SiO2粉尘对肺泡巨噬细胞膜性质影响的实验研究
作者：张卓 张琪风 杜英杰
单位：浙江医科大学尘肺研究室 (杭州 310031)
关键词：
卫生毒理学杂志990214 矽肺的发生发展是多因素相互作用的结果。目前一般认为，SiO2粉尘被肺泡巨噬细胞(AMS)吞噬后，导致AMS受损、死亡，是矽肺发病的重要原因[1]。随着膜毒理学的发展，进一步证实了SiO2粉尘作用AMS后，在生物物理、生物化学、膜成分以及形态结构等方面都发生了变化[2]。采用体外细胞培养方法，检测了AMS的乳酸脱氢酶(LDH)活性、K+和丙二醛(MDA)含量及荧光偏振度P，分析了SiO2粉尘对AMS膜通透性、脂质过氧化及流动性的影响，找出较敏感、简便、迅速反映膜毒性的指标。
, 百拇医药 材料与方法
一、材料
1.实验动物：由本校实验动物中心提供的健康、雄性Wistar大鼠，体重(200±20)克，鼠龄3个月左右。
2.SiO2粉尘悬液：采用中国预防医学科学院劳研所提供的标准SiO2粉尘。恒重干燥后，配成一定浓度的SiO2粉尘悬液。
3.荧光探剂：1，6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)，用四氢呋喃配成2×10-3mol/L的储备液，实验前配成2×10-6mol/L的应用液。
二、分组与方法
1.AMS的收集与培养：大鼠股动脉放血处死，取支气管和肺脏，在无菌条件下进行支气管肺泡冲洗，收集AMS。用PRMI1640培养液配成一定浓度的细胞悬液，在5% CO2孵箱中进行培养。
, 百拇医药
2.剂量-效应关系：分为5组：(1)正常对照组；(2)50μg/ml SiO2组；(3)100μg/ml SiO2组；(4)200μg/ml SiO2组；(5)400μg/ml SiO2组。4小时后终止培养。
3.时间-效应关系：加入100μg/ml SiO2悬液，分别培养2，4，8和16小时。
4.LDH的测定,采用2，4-二硝基苯肼法。
5.K+含量的测定：细胞浓度为1×106/ml。终止培养后，用去离子水冲洗4次，37℃恒温干燥后，加去离子水1.0ml，低温冰箱反复冻融，直至细胞全部破碎。于Video 22火焰原子吸收分光光度计测定细胞内K+含量。
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6.MDA含量测定：细胞浓度为2×106/ml。采用TBA法[2]，于754紫外分光光度计，λ=532nm比色，读取A值。
7.荧光偏振度P的测定：细胞浓度为2×106/ml。取纯化的细胞悬液1.5ml,加入2×10-6mol/L DPH的PBS 1.5ml，37℃震荡水浴20分，RF540荧光分光光度计测定P。
结果
一、不同剂量的SiO2粉尘对AM膜通透性、脂质过氧化及流动性的影响
由表1可见，100～400μg/ml SiO2组与正常对照组比较，P<0.05，差异有显著性。且随着SiO2剂量的增加，LDH活性升高，AMS内K+含量减少，MDA生成则增加，P值降低，经直线回归分析存在明显的剂量-效应关系。
, 百拇医药
表1 不同剂量的SiO2粉尘对AM膜LDH、K+和MDA含量及P值的影响(
±s) 组别(μg/ml)
LDH(U)
K+含量(mg/1010AM)
MDA含量(A值)
P
50
70.06±7.80*
25.00±4.74
0.0185±0.0006*
, 百拇医药
0.250±0.009*
100
106.99±14.83*
21.14±2.03*
0.0200±0.0007*
0.236±0.003*
200
165.81±11.45*
13.15±3.55*
0.0347±0.0009*
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0.222±0.004*
400
228.73±9.18*
8.06±1.62*
0.0431±0.0006*
0.199±0.005*
正常对照组
42.70±7.80
27.42±2.56
0.0160±0.0003
