超临界CO2从柴胡中萃取挥发油及其皂甙的研究
作者：葛发欢 李莹 谢健鸣 李菁 马国俊 陈友鸿 林毅超 李笑芬
单位：葛发欢(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；李莹(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；谢健鸣(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；李菁(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；马国俊(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；陈友鸿(广州星群药业股份有限公司,广东 广州 510120)林毅超(广东药学院，广东 广州 510224)；李笑芬(广东药学院，广东 广州 510224)
关键词：超临界CO2萃取；柴胡挥发油；柴胡皂甙；工艺研究
中国中药杂志000307 摘 要：目的：研究超临界CO2萃取柴胡挥发油和皂甙的工艺。方法：主要探讨压力、温度、时间、流量、夹带剂等条件对收率的影响，确定超临界CO2萃取柴胡挥发油和皂甙的最佳条件。并将挥发油的超临界CO2萃取法与传统的水蒸气蒸馏法进行比较，同时，用GC/MS法对挥发油进行分离鉴定。结果：挥发油的萃取压力为20 MPa，温度30 ℃;解析釜I压力为12 MPa，温度65 ℃；解析釜Ⅱ压力为6 MPa，温度40 ℃；萃取时间4 h，CO2流量为每1kg原料10～20 kg.h-1。柴胡皂甙的萃取压力是30 MPa,温度65 ℃;解析釜I压力为12 MPa，温度55 ℃；解析釜Ⅱ压力为6 MPa，温度43 ℃；萃取时间3 h，CO2流量为每1kg原料20～25 kg.h-1。结论：超临界CO2提取挥发油比传统法优越，表现在收率大大提高，提取时间短等方面。挥发油由己醛等22个化学成分组成。加入乙醇等夹带剂，并升高压力和温度，才能提出柴胡皂甙。
, 百拇医药
Studies on Technology of Supercritical-CO2 Fluid Extraction for Volatile Oils and Saikosaponins in Bupleurum chinense DC.
GE Fa-huan LI Yong XIE Jian-ming LI Qing MA Guo-jun LIN Yi-chao
(Guangzhou Pharmaceutical Industrial Research Institute, Guangzhou 510240, Guangdong, China)
CHEN You-hing
(Guangzhou Xingqun Pharmaceutical Co.Ltd, Guangzhou 510120, Guangdong, China)
, 百拇医药
LI Xiao-fen
(Guangdong School of Pharmaceutical Scieneice, Guangzhou Guangdong 510224,China)
Abstract：Objective: To study the technology of supercritical-CO2 fluid extraction (SFE-CO2) for the volatile oils and saikosaponins in Bupleurum chinense. Method: Exploring the effects of pressure, temperature, extraction time, flow rate of CO2 and entrainers on the yield of the oils and saikosaponin-contained extracts; determining the optimum conditions for SFE-CO2; analyzing the oils by GC/MS and comparing the technology of SFE-CO2 with that of traditional steam distillation. Result: The optimum extraction conditions turned out to be ——for volatile oils: pressure (EP)=20 MPa, temperature (ET)=30 ℃, isolator Ⅰpressure (1P-Ⅰ)=12 MPa, temperature(1T-Ⅰ)=65 ℃, isolator Ⅱ pressure (1P-Ⅱ) =6 MPa, temperature (1T-Ⅱ) =40 ℃, extraction time=4 hours, and CO2 flow rate=10～20 kg.(h.kg)-1 crude drug; for saikosaponins: EP=30 MPa, ET=65 ℃,1PⅠ=12 MPa, 1TⅠ=55 ℃, 1PⅡ=6 MPa,1TⅡ= 43 ℃, extraction time=3 hours, entrainer= 60% ethanol, and CO2 flow rate=20～25 kg.(h.kg)-1 crude drug. Conclusion: SFE-CO2 excels the traditional steam distillation in raising yield and reducing extraction time. The oils are composed of 22 constituents including caproaldehyde, and the saikosaponins can only be extracted with the help of entrainers under higher pressure and temperature.
