HPLC法测定双黄连制剂中连翘苷的含量
作者：聂东东 杨立娟 宋维秋
单位：黑龙江省鸡西市药品检验所，鸡西市158100
关键词：HPLC；双黄连制剂；连翘苷
摘要
摘要：目的：在双黄连类制剂的质量标准中建立连翘苷的含量测定项。方法：HPLC法测定双黄连制剂中连翘苷的含量。使用ODS柱，以乙腈-水(25∶75)为流动相，检测波长为277nm。结果：此方法线性关系良好，平均加样回收率为991%，RSD=082%。结论：该方法精度高，分离度、重复性良好，结果准确可靠，可用于双黄连类制剂的质量控制。
中图分类号：R927.1文献标识码：B文章编号：1001-0408(2000)06-0275-02
Determination of the Contents of Phillyrin in Shuanghuanglian Preparations by HPLC
, 百拇医药
NIE Dongdong
( Jixi Institute for Drug Control， Jixi 158100)
YANG Lijuan， SONG Weiqiu
( Jixi Hospital of TCM， Jixi 158100)
ABSTRACT： OBJECTIVE： To establish the item of phillyrin content determination in the quality standard of shuanghuanglian preparations METHODS： The contents of phillyrin were determined by HPLC with ODS column and acetonitrile- water( 25∶ 75) as mobile phase Detecting wavelength was 277nm RESULTS： The calibration curve was linear in this experiment The average recovery was 99 1% with RSD of 0 82% CONCLUSION： This method is good in precision and satisfactory in isolation and repeatability and the result is accurate It may be adopted in quality control of shuanghuanglian preparations
, 百拇医药
KEY WORDS： HPLC； shuanghuanglian preparation； phillyrin
双黄连类制剂系由金银花、黄芩、连翘等经加工制成的中药制剂，现已生产有片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、粉针剂、注射液、口服液等多种剂型，具有辛凉解表，清热解毒之功效，临床应用极为广泛。方中连翘成分复杂，其主要有效成分为咖啡酸、连翘苷、连翘酯苷、芦丁及连翘酯素。双黄连类制剂的相关质量标准中[1]，规定以连翘的水提取物入药，这样可将连翘中的各有效成分基本提出。笔者在药品监督检验工作中发现，有的厂家为了减少生产工序、降低生产成本，直接以连翘酯苷为原料入药，其结果将降低该类制剂的临床疗效。连翘苷在生药中的含量较连翘酯苷低，其生产成本较高，因此本文选取连翘苷为定量指标，以更好地控制该类制剂的产品质量。目前，连翘苷的含量测定一般多采用薄层扫描法，但该方法线性关系和重复性较差，精度低，误差大，操作繁琐。HPLC法测定双黄连类制剂中连翘苷的含量尚未见报道。笔者经大量的实验研究，采用该方法测定连翘苷的含量，其线性关系、重复性和分离度良好，精度高，结果准确可靠，可用于该类制剂的质量控制。
, http://www.100md.com
1仪器与材料
HP1100高效液相色谱仪，美国惠普公司(其配置为真空脱气器、四元泵、VWD、HP化学工作站、手动进样器)；SB5200超声波提取仪，上海必能信超声有限公司；UV-265自动记录分光光度计，日本岛津；HA180M电子分析天平，日本AND公司。
连翘苷对照品(供含量测定用)，购于中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；样品均购于我市辖区内各药品生产及经营单位。
2实验方法与结果
21色谱条件
色谱柱：ODSHypersil色谱柱(5μm，125×4mm，装有ODS保护柱)；流动相：乙腈-水(25:75)；流速：1ml/min；柱温：室温；检测波长：277nm；检测灵敏度：004AUFS；进样量：10μl。
, 百拇医药
22对照品溶液的制备
精密称取连翘苷对照品5mg，置25ml容量瓶中，加甲醇适量超声处理使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。
23供试品溶液的制备
231固体类双黄连制剂供试液的制备：取本品研细，精密称取适量(药相当于连翘生药8g)，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40ml，将塞塞紧，精密称定重量，超声处理20min，取出锥形瓶，精密称定重量，用甲醇补足减失重量，滤过，精密量取续滤液20ml，加乙酸铅2g，过滤，精密量取续滤液10ml，置水浴上蒸至近干，加05g中性氧化铝拌样后，水浴蒸干，加于中性氧化铝柱(100目～120目层析用中性氧化铝1g，柱内经10～15mm)上，以70%乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，水浴浓缩至干，残留物以50%甲醇适量超声处理使溶解，定量转移至5ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，经05μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
, 百拇医药
232液体类双黄连制剂供试液的制备：精密量取本品8ml，加乙酸铅2g，过滤，精密量取续滤液4ml，置水浴上蒸至近干，照231项下的方法自“加05g中性氧化铝拌样后”起，依法操作，即得。
