成年型多囊肾病家系成员的症前基因诊断
作者：廖启洪 陈秀强 温黎清 贺 平 陈廷波 何冰玲
单位：廖启洪 陈秀强 温黎清 贺 平 陈廷波 何冰玲 柳州市人民医院
关键词：聚合酶链反应；多囊肾；基因诊断
广西医学990110
摘要 目的：应用PCR方法对常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)家系进行症前基因诊断。方法：用PCR扩增与PKD1位点连锁的的高度多态性的微小卫星体DNA(SM7，AC2.5，KG8，CW2)为遗传标记，对10个ADPKD家系的104个成员(包括28个患者)找出染色体上与疾病连锁的单体型，进行连锁分析。结果：对9个无临床症状，且B超检查呈阴性结果的儿童做出了症前基因诊断。结论：能够应用PCR方法对ADPKD家系成员快速、准确地做出基因诊断。
成年型多囊肾病(Adult polycystic kidney disease, APKD)是最常见的单基因遗传病之一，国外报道其发病率约为1‰，约有50%的患者将发展成肾功能衰竭(1)，占终末肾病患者的10%(2)，是成人肾衰的常见的原因之一。中国尚无这方面的统计资料，为了解APKD的遗传情况和探讨对APKD家系成员进行症前基因诊断的方法，我们应用PCR技术扩增与PKD1位点紧密连锁的微小卫星体DNA遗传标记，进行基因连锁的家系分析，现将结果报道如下。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象：APKD家系成员来自我院肾病专科门诊，共10个家系104个成员，其中男性57例，女性47例，年龄2～73岁，诊断时平均年龄41.6岁。
1.2 患者均行血、尿常规检查、B超检查，APKD诊断依据是B超示双侧肾脏的皮质和髓质有充满液体的囊肿，或单侧肾脏囊肿数≥5个；小儿双肾囊肿数之和≥5个者；具有APKD的家族史。
1.3 DNA分离：取静脉血5ml，ACD抗凝，分离白细胞，蛋白酶K水解后用盐析法(3)除去蛋白质，DNA溶于TE溶液备用。
1.4 引物：由北医大肾病研究所朱世乐教授惠赠。引物序列为：KG8：(F8)5′-CTC CCA GGG TGG AGG AAG GTG-3′(R6)5′-GCA GGC ACA GCC AGC TCC GAG-3′ AC2.5：(GT)5′-GCA GCC TCA GTT GTG TTT CCT AAT C-3′ (AC)5′-AGT GCT GGG ATT ACA GGC ATG AAC C-3′ SM7：(TG)5′-ACA TAT GTA GTC TTC TGC AGG-3′ 5′-ACA AGA GTG AAT CTG TAG CAG-3′ CW2： (A)5′-GTC TTT CTA GGA ATG AAA TCA T-3′ (B)5′-ATT GCA GCA AGA CTC CAT CT-3′
, 百拇医药
1.5 试剂：dNTP、Taq酶、MgCl2及反应缓冲液均购自Promega公司。
1.6 PCR条件：体积25μl，引物各10pmol、dNTP各200μmol/L,MgCl21.5mmol/L，DNA模板80-100ng，Taq酶1单位。先95℃变性5min，然后进行循环(变性94℃1min→退火温度分别为SM7 75℃， AC2.5 60℃， KG8 56℃， CW2 52℃；1min→延伸72℃ 1min)。35个循环后72℃ 10min。
1.7 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物后银染显色，分析结果。
2 结果
笔者对每个ADPKD家系均采用三个以上位于16染色体短臂PKD1位点区域的微小卫星DNA为遗传记进行基因连锁分析，找出家系成员染色体上与PKD1连锁的单体型，对10个家系104名成员中的96名个体进行基因检测，对72名有血缘关系的成员(含28例患者)进行基因诊断：28名经B超确诊的患者基因诊断相符；44例B超无多囊肾的个体有9例携带PKD1致病基因，可作出多囊肾症前诊断，35例为正常个体(详见表1)。
, 百拇医药
表1 10个ADPKD家系基因连锁分析结果 序
号
人
数
B超
检查
基因
检测
B超有多囊肾
B超无多囊肾
B超
多囊肾
基因诊断
, 百拇医药
多囊肾
无血缘
有血缘
基因诊断
多囊肾
基因诊断
无多囊肾
Ⅰ
10
10
7
2
2
, http://www.100md.com 3
5
1
4
Ⅱ
6
6
6
2
2
2
2
1
1
, http://www.100md.com
Ⅲ
13
13
11
3
3
5
5
1
4
Ⅳ
17
17
16
, http://www.100md.com
2
2
6
9
0
9
Ⅴ
6
6
5
3
3
2
1
, 百拇医药
1
0
Ⅵ
4
4
4
3
3
1
0
0
0
Ⅶ
12
, 百拇医药
12
12
4
4
3
5
1
4
Ⅷ
21
21
20
3
3
, http://www.100md.com
6
12
1
11
Ⅸ
7
7
7