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Key words：SFE-CO2; Bupleurum chinense; volatile oil; saikosaponin; technological study▲
超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extration，简称SFE)技术是近20年来国际上迅速发展的新一代化工分离技术，已广泛应用于食品、香料、医药等行业[1]。CO2是最常用的超临界流体。超临界CO2萃取(SFE-CO2)应用于中药领域，与传统方法比较，具有许多独特的优点，对实现中药现代化具有重要意义和可观的应用前景[2，3]。
柴胡为伞形科柴胡属植物，具解表、退热、疏肝解郁功能，主治感冒发热，寒热往来，胸肋腹痛等症。其主要有效成分为挥发油和柴胡皂甙。由于柴胡注射液有较好的退热、解表效果，国内许多制药厂家一直用水蒸气蒸馏法提取挥发油制成柴胡注射液。近来有报道，柴胡注射液具有抗抽搐作用，且毒性低，起效时间长，可能会成为一种较好的抗癫痫辅助药，但由于柴胡注射液中挥发油浓度低，用药剂量大[4]。而用传统的水蒸气蒸馏法生产存在产油率低、操作温度高，耗时长等问题。柴胡皂甙有明显的中枢抑制作用和抗炎作用，还具有特异性阻碍胆碱酯酶和显著的利尿作用，对于柴胡皂甙的提取，由于传统工艺温度高、受热时间长，某些柴胡皂甙含量降低或损失殆尽[5]。因而运用临界CO2流体萃取技术来改良柴胡挥发油和皂甙的提取工艺，具有较大的意义。
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1 实验材料、装置与仪器
1.1 实验材料
柴胡购于广州市药材公司，经广州市药材公司周璐珊副主任中药师鉴定为柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根，粉碎成10～20目备用；薄层层析用硅胶G(青岛海洋化工集团公司)；柴胡皂甙a,c,d(上海医药工业研究院)。
1.2 实验装置与仪器
5 L超临界萃取装置(HA-9508型)：广州市医药工业研究所设计,华安超临界萃取有限公司加工生产；HP5988A型GC-MS/MSD气相色谱-质谱联用仪：HP-1 12 m×0.2 mm石英毛细管柱，柱温50～240 ℃，升温速度10 ℃.min-1，进样口温度240 ℃，柱前压20 kPa，载气为氮气。EI离子源，离子温度240 ℃，电子能量70 eV，倍增器高压2 500 V，质量扫描30～400 amu，GC-MS转输线温度240 ℃。
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2 实验方法与步骤
2.1 SFE-CO2法提取工艺的基本流程
将一定量的柴胡干粉投入萃取釜中，对萃取釜、解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ、贮罐分别进行加热或冷却。当达到所选定的温度时，开启CO2气瓶对系统进行加压，当达到所选定的压力时，关闭气瓶，循环萃取，并保持恒温恒压。当达到所选定的萃取时间后，从解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ出料口出料，得柴胡挥发油或皂甙类成分。计算收率，并用GC-MS等方法检测质量。
2.2 柴胡挥发油传统的水蒸气蒸馏法
取一定量同样的柴胡干料，参照《中国药典》(1995年版)方法，用水蒸气蒸馏装置进行蒸馏，得挥发油部分，比重小于1的收率为0.057%，比重大于1的收率为0.18%，总提取时间为12 h，并分析产品质量。
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2.3 柴胡挥发油和皂甙的分析检测
柴胡挥发油分析，参照1.2“实验装置与仪器”项下的气相色谱-质谱联用仪及其分析条件进行；柴胡皂甙用薄层层析法分析：硅胶G板(0.2%羧甲基纤维素钠)，展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水(8∶1.5∶1)，显色剂为2%对二甲氨基苯甲醛-硫酸(40%)。
3 结果
3.1 萃取压力对挥发油收率的影响
实验结果如图1，结果表明，在15～20 MPa，挥发油收率随压力的升高而增加，这是因为随着压力的增加，超临界CO2流体的密度增加，使得溶解度增加。但达到20 MPa时，收率几乎达最大值，此时压力再增加，总提物也会随之而增加，但挥发油的收率却会降低，因为增加压力，扩散系数减少，阻碍传质；同时因为挥发油的含量有限，增加的部分主要是其他杂质成分。因此，最佳萃取压力为20 MPa。
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图1 萃取压力对挥发油收率的影响
3.2 萃取温度对挥发油收率的影响
温度是除了压力以外的另一个十分重要的影响因素。由图2可见，柴胡挥发油收率开始随温度的升高而降低，当温度超过45 ℃时，其收率又随温度的升高而升高。这是由于温度对萃取的影响比较复杂。一般有两种趋势，一方面，流体密度随温度的升高而降低，从而使流体的溶解能力降低；另一方面流体的粘度随着温度的升高而下降，传质加快，有利于萃取。在30～45 ℃，流体密度随温度的升高而降低起主导作用，所以，收率呈下降趋势，在45～60 ℃，流体粘度随温度的升高而下降起主导作用，故收率又呈上升趋势。在最佳萃取压力20 MPa中，30 ℃与60 ℃时的收率相当，由于60 ℃时，产品杂质较多，同时考虑到节约能源问题，所以最佳萃取温度定为30 ℃。
图2 萃取温度对挥发油收率的影响
