物及标本制备
12周龄，体重25 g以上的C57BL/6N系小鼠。雌、雄比例为2∶1，前一天晚8点同笼。次日晨观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0天(gestation day 0，GD 0)，隔离饲养。妊娠10 d下午1时，将20只孕鼠随机分为实验组和对照组。实验组管饲全反式维甲酸(上海第六制药厂)，剂量80 mg/kg(溶于植物油中)。对照组管饲等体积植物油。分别于GD1314(妊娠第13天第14小时,下同),GD1322,GD148,GD1414,GD1422,GD158,GD1522,7个时间点脱颈处死实验组及对照组小鼠各1只。为明确实验组腭裂发生率,GD168处死小鼠各3只。剖腹取胚鼠，两组获胚鼠分别为61和69只。10%中性甲醛固定。脱水后头部喙部朝下，石蜡包埋。5 μm切片，烤干。
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1.2 TUNEL法标记PCD细胞
TUNEL法(试剂盒购自美国Oncor公司)。切片常规脱蜡，至蒸馏水，蛋白酶K 20 μg/ml室温下消化15 min。含3%双氧水的PBS溶液中5 min。加50 μl平衡液( TUNEL试剂盒)1 min。加含TDT酶反应液的混合物10 μl(TUNEL试剂盒),37 ℃下孵育1.5 h。标本置入预热的中止反应液(TUNEL试剂盒)，37 ℃下30 min,缓冲液1(0.1 mol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl)中漂洗15 min 2次。2%正常羊血清，37 ℃孵育30 min。加抗地高辛碱性磷酸酶抗体，湿盒中37 ℃下孵育2 h。缓冲液1,缓冲液3(0.1 mol/LTris-HCl,0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L MgCl2)中分别振荡漂洗，加新鲜配制的显色液(NBT/BCIP显色系统)20 μl，暗处过夜。中止显色后，胞浆用伊红衬染，梯度酒精脱水。二甲苯透明后封片。
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1.3 PCD细胞的计数
阳性信号为覆盖整个细胞核的深蓝色着色。选相同时间点的实验组及对照组的标本，每例选择5个高倍镜视野，用网格测试法按公式计算PCD阳性指数：
PCD阳性指数=ΣPCD阳性细胞数/Σ高倍镜视野内细胞总数×100%
1.4 统计学方法
χ2检验。
2 结 果
2.1 腭裂发生率
从HE染色看，对照组168 C57BL/6N系小鼠20个标本中，两侧腭突之间已经牢固结合。而实验组相同时间点的17个标本中两侧腭突之间均未互相融合，口腔、鼻腔仍相通。
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2.2 阳性细胞率的比较
按腭突垂直生长期(GD1314～ GD148)，上抬期(GD1414～GD158)，接触融合期(GD1522～GD168)分别观察，计数PCD阳性细胞并对每个发育时期中的实验组、对照组阳性细胞标示率进行比较分析。对照组腭突垂直期PCD阳性细胞较少并散在于腭突间质中(图1)，腭突发育至上抬期及融合期PCD阳性细胞逐渐集中于腭突的边缘(图2)；实验组腭突垂直期及上抬期中PCD阳性细胞分布于整个腭突中，数量明显多于对照组(图3，P<0.05)，腭突发育至接触融合期，PCD阳性细胞数量减少(图4)，与对照组相比无明显差异(P>0.05)(表1)。
图1 对照组小鼠GD1322PCD阳性细胞数量少并分散于腭突间质中 TUNEL 伊红衬染 ×268
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图1 对照组小鼠GD1522PCD阳性细胞集中于腭突的顶端 TUNEL 伊红衬染 ×268
图1 实验组小鼠GD1314PCD阳性细胞增多,分布于整个腭突中 TUNEL 伊红衬染 ×268
图1 实验组小鼠GD168PCD阳性细胞数量减少 TUNEL, 伊红衬染 ×268
表1 腭裂形成过程中程序性细胞死亡计数(PCD阳性指数)结果 腭突不同发育时期
标本数
PCD阳性指数(%)
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P值
实验组
对照组
GD1314～GD148
43
14
1.2
<0.05
GD1414～GD158
38
6.7
0.8
, 百拇医药
<0.05
GD1522～GD168
49
1.1
0.8
>0.05
3 讨 论