3
3
2
2
2
0
, http://www.100md.com
Ⅹ
8
8
8
3
3
2
3
1
2
合计
104
104
96
, 百拇医药
28
28
32
44
9
35
3 讨论
对有发病风险的ADPKD家系成员进行准确的产前和症前诊断是阻断其遗传、降低发病率、实现优生优育的关键。临床对APKD的诊断主要靠B超，而APKD是一种延迟性遗传病，加上超声诊断仪分辨率的限制，PKD1基因携带者的超声诊断阳性率0～14岁为64%，10～30岁为92%，30岁以上才能达到100%(4)。影像学检查不能早期完全排除APKD，更无法进行产前诊断。因此，需要使用更准确的诊断方法——基因诊断。
, 百拇医药
目前发现与PKD1紧密连锁的(AC)n微卫星较多，其中多态性较好的SM7，AC2.5，SM6，CW2已广泛用于PKD1的基因诊断、本研究选用了SM7，AC2.5，KG8，CW2微小卫星体对APKD10个家系104个成员中的72名个体进行基因诊断，其中对9名无症状，B超无多囊肾的个体作出了症前基因诊断，从现在开始进行医疗监护，定期检查肾功能，尿中RBC，控制感染，控制血压。婚后对他们的后代进行产前诊断，对携带有致病基因的胎儿终止妊娠，降低发病率，达到优生优育，避免患病后发展到肾衰而花费大量的资金进行透析和肾移植，减轻家庭和社会的负担。另有3名肾囊肿患者经基因检测，排除是多囊肾病，指导了临床的治疗。
本研究在北医大一附院朱世乐、白千帆指导下完成，特此致谢。
参 考 文 献
[1] 刘玉春，张 宠，钟宏琳，等.成人多囊肾病多器官损害205例临床分析.中华内科杂志 1995；34(9)：612
, 百拇医药
[2] Vickie LH, Jeanne RH, Keith J, et al. Presymptomatic testing for adult onset polycystic kidney disease in atrist kidney transplant. Am J Med Genet 1991;40:425
[3] 朱世乐，张 宏，白千帆，等.应用PCR技术进行常染色体显性遗传多囊肾病家系基因诊断.北京医科大学学报 1996；28(6)：419
[4] Bear JC, Parfrey PS et al. Autosomal dominant polycystic kidney disenses: New information for genetic connselling. AM J Med Genet 1992;42:548, 百拇医药
单位：廖启洪 陈秀强 温黎清 贺 平 陈廷波 何冰玲 柳州市人民医院
关键词：聚合酶链反应；多囊肾；基因诊断
广西医学990110
摘要 目的：应用PCR方法对常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)家系进行症前基因诊断。方法：用PCR扩增与PKD1位点连锁的的高度多态性的微小卫星体DNA(SM7，AC2.5，KG8，CW2)为遗传标记，对10个ADPKD家系的104个成员(包括28个患者)找出染色体上与疾病连锁的单体型，进行连锁分析。结果：对9个无临床症状，且B超检查呈阴性结果的儿童做出了症前基因诊断。结论：能够应用PCR方法对ADPKD家系成员快速、准确地做出基因诊断。
成年型多囊肾病(Adult polycystic kidney disease, APKD)是最常见的单基因遗传病之一，国外报道其发病率约为1‰，约有50%的患者将发展成肾功能衰竭(1)，占终末肾病患者的10%(2)，是成人肾衰的常见的原因之一。中国尚无这方面的统计资料，为了解APKD的遗传情况和探讨对APKD家系成员进行症前基因诊断的方法，我们应用PCR技术扩增与PKD1位点紧密连锁的微小卫星体DNA遗传标记，进行基因连锁的家系分析，现将结果报道如下。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象：APKD家系成员来自我院肾病专科门诊，共10个家系104个成员，其中男性57例，女性47例，年龄2～73岁，诊断时平均年龄41.6岁。
1.2 患者均行血、尿常规检查、B超检查，APKD诊断依据是B超示双侧肾脏的皮质和髓质有充满液体的囊肿，或单侧肾脏囊肿数≥5个；小儿双肾囊肿数之和≥5个者；具有APKD的家族史。
1.3 DNA分离：取静脉血5ml，ACD抗凝，分离白细胞，蛋白酶K水解后用盐析法(3)除去蛋白质，DNA溶于TE溶液备用。
1.4 引物：由北医大肾病研究所朱世乐教授惠赠。引物序列为：KG8：(F8)5′-CTC CCA GGG TGG AGG AAG GTG-3′(R6)5′-GCA GGC ACA GCC AGC TCC GAG-3′ AC2.5：(GT)5′-GCA GCC TCA GTT GTG TTT CCT AAT C-3′ (AC)5′-AGT GCT GGG ATT ACA GGC ATG AAC C-3′ SM7：(TG)5′-ACA TAT GTA GTC TTC TGC AGG-3′ 5′-ACA AGA GTG AAT CTG TAG CAG-3′ CW2： (A)5′-GTC TTT CTA GGA ATG AAA TCA T-3′ (B)5′-ATT GCA GCA AGA CTC CAT CT-3′