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3.3 萃取时间对挥发油收率的影响
如图3，随着时间的增加，收率逐渐增高，前2 h增加显著，之后增加缓慢，4 h后几乎萃取完全。时间再增加，出料也甚少。为了提高效率，节省能源，提取时间以4 h为宜。见图3。
图3 萃取时间对挥发油收率的影响
3.4 解析条件对挥发油收率的影响
3.4.1 解析温度的影响 一般来说，只有Ⅰ级解析的情况下，温度升高，密度降低，溶解度下降，解析出来的东西多，即收率升高，纯度降低。但是如有两级解析，固定第Ⅰ级解析温度为40 ℃左右，则第Ⅱ级解析温度变化对总提物收率影响不大，只是影响各级提取物的量和含量分布不同。
3.4.2 解析压力的影响 只有Ⅰ级解析时，压力升高，密度增大，溶解度升高，收率下降，纯度升高。如果是两级解析，固定Ⅱ级压力为6 MPa左右，则Ⅰ级解析的压力变化影响同上。
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具体的解析条件，可根据提取物的具体用途来设定Ⅰ级解析的压力和温度。本实验采用两级分离，由于萃取物为挥发油，只要分离总挥发油即可，所以纯度要求不高。本实验最佳条件为：Ⅰ级解析压力和温度为12 MPa和65 ℃；Ⅱ级解析压力和温度为60 MPa和40 ℃。
3.5 CO2流量对挥发油收率的影响
流量对柴胡挥发油收率影响不太大。一般来说，随着流量增大，会使萃取时间缩短，但CO2的耗量也随之增加，而且CO2与物料接触不够充分，萃取率的提高会趋于饱和。再则，流量过高会使产品未来得及在解析Ⅰ，Ⅱ中析出就被冲回萃取釜而使收率下降。但流量太低，相同时间内收率也较低，要达到相同的萃取效率，必须延长时间，这就使得设备利用率下降，同时增加了耗能。所以，流量不宜太大或过低。本实验中，选择流量为每1 kg原料10～20 kg.h-1。
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3.6 常规法与SFE法挥发油分析及比较
3.6.1 挥发油GC-MS分析比较 将所得挥发油进行GC-MS分析，结果如表1，由表1可以看出，SFE-CO2法和水蒸气蒸馏法得到的挥发油组成相同，只是成分含量有所差异。
表1 柴胡挥发油化学成分组成 峰号
化合物名称
分子式
分子量
水蒸气
/%
水蒸气1)
/%
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SFE-CO2
/%
SFE-CO21)
/%
1
己醛(hexanal)
C6H12O
88
0.08
0.11
0.26
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2
庚醛(heptanal)
C7H14O
102
0.18
0.25
0.12
0.64
3
辛醛(octanal)
C8H16O
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128
0.21
0.29
0.47
2.50
4
戊苯(benzene pentyl)
C11H16
148
0.27
0.38
0.59
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3.13
5
龙脑(borneol)
C10H18O
154
0.73
1.02
0.12
0.64
6
4-萜品醇(terpinen-4-ol)
C10H18O
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154
1.73
2.42
0.46
2.44
7
a-萜品醇(terpinenol)
C10H18O
154
2.79
3.91
0.41
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2.18
8
1，3-异苯呋喃二酮(1，3-isobenyofurandione)
C8H14O3
158
1.01
1.41
0.26
1.38
9
甲基萘(naphthalene,1-methyl)
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C11H10
142
0.86
1.20
0.35
1.86
10
2，4-二烯十二醛(2，4-dodecadienal)
C12H20O
180
1.53
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2.14
0.13
0.69
11
1-苯-戊酮-1(1-pentanonl,1-phenyl)
C11H14O
162
10.69
14.83
0.23
1.22
12
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a-姜黄烯(a-curcumene)
C15H22
202
0.83
1.16
0.31
1.65
13
a-愈创烯(a-guaiene)
C15H24
204
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4.35
6.09
1.20
6.37
14
十五烷(pentadecane)
C15H32
212
1.60
2.24
0.59
3.13
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15
3，7-二甲基-3-辛醇(1-octen-3-ol,3,7-dimethyl)
C10H20O
156
10.58
14.82