, http://www.100md.com
0.365±0.037
与正常对照组比较，*P<0.05
二、SiO2粉尘对不同培养时间的AMS膜通透性、脂质过氧化及流动性的影响
由表2可见，不同的培养时间与正常对照组比较，LDH活性、K+含量(除2小时组外)和MDA生成差异都有显著性。随着培养时间的延长，LDH活性升高，K+含量下降，MDA生成增多(16小时组除外)。经直线回归分析，有明显的时间-效应关系。
表2 不同培养时间SiO2粉尘对AM膜LDH、K+和MDA含量及P值的影响(±s) 组 别
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LDH(U)
K+含量(mg/1010AM)
MDA含量(A值)
SiO2组
2小时组
74.16±10.80*
25.65±0.64
0.0178±0.0006*
4小时组
106.99±14.83*
, http://www.100md.com
21.14±2.03*
0.0200±0.0007*
8小时组
175.38±13.16*
17.03±0.85*
0.0227±0.0009*
16小时组
200.01±13.33*
11.42±1.02*
0.0225±0.0012*
, 百拇医药
正常对照组
42.70±7.80
27.24±2.56
0.0160±0.0003
与正常对照组比较 *P<0.05
讨 论
研究表明，SiO2粉尘对生物膜呈现广泛的损伤作用，引起膜生物物理、生物化学以及形态结构等一系列改变，最终导致细胞死亡。SiO2致AMS的细胞毒性有多种表现，其中K+含量的变化是细胞中毒后的一种早期反应[3]。LDH是胞浆标记酶，细胞膜受损后被释出，是反映膜损伤的较敏感指标。本实验结果表明50μg/ml的SiO2粉尘即可使AMS的LDH活性发生改变，100μg/ml的SiO2粉尘可使K+含量发生明显的降低，随着剂量的增加和培养时间的延长，LDH活性升高，K+含量降低，有明显的剂量-效应关系和时间-效应关系。
, 百拇医药
矽肺发病过程中，脂质过氧化参与AMS的细胞损伤。丙二醛是脂质过氧化的终产物，能改变膜的流动性、交联、结构和功能，增加膜的脆性，最终导致膜的破坏[4]。本实验结果显示，SiO2粉尘确实能引起膜的脂质过氧化。呈现剂量-效应关系和时间-效应关系。
荧光偏振度P与膜流动性的关系是，P值越小表示膜流动性越大。本实验结果表明，随着SiO2粉尘剂量的增加，P值减少，膜流动性增加，存在剂量-效应关系。
综上所述，MDA含量的增多与胞浆标记酶LDH释放增多相平行，表明SiO2引发的脂质过氧化与其细胞毒性相一致。脂质过氧化可引起磷脂成分与比例的变化，导致膜磷脂组分粘度增加，流动性下降，通透性增高，造成细胞形态和功能的变化。脂质过氧化还可破坏依赖于磷脂并与膜结合的酶活性，造成细胞代谢异常，最终引起细胞死亡。因而，本实验结果认为LDH、K+和MDA含量及P值都不失为反映膜损伤程度较敏感的指标。
, 百拇医药
参考文献
1.Heppleston AG,et al.Cellular reactions with silica in biochemistry of silicon and related problems.Edited by G.Bendz,et al.Plenum,New York,1978,357.
2.曹承敬.SiO2及柠檬酸铝对豚鼠肺泡巨噬细胞膜流动性影响的研究.中华劳动卫生职业病杂志，1984，2(2)：86.
3.曹承敬.SiO2和TiO2对豚鼠肺泡巨噬细胞K+通透性影响的比较研究.工业卫生与职业病，1985，11(4)：201.
4.Vallythan V,et al.Generation of free radical from freshly fractured silica dust.Potential role in acute silicainduced lung injury.Am.Rev.Respir.Dis,1988,138:1213.