, 百拇医药
1.5 试剂：dNTP、Taq酶、MgCl2及反应缓冲液均购自Promega公司。
1.6 PCR条件：体积25μl，引物各10pmol、dNTP各200μmol/L,MgCl21.5mmol/L，DNA模板80-100ng，Taq酶1单位。先95℃变性5min，然后进行循环(变性94℃1min→退火温度分别为SM7 75℃， AC2.5 60℃， KG8 56℃， CW2 52℃；1min→延伸72℃ 1min)。35个循环后72℃ 10min。
1.7 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物后银染显色，分析结果。
2 结果
笔者对每个ADPKD家系均采用三个以上位于16染色体短臂PKD1位点区域的微小卫星DNA为遗传记进行基因连锁分析，找出家系成员染色体上与PKD1连锁的单体型，对10个家系104名成员中的96名个体进行基因检测，对72名有血缘关系的成员(含28例患者)进行基因诊断：28名经B超确诊的患者基因诊断相符；44例B超无多囊肾的个体有9例携带PKD1致病基因，可作出多囊肾症前诊断，35例为正常个体(详见表1)。
, 百拇医药
表1 10个ADPKD家系基因连锁分析结果 序
号
人
数
B超
检查
基因
检测
B超有多囊肾
B超无多囊肾
B超
多囊肾
基因诊断
, 百拇医药
多囊肾
无血缘
有血缘
基因诊断
多囊肾
基因诊断
无多囊肾
Ⅰ
10
10
7
2
2
, http://www.100md.com 3
5
1
4
Ⅱ
6
6
6
2
2
2
2
1
1
, http://www.100md.com
Ⅲ
13
13
11
3
3
5
5
1
4
Ⅳ
17
17
16
, http://www.100md.com
2
2
6
9
0
9
Ⅴ
6
6
5
3
3
2
1
, 百拇医药
1
0
Ⅵ
4
4
4
3
3
1
0
0
0
Ⅶ
12
, 百拇医药
12
12
4
4
3
5
1
4
Ⅷ
21
21
20
3
3
, http://www.100md.com
6
12
1
11
Ⅸ
7
7
7
3
3
2
2
2
0
, http://www.100md.com
Ⅹ
8
8
8
3
3
2
3
1
2
合计
104
104
96
, 百拇医药
28
28
32
44
9
35
3 讨论
对有发病风险的ADPKD家系成员进行准确的产前和症前诊断是阻断其遗传、降低发病率、实现优生优育的关键。临床对APKD的诊断主要靠B超，而APKD是一种延迟性遗传病，加上超声诊断仪分辨率的限制，PKD1基因携带者的超声诊断阳性率0～14岁为64%，10～30岁为92%，30岁以上才能达到100%(4)。影像学检查不能早期完全排除APKD，更无法进行产前诊断。因此，需要使用更准确的诊断方法——基因诊断。
, 百拇医药
目前发现与PKD1紧密连锁的(AC)n微卫星较多，其中多态性较好的SM7，AC2.5，SM6，CW2已广泛用于PKD1的基因诊断、本研究选用了SM7，AC2.5，KG8，CW2微小卫星体对APKD10个家系104个成员中的72名个体进行基因诊断，其中对9名无症状，B超无多囊肾的个体作出了症前基因诊断，从现在开始进行医疗监护，定期检查肾功能，尿中RBC，控制感染，控制血压。婚后对他们的后代进行产前诊断，对携带有致病基因的胎儿终止妊娠，降低发病率，达到优生优育，避免患病后发展到肾衰而花费大量的资金进行透析和肾移植，减轻家庭和社会的负担。另有3名肾囊肿患者经基因检测，排除是多囊肾病，指导了临床的治疗。
本研究在北医大一附院朱世乐、白千帆指导下完成，特此致谢。
参 考 文 献
[1] 刘玉春，张 宠，钟宏琳，等.成人多囊肾病多器官损害205例临床分析.中华内科杂志 1995；34(9)：612
, 百拇医药
[2] Vickie LH, Jeanne RH, Keith J, et al. Presymptomatic testing for adult onset polycystic kidney disease in atrist kidney transplant. Am J Med Genet 1991;40:425
[3] 朱世乐，张 宏，白千帆，等.应用PCR技术进行常染色体显性遗传多囊肾病家系基因诊断.北京医科大学学报 1996；28(6)：419
[4] Bear JC, Parfrey PS et al. Autosomal dominant polycystic kidney disenses: New information for genetic connselling. AM J Med Genet 1992;42:548, 百拇医药