0.96
5.10
16
甲基麝香草醚(methyl thymol ether)
C11H16O
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164
9.79
13.71
1.27
6.74
17
丁烯基内酯(butylidene phthalide)
C12H12O2
188
11.76
16.47
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9.40
18
藁本内酯(ligustilide)
C12H14O2
190
4.50
6.30
0.47
2.50
19
棕榈酸(palmitic acid)
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C16H32O2
256
18.47
31.20
20
亚油酸(linoleic acid)
C18H32O2
280
4.05
27.15
21
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油酸(oleic acid)
C18H34O2
282
3.09
18.44
22
硬酯酸(stearic acid)
C18H36O2
284
2.95
4.38
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注：1)扣除脂肪酸
3.6.2 两种挥发油提取工艺的比较(见表2)
表2 挥发油SFE-CO2法和水蒸气蒸馏法工艺比较 方法
外观性状
收率/%
t/h
SFE-CO2
黄褐色
1.86
4
水蒸气蒸馏
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淡黄色
0.24
12
由表2可见，SFE-CO2法同水蒸气蒸馏法比较，前者收率大大提高，提取时间缩短。
3.7 含柴胡皂甙类极性成分的提取
在实验过程中，证明了柴胡在较温和的压力和温度下，不加夹带剂而得到的非挥发油部分不含皂甙。因此，柴胡提取挥发油后，紧接着提高系统的温度和压力并加入夹带剂，对柴胡皂甙的超临界CO2提取进行了研究。通过薄层层析对提取物进行检测，发现可将柴胡皂甙提取出来，结果见图4。进而探讨压力、温度和夹带剂等条件对其提取的影响。
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图4 柴胡SFE-CO2提取物的TLC图谱
A.SFE-CO2+50%乙醇 B.SFE-CO2+60%乙醇
C.SFE-CO2+70%乙醇 D.SFE-CO2+95%乙醇
E.SFE-CO2+乙酸乙酯 F.SFE-CO2+甲醇
1.柴胡皂甙d 2.柴胡皂甙a 3.柴胡皂甙c
3.7.1 夹带剂对柴胡皂甙提取的影响 对于柴胡皂甙SFE-CO2提取，夹带剂是最重要的影响因素。本实验选用了不同浓度的乙醇、乙酸乙酯和甲醇作夹带剂，比较它们的收率，发现95%乙醇其总提物收率最高，但从TLC检测中看出，它只能提出柴胡皂甙a，d，但提不出柴胡皂甙c，而60%或70%乙醇能将a，c，d提出。因此从收率和皂甙等方面考虑，采用60%乙醇作夹带剂。见图4、图5。
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图5 夹带剂对柴胡皂甙提取收率的影响
1.50%乙醇 2.60%乙醇 3.70%乙醇
4.95%乙醇 5.甲醇 6.乙酸乙酯
3.7.2 压力对柴胡皂甙提物的影响 由图6可见，柴胡皂甙粗品的收率在20～30 MPa时随着压力的升高而升高，当压力为30 MPa时，收率达最大值，随后压力增大，收率降低。所以从设备和收率及皂甙方面考虑，萃取压力选择30 MPa。
图6 压力对柴胡皂甙提取收率的影响
3.7.3 温度对柴胡皂甙提取的影响 如图7，在30～45 ℃，随温度的升高，柴胡皂甙粗品收率下降，当超过45 ℃时，收率随着萃取温度的增加而升高。从收率、皂甙及能耗等方面考虑，萃取温度为65 ℃左右为宜。
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图7 温度对柴胡皂甙提取收率的影响
4 小结与讨论
4.1 超临界CO2从柴胡中提取柴胡挥发油的最佳条件是：萃取压力为20 MPa，温度30 ℃;解析釜Ⅰ压力为12 MPa,温度65 ℃;解析釜Ⅱ压力为6 MPa,温度40℃，萃取时间4 h。
4.2 用SFE-CO2法提取柴胡挥发油，与传统的水蒸气蒸馏法相比较，能大大提高收率，缩短提取时间。
4.3 SFE-CO2法挥发油组成和水蒸气法一致，均由己醛等22个成分组成,只是各成分含量有差异。
4.4 超临界CO2从柴胡中提取含柴胡皂甙粗品的最佳条件是：萃取压力30 MPa，温度65 ℃;解析釜Ⅰ的压力12 MPa,温度55 ℃；解析釜Ⅱ的压力6 MPa，温度43 ℃;萃取时间3 h，夹带剂为60%乙醇。
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4.5 用超临界CO2萃取进行柴胡主要有效成分的萃取工艺研究尚未见报道。本实验的结果表明，用SFE-CO2提取柴胡挥发油是可行的。同时能将柴胡皂甙提取出来。
参考文献：
[1]葛发欢，李 菁，王海波，等.超临界CO2流体萃取技术在天然产物提取及药物分析中的最新研究进展和前景.中药材，1995，18(6)：316.
[2]王小茹.中药复杂体系中重大科学问题探讨.厦门:厦门大学出版社，1998.287.
[3]葛发欢，辉国钧，李 菁，等.中药现代化与超临界CO2流体新技术的应用.第二届全国超临界流体技术学术及应用研讨会论文集.1998.30.