胚胎组织和器官的形态发生，是一个复杂的演变过程。这些变化有严密的规律，并表现出精确的时间顺序与空间关系，包括细胞的增殖、分化、相互识别及凝聚等过程。胚胎时期细胞增殖旺盛，受多种因素调控，如细胞生长激素、转化生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子等，分别调控相应细胞的增殖。使细胞在短时间内迅速生长，在胚胎发育期就形成各组织器官的雏形。同时，胚胎发育过程中也广泛存在细胞死亡现象，这也是胚胎正常发育的重要因素[3]。细胞这种生理性的死亡即是程序性细胞死亡，往往发生在一定的部位与特定时刻，受多种因素的调控。程序性细胞死亡是由细胞自身基因控制的以一种自杀方式发生的细胞死亡。受体内，体外各种非存活信号的诱导。细胞启动自身基因开放发生凋亡，以适应环境的变化。使机体清除对其生命和功能非必须的细胞，以维持机体内环境的稳定[4]。胚胎发育中，细胞受外界刺激，一旦发生超出生理范围的程序性细胞死亡或正常的程序性细胞死亡受到抑制，都会影响胚胎发育的正常过程，导致发育畸形的产生。
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本研究结果发现，小鼠腭突在GD16之内完成了从形态发生、生长、上抬及接触融合的一系列过程。腭突从开始形成到GD148的垂直生长期中，是腭突间质未分化细胞大量增殖的阶段。细胞生长活跃，以适应快速生长变化的腭胚器官。在短时间内完成腭突的垂直生长、上抬及水平向融合过程。所以GD13～GD16的对照组腭突间充质细胞中仅出现少量的PCD细胞，散在分布于腭突中，在腭突发育到上抬及融合期时PCD细胞集中出现在发育中腭突的边缘及顶端，提示PCD是伴随腭突正常发育的一种生理现象，其功能可能为：①清除个别病变及损伤的细胞，②在腭突由垂直到水平位的变化中，边缘及顶端的间充质细胞发生PCD有助于完成腭突的上抬及融合。实验组腭突在垂直生长及上抬期均有大量PCD细胞阳性出现并分布于整个腭突内。表明腭突间充质细胞的增殖受抑制。细胞启动自身PCD相关基因开放，大量细胞发生程序性死亡，能够存活并继续参与腭突发育的间充质细胞数量明显减少，至GD15腭突体积比对照组小或不能在特定的时间内上抬。因此，到GD16时实验组胚鼠腭突由于在发育中大量超出生理范围的细胞发生PCD，使腭突发育障碍，延迟上抬，未能在腭突发育的最后阶段到达中线与对侧腭突及鼻中隔融合，导致腭裂。
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由此可见，经维甲酸作用后的腭突间质细胞在增殖旺盛的生长期出现大量程序性细胞死亡。使腭间质中能继续生长、分化，参与腭突发育融合的细胞数量减少，影响了以后腭突形态、体积的发育，是导致腭裂的原因之一。虽然程序性细胞死亡基因尚未确定，已证实许多程序性细胞死亡相关基因在程序性细胞死亡中发挥着重要作用[5,6]。在腭裂形成过程中，如能探明哪些程序性细胞死亡相关基因被激活，及其在腭裂发生过程中的表达与调控变化，将对进一步探明腭裂形成的分子生物学机制、预防腭裂发生具有重要意义。
4 参考文献
1 Clarke PGH. Development cell death:morphological diversity and multiple mechanisms. Anat Embryol, 1992, 181(1): 195～243
2 Degitz SJ, Francis BM, Foley GL. et al. Mesenchymal changes associated with retinoic acid induced cleft palate in CD-l mice. J Craniofac Genet Dev Biol,1998, 18(2):88～99
, 百拇医药
3 Maden M, Graharm A,Gale E,et al. Positional apoptosis during vertebrate CNS development in the absence of endogenous retinoids. Development,1997, 124(14):2799～2805
4 Tone S,Tanaka S.Analysis of relationship between programmed cell death and cell cycle in limb-bud.Horm Res,1997,48(3):5～10
5 Ganan Y, Macias D,Ros MA,et al. Control of skeletogenesis and programmed cell death in the developing avian limb bud by growth factors.Int J Dev Biol, 1996,Suppl(1):89～195
6 Rodriguez-Tarduchy G,Collins MKL,Lopez-Rivas A. Insulin-like growth factor I inhibits apoptosis in IL-3-dependent hemopoietic cells. J Immunol,1992,149(2):535～549
(1998-05-08收稿,1999-08-01修回), 百拇医药
单位：250031 济南军区总医院口腔科(李 鑫),第四军医大学口腔医学院病理科(金 岩,董绍忠,朱萧玲)