(修回日期 1998年8月), 百拇医药
单位：浙江医科大学尘肺研究室 (杭州 310031)
关键词：
卫生毒理学杂志990214 矽肺的发生发展是多因素相互作用的结果。目前一般认为，SiO2粉尘被肺泡巨噬细胞(AMS)吞噬后，导致AMS受损、死亡，是矽肺发病的重要原因[1]。随着膜毒理学的发展，进一步证实了SiO2粉尘作用AMS后，在生物物理、生物化学、膜成分以及形态结构等方面都发生了变化[2]。采用体外细胞培养方法，检测了AMS的乳酸脱氢酶(LDH)活性、K+和丙二醛(MDA)含量及荧光偏振度P，分析了SiO2粉尘对AMS膜通透性、脂质过氧化及流动性的影响，找出较敏感、简便、迅速反映膜毒性的指标。
, 百拇医药 材料与方法
一、材料
1.实验动物：由本校实验动物中心提供的健康、雄性Wistar大鼠，体重(200±20)克，鼠龄3个月左右。
2.SiO2粉尘悬液：采用中国预防医学科学院劳研所提供的标准SiO2粉尘。恒重干燥后，配成一定浓度的SiO2粉尘悬液。
3.荧光探剂：1，6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)，用四氢呋喃配成2×10-3mol/L的储备液，实验前配成2×10-6mol/L的应用液。
二、分组与方法
1.AMS的收集与培养：大鼠股动脉放血处死，取支气管和肺脏，在无菌条件下进行支气管肺泡冲洗，收集AMS。用PRMI1640培养液配成一定浓度的细胞悬液，在5% CO2孵箱中进行培养。
, 百拇医药
2.剂量-效应关系：分为5组：(1)正常对照组；(2)50μg/ml SiO2组；(3)100μg/ml SiO2组；(4)200μg/ml SiO2组；(5)400μg/ml SiO2组。4小时后终止培养。
3.时间-效应关系：加入100μg/ml SiO2悬液，分别培养2，4，8和16小时。
4.LDH的测定,采用2，4-二硝基苯肼法。
5.K+含量的测定：细胞浓度为1×106/ml。终止培养后，用去离子水冲洗4次，37℃恒温干燥后，加去离子水1.0ml，低温冰箱反复冻融，直至细胞全部破碎。于Video 22火焰原子吸收分光光度计测定细胞内K+含量。
, http://www.100md.com
6.MDA含量测定：细胞浓度为2×106/ml。采用TBA法[2]，于754紫外分光光度计，λ=532nm比色，读取A值。
7.荧光偏振度P的测定：细胞浓度为2×106/ml。取纯化的细胞悬液1.5ml,加入2×10-6mol/L DPH的PBS 1.5ml，37℃震荡水浴20分，RF540荧光分光光度计测定P。
结果
一、不同剂量的SiO2粉尘对AM膜通透性、脂质过氧化及流动性的影响
由表1可见，100～400μg/ml SiO2组与正常对照组比较，P<0.05，差异有显著性。且随着SiO2剂量的增加，LDH活性升高，AMS内K+含量减少，MDA生成则增加，P值降低，经直线回归分析存在明显的剂量-效应关系。
, 百拇医药
表1 不同剂量的SiO2粉尘对AM膜LDH、K+和MDA含量及P值的影响(
±s) 组别(μg/ml)LDH(U)
K+含量(mg/1010AM)
MDA含量(A值)
P
50
70.06±7.80*
25.00±4.74
0.0185±0.0006*
, 百拇医药
0.250±0.009*
100
106.99±14.83*
21.14±2.03*
0.0200±0.0007*
0.236±0.003*
200
165.81±11.45*
13.15±3.55*
0.0347±0.0009*
, http://www.100md.com
0.222±0.004*
400
228.73±9.18*
8.06±1.62*
0.0431±0.0006*
0.199±0.005*
正常对照组
42.70±7.80
27.42±2.56
0.0160±0.0003
, http://www.100md.com