[4]龚素珍，瘳卫平，郑德枢，等.柴胡对大鼠额叶皮层电刺激惊厥阈值影响的研究.中国中西医结合杂志(基础理论研究特集)，1997，17：209.
[5]张 玲，徐本明，徐新刚，等.柴胡提取工艺研究.中成药，1997，19(8)：1.
收稿日期：1999-08-24, 百拇医药
单位：葛发欢(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；李莹(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；谢健鸣(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；李菁(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；马国俊(广州市医药工业研究所,广东 广州 510240)；陈友鸿(广州星群药业股份有限公司,广东 广州 510120)林毅超(广东药学院，广东 广州 510224)；李笑芬(广东药学院，广东 广州 510224)
关键词：超临界CO2萃取；柴胡挥发油；柴胡皂甙；工艺研究
中国中药杂志000307 摘 要：目的：研究超临界CO2萃取柴胡挥发油和皂甙的工艺。方法：主要探讨压力、温度、时间、流量、夹带剂等条件对收率的影响，确定超临界CO2萃取柴胡挥发油和皂甙的最佳条件。并将挥发油的超临界CO2萃取法与传统的水蒸气蒸馏法进行比较，同时，用GC/MS法对挥发油进行分离鉴定。结果：挥发油的萃取压力为20 MPa，温度30 ℃;解析釜I压力为12 MPa，温度65 ℃；解析釜Ⅱ压力为6 MPa，温度40 ℃；萃取时间4 h，CO2流量为每1kg原料10～20 kg.h-1。柴胡皂甙的萃取压力是30 MPa,温度65 ℃;解析釜I压力为12 MPa，温度55 ℃；解析釜Ⅱ压力为6 MPa，温度43 ℃；萃取时间3 h，CO2流量为每1kg原料20～25 kg.h-1。结论：超临界CO2提取挥发油比传统法优越，表现在收率大大提高，提取时间短等方面。挥发油由己醛等22个化学成分组成。加入乙醇等夹带剂，并升高压力和温度，才能提出柴胡皂甙。
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Studies on Technology of Supercritical-CO2 Fluid Extraction for Volatile Oils and Saikosaponins in Bupleurum chinense DC.
GE Fa-huan LI Yong XIE Jian-ming LI Qing MA Guo-jun LIN Yi-chao
(Guangzhou Pharmaceutical Industrial Research Institute, Guangzhou 510240, Guangdong, China)
CHEN You-hing
(Guangzhou Xingqun Pharmaceutical Co.Ltd, Guangzhou 510120, Guangdong, China)
, 百拇医药
LI Xiao-fen
(Guangdong School of Pharmaceutical Scieneice, Guangzhou Guangdong 510224,China)
Abstract：Objective: To study the technology of supercritical-CO2 fluid extraction (SFE-CO2) for the volatile oils and saikosaponins in Bupleurum chinense. Method: Exploring the effects of pressure, temperature, extraction time, flow rate of CO2 and entrainers on the yield of the oils and saikosaponin-contained extracts; determining the optimum conditions for SFE-CO2; analyzing the oils by GC/MS and comparing the technology of SFE-CO2 with that of traditional steam distillation. Result: The optimum extraction conditions turned out to be ——for volatile oils: pressure (EP)=20 MPa, temperature (ET)=30 ℃, isolator Ⅰpressure (1P-Ⅰ)=12 MPa, temperature(1T-Ⅰ)=65 ℃, isolator Ⅱ pressure (1P-Ⅱ) =6 MPa, temperature (1T-Ⅱ) =40 ℃, extraction time=4 hours, and CO2 flow rate=10～20 kg.(h.kg)-1 crude drug; for saikosaponins: EP=30 MPa, ET=65 ℃,1PⅠ=12 MPa, 1TⅠ=55 ℃, 1PⅡ=6 MPa,1TⅡ= 43 ℃, extraction time=3 hours, entrainer= 60% ethanol, and CO2 flow rate=20～25 kg.(h.kg)-1 crude drug. Conclusion: SFE-CO2 excels the traditional steam distillation in raising yield and reducing extraction time. The oils are composed of 22 constituents including caproaldehyde, and the saikosaponins can only be extracted with the help of entrainers under higher pressure and temperature.