关键词：程序性死亡；腭裂；腭突；维甲酸；原位末端转移酶标记
华西口腔学杂志990407 摘要 目的:明确程序性细胞死亡在腭裂形成中的作用。进一步探讨调控程序性细胞死亡的相关基因在腭裂形成中的变化及分子生物学机制。方法:将16只妊娠10 d(GD10)的C57BL/6N系小鼠随机分为实验组和对照组。实验组管饲维甲酸80 mg/kg,对照组管饲等体积植物油。分别于GD1314(妊娠第13天第14小时,下同),GD1322,GD148,GD1414,GD1422,GD158,GD1522,GD168 d处死孕鼠取胚鼠。胚鼠头部切片做原位末端转移酶标记(TUNEL)染色。结果:在腭突垂直生长期及定向移动期，两组腭间质细胞发生程序性死亡的数量有明显的差异(P<0.05)。结论:经外源性维甲酸作用后的小鼠腭突间质细胞发生大量程序性死亡，腭突体积发育瘦小，未能在中线相互融合而导致腭裂。
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Significance of Programmed Cell Death in C57BL/6N Strain Mouse Palate Process Development and Cleft Palate Formation
Li Xin, Jin Yan, Dong Shaozhong, et al
Department of Oral Pathology, Stomatology College,the Fourth Military Medical University
Abstract
Objective: To observe the changes of programmed cell death (PCD) in C57BL/6N strain mouse cleft palate formation and study related gene of PCD in future.Methods: 16 mice (gestation of 10 days,GD10) were divided into the experimental and control groups randomly,then the mice of the experimental group were dosed with retinoic acid(RA) 80 mg/kg,and the tissue slices of the embryo mouse were prepared for TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)staining at GD1314(the 14th hour of the 13th day gestation), GD1322,GD148,GD1414,GD1422,GD158,GD1522 and GD168 respectively.Results: In the early development of palate process, the positive index of PCD was significantly higher in the experimental group than in the control group (P<0.05).Conclusion:The effects of RA on mesenchymal cells of the early development of palate process in the experimental group induce PCD, which result in the formation of small palate process and failure of fusing of the shelves.
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Key words: programmed cell death cleft palate palate process retinoic acid TdT-mediated dUTP nick end labeling
程序性细胞死亡( program cell death，PCD)又称细胞凋亡(apoptosis)，在保障机体正常发育、维持机体内环境的稳定[1]中发挥着重要作用。在腭裂发生机制的深入研究中，建立了各种动物的腭裂模型。其中致畸率最高、腭裂发生最稳定的是维甲酸诱导的C57BL/6近交小鼠[2]，但国内尚见到这种小鼠腭裂模型的研究报道。本研究利用维甲酸诱导建立C57BL/6N系小鼠腭裂模型，并用原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)方法，探讨程序性细胞死亡在腭突发育过程中的作用及对腭裂形成的影响。
1 材料和方法
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1.1 实验动物及标本制备