0.365±0.037
与正常对照组比较，*P<0.05
二、SiO2粉尘对不同培养时间的AMS膜通透性、脂质过氧化及流动性的影响
由表2可见，不同的培养时间与正常对照组比较，LDH活性、K+含量(除2小时组外)和MDA生成差异都有显著性。随着培养时间的延长，LDH活性升高，K+含量下降，MDA生成增多(16小时组除外)。经直线回归分析，有明显的时间-效应关系。
表2 不同培养时间SiO2粉尘对AM膜LDH、K+和MDA含量及P值的影响(
±s) 组 别, http://www.100md.com
LDH(U)
K+含量(mg/1010AM)
MDA含量(A值)
SiO2组
2小时组
74.16±10.80*
25.65±0.64
0.0178±0.0006*
4小时组
106.99±14.83*
, http://www.100md.com
21.14±2.03*
0.0200±0.0007*
8小时组
175.38±13.16*
17.03±0.85*
0.0227±0.0009*
16小时组
200.01±13.33*
11.42±1.02*
0.0225±0.0012*
, 百拇医药
正常对照组
42.70±7.80
27.24±2.56
0.0160±0.0003
与正常对照组比较 *P<0.05
讨 论
研究表明，SiO2粉尘对生物膜呈现广泛的损伤作用，引起膜生物物理、生物化学以及形态结构等一系列改变，最终导致细胞死亡。SiO2致AMS的细胞毒性有多种表现，其中K+含量的变化是细胞中毒后的一种早期反应[3]。LDH是胞浆标记酶，细胞膜受损后被释出，是反映膜损伤的较敏感指标。本实验结果表明50μg/ml的SiO2粉尘即可使AMS的LDH活性发生改变，100μg/ml的SiO2粉尘可使K+含量发生明显的降低，随着剂量的增加和培养时间的延长，LDH活性升高，K+含量降低，有明显的剂量-效应关系和时间-效应关系。
, 百拇医药
矽肺发病过程中，脂质过氧化参与AMS的细胞损伤。丙二醛是脂质过氧化的终产物，能改变膜的流动性、交联、结构和功能，增加膜的脆性，最终导致膜的破坏[4]。本实验结果显示，SiO2粉尘确实能引起膜的脂质过氧化。呈现剂量-效应关系和时间-效应关系。
荧光偏振度P与膜流动性的关系是，P值越小表示膜流动性越大。本实验结果表明，随着SiO2粉尘剂量的增加，P值减少，膜流动性增加，存在剂量-效应关系。
综上所述，MDA含量的增多与胞浆标记酶LDH释放增多相平行，表明SiO2引发的脂质过氧化与其细胞毒性相一致。脂质过氧化可引起磷脂成分与比例的变化，导致膜磷脂组分粘度增加，流动性下降，通透性增高，造成细胞形态和功能的变化。脂质过氧化还可破坏依赖于磷脂并与膜结合的酶活性，造成细胞代谢异常，最终引起细胞死亡。因而，本实验结果认为LDH、K+和MDA含量及P值都不失为反映膜损伤程度较敏感的指标。
, 百拇医药
参考文献
1.Heppleston AG,et al.Cellular reactions with silica in biochemistry of silicon and related problems.Edited by G.Bendz,et al.Plenum,New York,1978,357.
2.曹承敬.SiO2及柠檬酸铝对豚鼠肺泡巨噬细胞膜流动性影响的研究.中华劳动卫生职业病杂志，1984，2(2)：86.
3.曹承敬.SiO2和TiO2对豚鼠肺泡巨噬细胞K+通透性影响的比较研究.工业卫生与职业病，1985，11(4)：201.
4.Vallythan V,et al.Generation of free radical from freshly fractured silica dust.Potential role in acute silicainduced lung injury.Am.Rev.Respir.Dis,1988,138:1213.
(修回日期 1998年8月), 百拇医药