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Key words：SFE-CO2; Bupleurum chinense; volatile oil; saikosaponin; technological study▲
超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extration，简称SFE)技术是近20年来国际上迅速发展的新一代化工分离技术，已广泛应用于食品、香料、医药等行业[1]。CO2是最常用的超临界流体。超临界CO2萃取(SFE-CO2)应用于中药领域，与传统方法比较，具有许多独特的优点，对实现中药现代化具有重要意义和可观的应用前景[2，3]。
柴胡为伞形科柴胡属植物，具解表、退热、疏肝解郁功能，主治感冒发热，寒热往来，胸肋腹痛等症。其主要有效成分为挥发油和柴胡皂甙。由于柴胡注射液有较好的退热、解表效果，国内许多制药厂家一直用水蒸气蒸馏法提取挥发油制成柴胡注射液。近来有报道，柴胡注射液具有抗抽搐作用，且毒性低，起效时间长，可能会成为一种较好的抗癫痫辅助药，但由于柴胡注射液中挥发油浓度低，用药剂量大[4]。而用传统的水蒸气蒸馏法生产存在产油率低、操作温度高，耗时长等问题。柴胡皂甙有明显的中枢抑制作用和抗炎作用，还具有特异性阻碍胆碱酯酶和显著的利尿作用，对于柴胡皂甙的提取，由于传统工艺温度高、受热时间长，某些柴胡皂甙含量降低或损失殆尽[5]。因而运用临界CO2流体萃取技术来改良柴胡挥发油和皂甙的提取工艺，具有较大的意义。
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1 实验材料、装置与仪器
1.1 实验材料
柴胡购于广州市药材公司，经广州市药材公司周璐珊副主任中药师鉴定为柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根，粉碎成10～20目备用；薄层层析用硅胶G(青岛海洋化工集团公司)；柴胡皂甙a,c,d(上海医药工业研究院)。
1.2 实验装置与仪器
5 L超临界萃取装置(HA-9508型)：广州市医药工业研究所设计,华安超临界萃取有限公司加工生产；HP5988A型GC-MS/MSD气相色谱-质谱联用仪：HP-1 12 m×0.2 mm石英毛细管柱，柱温50～240 ℃，升温速度10 ℃.min-1，进样口温度240 ℃，柱前压20 kPa，载气为氮气。EI离子源，离子温度240 ℃，电子能量70 eV，倍增器高压2 500 V，质量扫描30～400 amu，GC-MS转输线温度240 ℃。
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2 实验方法与步骤
2.1 SFE-CO2法提取工艺的基本流程
将一定量的柴胡干粉投入萃取釜中，对萃取釜、解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ、贮罐分别进行加热或冷却。当达到所选定的温度时，开启CO2气瓶对系统进行加压，当达到所选定的压力时，关闭气瓶，循环萃取，并保持恒温恒压。当达到所选定的萃取时间后，从解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ出料口出料，得柴胡挥发油或皂甙类成分。计算收率，并用GC-MS等方法检测质量。
2.2 柴胡挥发油传统的水蒸气蒸馏法
取一定量同样的柴胡干料，参照《中国药典》(1995年版)方法，用水蒸气蒸馏装置进行蒸馏，得挥发油部分，比重小于1的收率为0.057%，比重大于1的收率为0.18%，总提取时间为12 h，并分析产品质量。
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2.3 柴胡挥发油和皂甙的分析检测
柴胡挥发油分析，参照1.2“实验装置与仪器”项下的气相色谱-质谱联用仪及其分析条件进行；柴胡皂甙用薄层层析法分析：硅胶G板(0.2%羧甲基纤维素钠)，展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水(8∶1.5∶1)，显色剂为2%对二甲氨基苯甲醛-硫酸(40%)。
3 结果
3.1 萃取压力对挥发油收率的影响
实验结果如图1，结果表明，在15～20 MPa，挥发油收率随压力的升高而增加，这是因为随着压力的增加，超临界CO2流体的密度增加，使得溶解度增加。但达到20 MPa时，收率几乎达最大值，此时压力再增加，总提物也会随之而增加，但挥发油的收率却会降低，因为增加压力，扩散系数减少，阻碍传质；同时因为挥发油的含量有限，增加的部分主要是其他杂质成分。因此，最佳萃取压力为20 MPa。
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图1 萃取压力对挥发油收率的影响
3.2 萃取温度对挥发油收率的影响
温度是除了压力以外的另一个十分重要的影响因素。由图2可见，柴胡挥发油收率开始随温度的升高而降低，当温度超过45 ℃时，其收率又随温度的升高而升高。这是由于温度对萃取的影响比较复杂。一般有两种趋势，一方面，流体密度随温度的升高而降低，从而使流体的溶解能力降低；另一方面流体的粘度随着温度的升高而下降，传质加快，有利于萃取。在30～45 ℃，流体密度随温度的升高而降低起主导作用，所以，收率呈下降趋势，在45～60 ℃，流体粘度随温度的升高而下降起主导作用，故收率又呈上升趋势。在最佳萃取压力20 MPa中，30 ℃与60 ℃时的收率相当，由于60 ℃时，产品杂质较多，同时考虑到节约能源问题，所以最佳萃取温度定为30 ℃。