12周龄，体重25 g以上的C57BL/6N系小鼠。雌、雄比例为2∶1，前一天晚8点同笼。次日晨观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0天(gestation day 0，GD 0)，隔离饲养。妊娠10 d下午1时，将20只孕鼠随机分为实验组和对照组。实验组管饲全反式维甲酸(上海第六制药厂)，剂量80 mg/kg(溶于植物油中)。对照组管饲等体积植物油。分别于GD1314(妊娠第13天第14小时,下同),GD1322,GD148,GD1414,GD1422,GD158,GD1522,7个时间点脱颈处死实验组及对照组小鼠各1只。为明确实验组腭裂发生率,GD168处死小鼠各3只。剖腹取胚鼠，两组获胚鼠分别为61和69只。10%中性甲醛固定。脱水后头部喙部朝下，石蜡包埋。5 μm切片，烤干。
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1.2 TUNEL法标记PCD细胞
TUNEL法(试剂盒购自美国Oncor公司)。切片常规脱蜡，至蒸馏水，蛋白酶K 20 μg/ml室温下消化15 min。含3%双氧水的PBS溶液中5 min。加50 μl平衡液( TUNEL试剂盒)1 min。加含TDT酶反应液的混合物10 μl(TUNEL试剂盒),37 ℃下孵育1.5 h。标本置入预热的中止反应液(TUNEL试剂盒)，37 ℃下30 min,缓冲液1(0.1 mol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl)中漂洗15 min 2次。2%正常羊血清，37 ℃孵育30 min。加抗地高辛碱性磷酸酶抗体，湿盒中37 ℃下孵育2 h。缓冲液1,缓冲液3(0.1 mol/LTris-HCl,0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L MgCl2)中分别振荡漂洗，加新鲜配制的显色液(NBT/BCIP显色系统)20 μl，暗处过夜。中止显色后，胞浆用伊红衬染，梯度酒精脱水。二甲苯透明后封片。
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1.3 PCD细胞的计数
阳性信号为覆盖整个细胞核的深蓝色着色。选相同时间点的实验组及对照组的标本，每例选择5个高倍镜视野，用网格测试法按公式计算PCD阳性指数：
PCD阳性指数=ΣPCD阳性细胞数/Σ高倍镜视野内细胞总数×100%
1.4 统计学方法
χ2检验。
2 结 果
2.1 腭裂发生率
从HE染色看，对照组168 C57BL/6N系小鼠20个标本中，两侧腭突之间已经牢固结合。而实验组相同时间点的17个标本中两侧腭突之间均未互相融合，口腔、鼻腔仍相通。
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2.2 阳性细胞率的比较
按腭突垂直生长期(GD1314～ GD148)，上抬期(GD1414～GD158)，接触融合期(GD1522～GD168)分别观察，计数PCD阳性细胞并对每个发育时期中的实验组、对照组阳性细胞标示率进行比较分析。对照组腭突垂直期PCD阳性细胞较少并散在于腭突间质中(图1)，腭突发育至上抬期及融合期PCD阳性细胞逐渐集中于腭突的边缘(图2)；实验组腭突垂直期及上抬期中PCD阳性细胞分布于整个腭突中，数量明显多于对照组(图3，P<0.05)，腭突发育至接触融合期，PCD阳性细胞数量减少(图4)，与对照组相比无明显差异(P>0.05)(表1)。
图1 对照组小鼠GD1322PCD阳性细胞数量少并分散于腭突间质中 TUNEL 伊红衬染 ×268
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图1 对照组小鼠GD1522PCD阳性细胞集中于腭突的顶端 TUNEL 伊红衬染 ×268
图1 实验组小鼠GD1314PCD阳性细胞增多,分布于整个腭突中 TUNEL 伊红衬染 ×268
图1 实验组小鼠GD168PCD阳性细胞数量减少 TUNEL, 伊红衬染 ×268
表1 腭裂形成过程中程序性细胞死亡计数(PCD阳性指数)结果 腭突不同发育时期
标本数
PCD阳性指数(%)
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P值
实验组
对照组
GD1314～GD148
43
14
1.2
<0.05
GD1414～GD158
38
6.7
0.8
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<0.05
GD1522～GD168
49
1.1
0.8
>0.05
3 讨 论