24阴性对照溶液的制备
按处方比例，从中除去连翘药材，模拟生产工艺制成空白样品，并按供试品溶液制备项下的方法制成阴性对照溶液。
25系统适用性试验
分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，见图1。理论板数按连翘苷峰计算为5449，连翘苷锋的保留时间为45min，分离度为458。
从图1中可知，供试品在与对照品相应的tR处有色谱峰，而阴性对照液则无，说明样品中其它药材和辅料对连翘苷的测定无干扰。
, http://www.100md.com
26线性关系考察
精密吸取对照品溶液05、2、6、10、15、20μl进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量(μl)为横坐标进行线性回归，回归方程为Y=1053394X+183640，r=0.9999。表明连翘苷在01μg～40μg范围内具有良好的线性关系。
27精密度试验
精密吸取对照品溶液10μl，重复进样5次，RSD=063%。
28重复性试验
取同一批供试品，按供试品溶液的制备方法制备5份供试液，分别进样，RSD为082%。
29稳定性试验
取一供试液分别在2、4、6、8、12、24、32、48h测定，结果表明，供试品在32h内稳定。
, 百拇医药
210回收率测定
采用加样回收法。精密称取已知含量的供试品5份，分别精密加入连翘苷对照品2mg，按上述色谱条件测定，计算回收率。平均回收率为992%，RSD=082%。
211样品测定
精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以外标法计算即得，见表1。
表1样品含量测定结果
3讨论
31样品预处理方法的考察
试验中曾将样品(或样品提取液)未经处理直接过柱后进样，但色谱中杂质峰较多，且其峰面积较大，干扰严重。后经大量试验研究，将样品(或样品提取液)在过柱前，加入乙酸铅，除去黄酮类及酸性杂质，结果消除了部分杂质峰，并使未消除的杂质峰的峰面积明显缩小，有效地提高了色谱质量。
, 百拇医药
32流动相的选择
试验中曾以甲醇-水(30:70)为流动相进行检测，但各组分峰不能较好的分离。经反复试验摸索，确定了正文中所采用的流动相，使连翘苷峰与干扰组分峰达到了基线分离，且其峰形尖锐、对称。试验中发现，乙腈和水之间的比例变化，对连翘苷峰的保留时间影响甚为明显。
33检测波长的选择
采用紫外分光光度法对供试液及对照品液分别在200nm～400nm间进行扫描，结果二者均在2770nm的波长处有最大吸收，故确定277nm为检测波长。
因D厂生产的双黄连注射液是以连翘酯苷为原料，故其连翘苷的含量甚微。从测定结果中可看出，各样品间连翘苷的含量差异较大，进一步说明了对该制剂中连翘苷的含量进行监控的必要性。
参考文献：
1，中华人民共和国卫生部药典委员会卫生部药品标准-中药成方制剂(第11册)[S]1996:3
(收稿日期：2000-07-13修回日期：2000-09-06), http://www.100md.com
单位：黑龙江省鸡西市药品检验所，鸡西市158100
关键词：HPLC；双黄连制剂；连翘苷
摘要
摘要：目的：在双黄连类制剂的质量标准中建立连翘苷的含量测定项。方法：HPLC法测定双黄连制剂中连翘苷的含量。使用ODS柱，以乙腈-水(25∶75)为流动相，检测波长为277nm。结果：此方法线性关系良好，平均加样回收率为991%，RSD=082%。结论：该方法精度高，分离度、重复性良好，结果准确可靠，可用于双黄连类制剂的质量控制。
中图分类号：R927.1文献标识码：B文章编号：1001-0408(2000)06-0275-02
Determination of the Contents of Phillyrin in Shuanghuanglian Preparations by HPLC
, 百拇医药
NIE Dongdong
( Jixi Institute for Drug Control， Jixi 158100)
YANG Lijuan， SONG Weiqiu
( Jixi Hospital of TCM， Jixi 158100)
ABSTRACT： OBJECTIVE： To establish the item of phillyrin content determination in the quality standard of shuanghuanglian preparations METHODS： The contents of phillyrin were determined by HPLC with ODS column and acetonitrile- water( 25∶ 75) as mobile phase Detecting wavelength was 277nm RESULTS： The calibration curve was linear in this experiment The average recovery was 99 1% with RSD of 0 82% CONCLUSION： This method is good in precision and satisfactory in isolation and repeatability and the result is accurate It may be adopted in quality control of shuanghuanglian preparations
, 百拇医药
KEY WORDS： HPLC； shuanghuanglian preparation； phillyrin