图2 萃取温度对挥发油收率的影响
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3.3 萃取时间对挥发油收率的影响
如图3，随着时间的增加，收率逐渐增高，前2 h增加显著，之后增加缓慢，4 h后几乎萃取完全。时间再增加，出料也甚少。为了提高效率，节省能源，提取时间以4 h为宜。见图3。
图3 萃取时间对挥发油收率的影响
3.4 解析条件对挥发油收率的影响
3.4.1 解析温度的影响 一般来说，只有Ⅰ级解析的情况下，温度升高，密度降低，溶解度下降，解析出来的东西多，即收率升高，纯度降低。但是如有两级解析，固定第Ⅰ级解析温度为40 ℃左右，则第Ⅱ级解析温度变化对总提物收率影响不大，只是影响各级提取物的量和含量分布不同。
3.4.2 解析压力的影响 只有Ⅰ级解析时，压力升高，密度增大，溶解度升高，收率下降，纯度升高。如果是两级解析，固定Ⅱ级压力为6 MPa左右，则Ⅰ级解析的压力变化影响同上。
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具体的解析条件，可根据提取物的具体用途来设定Ⅰ级解析的压力和温度。本实验采用两级分离，由于萃取物为挥发油，只要分离总挥发油即可，所以纯度要求不高。本实验最佳条件为：Ⅰ级解析压力和温度为12 MPa和65 ℃；Ⅱ级解析压力和温度为60 MPa和40 ℃。
3.5 CO2流量对挥发油收率的影响
流量对柴胡挥发油收率影响不太大。一般来说，随着流量增大，会使萃取时间缩短，但CO2的耗量也随之增加，而且CO2与物料接触不够充分，萃取率的提高会趋于饱和。再则，流量过高会使产品未来得及在解析Ⅰ，Ⅱ中析出就被冲回萃取釜而使收率下降。但流量太低，相同时间内收率也较低，要达到相同的萃取效率，必须延长时间，这就使得设备利用率下降，同时增加了耗能。所以，流量不宜太大或过低。本实验中，选择流量为每1 kg原料10～20 kg.h-1。
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3.6 常规法与SFE法挥发油分析及比较
3.6.1 挥发油GC-MS分析比较 将所得挥发油进行GC-MS分析，结果如表1，由表1可以看出，SFE-CO2法和水蒸气蒸馏法得到的挥发油组成相同，只是成分含量有所差异。
表1 柴胡挥发油化学成分组成 峰号
化合物名称
分子式
分子量
水蒸气
/%
水蒸气1)
/%
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SFE-CO2
/%
SFE-CO21)
/%
1
己醛(hexanal)
C6H12O
88
0.08
0.11
0.26
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2
庚醛(heptanal)
C7H14O
102
0.18
0.25
0.12
0.64
3
辛醛(octanal)
C8H16O
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128
0.21
0.29
0.47
2.50
4
戊苯(benzene pentyl)
C11H16
148
0.27
0.38
0.59
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3.13
5
龙脑(borneol)
C10H18O
154
0.73
1.02
0.12
0.64
6
4-萜品醇(terpinen-4-ol)
C10H18O
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154
1.73
2.42
0.46
2.44
7
a-萜品醇(terpinenol)
C10H18O
154
2.79
3.91
0.41
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2.18
8
1，3-异苯呋喃二酮(1，3-isobenyofurandione)
C8H14O3
158
1.01
1.41
0.26
1.38
9
甲基萘(naphthalene,1-methyl)
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C11H10
142
0.86
1.20
0.35
1.86
10
2，4-二烯十二醛(2，4-dodecadienal)
C12H20O
180
1.53
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2.14
0.13
0.69
11
1-苯-戊酮-1(1-pentanonl,1-phenyl)
C11H14O
162
10.69
14.83
0.23
1.22
12
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a-姜黄烯(a-curcumene)
C15H22
202
0.83
1.16
0.31
1.65
13
a-愈创烯(a-guaiene)
C15H24
204
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4.35
6.09
1.20
6.37
14
十五烷(pentadecane)
C15H32
212
1.60
2.24
0.59
3.13
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15
3，7-二甲基-3-辛醇(1-octen-3-ol,3,7-dimethyl)