胚胎组织和器官的形态发生，是一个复杂的演变过程。这些变化有严密的规律，并表现出精确的时间顺序与空间关系，包括细胞的增殖、分化、相互识别及凝聚等过程。胚胎时期细胞增殖旺盛，受多种因素调控，如细胞生长激素、转化生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子等，分别调控相应细胞的增殖。使细胞在短时间内迅速生长，在胚胎发育期就形成各组织器官的雏形。同时，胚胎发育过程中也广泛存在细胞死亡现象，这也是胚胎正常发育的重要因素[3]。细胞这种生理性的死亡即是程序性细胞死亡，往往发生在一定的部位与特定时刻，受多种因素的调控。程序性细胞死亡是由细胞自身基因控制的以一种自杀方式发生的细胞死亡。受体内，体外各种非存活信号的诱导。细胞启动自身基因开放发生凋亡，以适应环境的变化。使机体清除对其生命和功能非必须的细胞，以维持机体内环境的稳定[4]。胚胎发育中，细胞受外界刺激，一旦发生超出生理范围的程序性细胞死亡或正常的程序性细胞死亡受到抑制，都会影响胚胎发育的正常过程，导致发育畸形的产生。
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本研究结果发现，小鼠腭突在GD16之内完成了从形态发生、生长、上抬及接触融合的一系列过程。腭突从开始形成到GD148的垂直生长期中，是腭突间质未分化细胞大量增殖的阶段。细胞生长活跃，以适应快速生长变化的腭胚器官。在短时间内完成腭突的垂直生长、上抬及水平向融合过程。所以GD13～GD16的对照组腭突间充质细胞中仅出现少量的PCD细胞，散在分布于腭突中，在腭突发育到上抬及融合期时PCD细胞集中出现在发育中腭突的边缘及顶端，提示PCD是伴随腭突正常发育的一种生理现象，其功能可能为：①清除个别病变及损伤的细胞，②在腭突由垂直到水平位的变化中，边缘及顶端的间充质细胞发生PCD有助于完成腭突的上抬及融合。实验组腭突在垂直生长及上抬期均有大量PCD细胞阳性出现并分布于整个腭突内。表明腭突间充质细胞的增殖受抑制。细胞启动自身PCD相关基因开放，大量细胞发生程序性死亡，能够存活并继续参与腭突发育的间充质细胞数量明显减少，至GD15腭突体积比对照组小或不能在特定的时间内上抬。因此，到GD16时实验组胚鼠腭突由于在发育中大量超出生理范围的细胞发生PCD，使腭突发育障碍，延迟上抬，未能在腭突发育的最后阶段到达中线与对侧腭突及鼻中隔融合，导致腭裂。
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由此可见，经维甲酸作用后的腭突间质细胞在增殖旺盛的生长期出现大量程序性细胞死亡。使腭间质中能继续生长、分化，参与腭突发育融合的细胞数量减少，影响了以后腭突形态、体积的发育，是导致腭裂的原因之一。虽然程序性细胞死亡基因尚未确定，已证实许多程序性细胞死亡相关基因在程序性细胞死亡中发挥着重要作用[5,6]。在腭裂形成过程中，如能探明哪些程序性细胞死亡相关基因被激活，及其在腭裂发生过程中的表达与调控变化，将对进一步探明腭裂形成的分子生物学机制、预防腭裂发生具有重要意义。
4 参考文献
1 Clarke PGH. Development cell death:morphological diversity and multiple mechanisms. Anat Embryol, 1992, 181(1): 195～243
2 Degitz SJ, Francis BM, Foley GL. et al. Mesenchymal changes associated with retinoic acid induced cleft palate in CD-l mice. J Craniofac Genet Dev Biol,1998, 18(2):88～99
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3 Maden M, Graharm A,Gale E,et al. Positional apoptosis during vertebrate CNS development in the absence of endogenous retinoids. Development,1997, 124(14):2799～2805
4 Tone S,Tanaka S.Analysis of relationship between programmed cell death and cell cycle in limb-bud.Horm Res,1997,48(3):5～10
5 Ganan Y, Macias D,Ros MA,et al. Control of skeletogenesis and programmed cell death in the developing avian limb bud by growth factors.Int J Dev Biol, 1996,Suppl(1):89～195
6 Rodriguez-Tarduchy G,Collins MKL,Lopez-Rivas A. Insulin-like growth factor I inhibits apoptosis in IL-3-dependent hemopoietic cells. J Immunol,1992,149(2):535～549
(1998-05-08收稿,1999-08-01修回), 百拇医药