双黄连类制剂系由金银花、黄芩、连翘等经加工制成的中药制剂，现已生产有片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、粉针剂、注射液、口服液等多种剂型，具有辛凉解表，清热解毒之功效，临床应用极为广泛。方中连翘成分复杂，其主要有效成分为咖啡酸、连翘苷、连翘酯苷、芦丁及连翘酯素。双黄连类制剂的相关质量标准中[1]，规定以连翘的水提取物入药，这样可将连翘中的各有效成分基本提出。笔者在药品监督检验工作中发现，有的厂家为了减少生产工序、降低生产成本，直接以连翘酯苷为原料入药，其结果将降低该类制剂的临床疗效。连翘苷在生药中的含量较连翘酯苷低，其生产成本较高，因此本文选取连翘苷为定量指标，以更好地控制该类制剂的产品质量。目前，连翘苷的含量测定一般多采用薄层扫描法，但该方法线性关系和重复性较差，精度低，误差大，操作繁琐。HPLC法测定双黄连类制剂中连翘苷的含量尚未见报道。笔者经大量的实验研究，采用该方法测定连翘苷的含量，其线性关系、重复性和分离度良好，精度高，结果准确可靠，可用于该类制剂的质量控制。
, http://www.100md.com
1仪器与材料
HP1100高效液相色谱仪，美国惠普公司(其配置为真空脱气器、四元泵、VWD、HP化学工作站、手动进样器)；SB5200超声波提取仪，上海必能信超声有限公司；UV-265自动记录分光光度计，日本岛津；HA180M电子分析天平，日本AND公司。
连翘苷对照品(供含量测定用)，购于中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；样品均购于我市辖区内各药品生产及经营单位。
2实验方法与结果
21色谱条件
色谱柱：ODSHypersil色谱柱(5μm，125×4mm，装有ODS保护柱)；流动相：乙腈-水(25:75)；流速：1ml/min；柱温：室温；检测波长：277nm；检测灵敏度：004AUFS；进样量：10μl。
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22对照品溶液的制备
精密称取连翘苷对照品5mg，置25ml容量瓶中，加甲醇适量超声处理使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。
23供试品溶液的制备
231固体类双黄连制剂供试液的制备：取本品研细，精密称取适量(药相当于连翘生药8g)，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40ml，将塞塞紧，精密称定重量，超声处理20min，取出锥形瓶，精密称定重量，用甲醇补足减失重量，滤过，精密量取续滤液20ml，加乙酸铅2g，过滤，精密量取续滤液10ml，置水浴上蒸至近干，加05g中性氧化铝拌样后，水浴蒸干，加于中性氧化铝柱(100目～120目层析用中性氧化铝1g，柱内经10～15mm)上，以70%乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，水浴浓缩至干，残留物以50%甲醇适量超声处理使溶解，定量转移至5ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，经05μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
, 百拇医药
232液体类双黄连制剂供试液的制备：精密量取本品8ml，加乙酸铅2g，过滤，精密量取续滤液4ml，置水浴上蒸至近干，照231项下的方法自“加05g中性氧化铝拌样后”起，依法操作，即得。
24阴性对照溶液的制备
按处方比例，从中除去连翘药材，模拟生产工艺制成空白样品，并按供试品溶液制备项下的方法制成阴性对照溶液。
25系统适用性试验
分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，见图1。理论板数按连翘苷峰计算为5449，连翘苷锋的保留时间为45min，分离度为458。
从图1中可知，供试品在与对照品相应的tR处有色谱峰，而阴性对照液则无，说明样品中其它药材和辅料对连翘苷的测定无干扰。
, http://www.100md.com
26线性关系考察
精密吸取对照品溶液05、2、6、10、15、20μl进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量(μl)为横坐标进行线性回归，回归方程为Y=1053394X+183640，r=0.9999。表明连翘苷在01μg～40μg范围内具有良好的线性关系。
27精密度试验
精密吸取对照品溶液10μl，重复进样5次，RSD=063%。
28重复性试验
取同一批供试品，按供试品溶液的制备方法制备5份供试液，分别进样，RSD为082%。
29稳定性试验
取一供试液分别在2、4、6、8、12、24、32、48h测定，结果表明，供试品在32h内稳定。
, 百拇医药
210回收率测定
采用加样回收法。精密称取已知含量的供试品5份，分别精密加入连翘苷对照品2mg，按上述色谱条件测定，计算回收率。平均回收率为992%，RSD=082%。
211样品测定
精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以外标法计算即得，见表1。
表1样品含量测定结果
3讨论
31样品预处理方法的考察
试验中曾将样品(或样品提取液)未经处理直接过柱后进样，但色谱中杂质峰较多，且其峰面积较大，干扰严重。后经大量试验研究，将样品(或样品提取液)在过柱前，加入乙酸铅，除去黄酮类及酸性杂质，结果消除了部分杂质峰，并使未消除的杂质峰的峰面积明显缩小，有效地提高了色谱质量。
, 百拇医药
32流动相的选择
试验中曾以甲醇-水(30:70)为流动相进行检测，但各组分峰不能较好的分离。经反复试验摸索，确定了正文中所采用的流动相，使连翘苷峰与干扰组分峰达到了基线分离，且其峰形尖锐、对称。试验中发现，乙腈和水之间的比例变化，对连翘苷峰的保留时间影响甚为明显。
33检测波长的选择
采用紫外分光光度法对供试液及对照品液分别在200nm～400nm间进行扫描，结果二者均在2770nm的波长处有最大吸收，故确定277nm为检测波长。
因D厂生产的双黄连注射液是以连翘酯苷为原料，故其连翘苷的含量甚微。从测定结果中可看出，各样品间连翘苷的含量差异较大，进一步说明了对该制剂中连翘苷的含量进行监控的必要性。
参考文献：
1，中华人民共和国卫生部药典委员会卫生部药品标准-中药成方制剂(第11册)[S]1996:3
(收稿日期：2000-07-13修回日期：2000-09-06), http://www.100md.com