C10H20O
156
10.58
14.82
0.96
5.10
16
甲基麝香草醚(methyl thymol ether)
C11H16O
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164
9.79
13.71
1.27
6.74
17
丁烯基内酯(butylidene phthalide)
C12H12O2
188
11.76
16.47
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9.40
18
藁本内酯(ligustilide)
C12H14O2
190
4.50
6.30
0.47
2.50
19
棕榈酸(palmitic acid)
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C16H32O2
256
18.47
31.20
20
亚油酸(linoleic acid)
C18H32O2
280
4.05
27.15
21
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油酸(oleic acid)
C18H34O2
282
3.09
18.44
22
硬酯酸(stearic acid)
C18H36O2
284
2.95
4.38
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注：1)扣除脂肪酸
3.6.2 两种挥发油提取工艺的比较(见表2)
表2 挥发油SFE-CO2法和水蒸气蒸馏法工艺比较 方法
外观性状
收率/%
t/h
SFE-CO2
黄褐色
1.86
4
水蒸气蒸馏
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淡黄色
0.24
12
由表2可见，SFE-CO2法同水蒸气蒸馏法比较，前者收率大大提高，提取时间缩短。
3.7 含柴胡皂甙类极性成分的提取
在实验过程中，证明了柴胡在较温和的压力和温度下，不加夹带剂而得到的非挥发油部分不含皂甙。因此，柴胡提取挥发油后，紧接着提高系统的温度和压力并加入夹带剂，对柴胡皂甙的超临界CO2提取进行了研究。通过薄层层析对提取物进行检测，发现可将柴胡皂甙提取出来，结果见图4。进而探讨压力、温度和夹带剂等条件对其提取的影响。
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图4 柴胡SFE-CO2提取物的TLC图谱
A.SFE-CO2+50%乙醇 B.SFE-CO2+60%乙醇
C.SFE-CO2+70%乙醇 D.SFE-CO2+95%乙醇
E.SFE-CO2+乙酸乙酯 F.SFE-CO2+甲醇
1.柴胡皂甙d 2.柴胡皂甙a 3.柴胡皂甙c
3.7.1 夹带剂对柴胡皂甙提取的影响 对于柴胡皂甙SFE-CO2提取，夹带剂是最重要的影响因素。本实验选用了不同浓度的乙醇、乙酸乙酯和甲醇作夹带剂，比较它们的收率，发现95%乙醇其总提物收率最高，但从TLC检测中看出，它只能提出柴胡皂甙a，d，但提不出柴胡皂甙c，而60%或70%乙醇能将a，c，d提出。因此从收率和皂甙等方面考虑，采用60%乙醇作夹带剂。见图4、图5。
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图5 夹带剂对柴胡皂甙提取收率的影响
1.50%乙醇 2.60%乙醇 3.70%乙醇
4.95%乙醇 5.甲醇 6.乙酸乙酯
3.7.2 压力对柴胡皂甙提物的影响 由图6可见，柴胡皂甙粗品的收率在20～30 MPa时随着压力的升高而升高，当压力为30 MPa时，收率达最大值，随后压力增大，收率降低。所以从设备和收率及皂甙方面考虑，萃取压力选择30 MPa。
图6 压力对柴胡皂甙提取收率的影响
3.7.3 温度对柴胡皂甙提取的影响 如图7，在30～45 ℃，随温度的升高，柴胡皂甙粗品收率下降，当超过45 ℃时，收率随着萃取温度的增加而升高。从收率、皂甙及能耗等方面考虑，萃取温度为65 ℃左右为宜。
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图7 温度对柴胡皂甙提取收率的影响
4 小结与讨论
4.1 超临界CO2从柴胡中提取柴胡挥发油的最佳条件是：萃取压力为20 MPa，温度30 ℃;解析釜Ⅰ压力为12 MPa,温度65 ℃;解析釜Ⅱ压力为6 MPa,温度40℃，萃取时间4 h。
4.2 用SFE-CO2法提取柴胡挥发油，与传统的水蒸气蒸馏法相比较，能大大提高收率，缩短提取时间。
4.3 SFE-CO2法挥发油组成和水蒸气法一致，均由己醛等22个成分组成,只是各成分含量有差异。
4.4 超临界CO2从柴胡中提取含柴胡皂甙粗品的最佳条件是：萃取压力30 MPa，温度65 ℃;解析釜Ⅰ的压力12 MPa,温度55 ℃；解析釜Ⅱ的压力6 MPa，温度43 ℃;萃取时间3 h，夹带剂为60%乙醇。
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4.5 用超临界CO2萃取进行柴胡主要有效成分的萃取工艺研究尚未见报道。本实验的结果表明，用SFE-CO2提取柴胡挥发油是可行的。同时能将柴胡皂甙提取出来。
参考文献：
[1]葛发欢，李 菁，王海波，等.超临界CO2流体萃取技术在天然产物提取及药物分析中的最新研究进展和前景.中药材，1995，18(6)：316.
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收稿日期：1999-08-24, 百拇医药