p16基因产物在卵巢恶性生殖细胞肿瘤中的表达
作者：高国兰 彭芝兰 王和 陈爱平 姚先莹
单位：610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科(高国兰，彭芝兰，王和，陈爱平)，病理科(姚先莹)
关键词：
中华妇产科杂志980517 p16基因的编码蛋白可特异性抑制CDK4激酶(cyclin dependet kinase 4 )活性而影响细胞周期的调控。由于p16基因这一重要的生物学功能以及在多种肿瘤细胞系中有高频率纯合缺失[1]，因而成为肿瘤基础理论和临床研究的热点之一。有关p16基因在上皮性卵巢癌实体瘤组织及细胞表达的研究仅有少许报道，本研究采用抗p16蛋白的多克隆抗体对卵巢恶性生殖细胞肿瘤的p16蛋白表达进行了研究。以探讨p16基因与生殖细胞肿瘤发生发展的关系。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.材料：取自1975～1995年本院妇科手术切除经石蜡包埋存档的标本，共102例。其中因子宫良性病变而行卵巢切除或活组织检查的正常卵巢组织20例。卵巢恶性生殖细胞肿瘤82例，其中内胚窦瘤31例，无性细胞瘤9例，未成熟畸胎瘤25例，原发性绒癌2例，混合性生殖细胞肿瘤15例。所有纳入对象于标本采取前均未接受放疗及化疗，临床及病理资料完整。
p16多克隆抗体为美国Santa Cruz生物技术公司产品，ABC试剂盒由华美生物技术有限公司提供。
2.方法：首先由妇科病理学专家复查HE切片，确定肿瘤的组织学类型和分级。p16多克隆抗体的工作浓度为1∶100，切片经蛋白酶及微波处理，然后严格按ABC法进行染色[2]。
ABC染色：5 μm厚石蜡切片60℃下处理24小时，37℃下处理24～48小时；二甲苯脱蜡；0.3%过氧化氢-甲醛浸泡30分钟；蛋白酶K 37℃下消化20分钟；在0.01 mol柠檬酸钠(pH 6.1)中用微波处理5分钟；小牛血清封闭20分钟；加一抗后在4℃下过夜；加二抗后37℃下30分钟；加ABC复合物，37℃下30分钟后加DAB，进行显色，苏木素复染。
, 百拇医药
用已知p16阳性的肿瘤组织切片作阳性对照，已知p16阴性的肿瘤组织切片作阴性对照。以细胞浆内是否出现棕黄色颗粒判定阳性或阴性[3]。
3.统计学处理：率的比较采用χ2检验，生存率分析采用Kaplan Meier及对数秩检验。
二、结果
1.p16蛋白在正常组织和恶性肿瘤组织的表达：p16蛋白表达主要定位于细胞浆，少数定位于细胞核和胞膜(附图)。在20例正常卵巢组织中，19例表达阳性(95.0%)；在生殖细胞肿瘤不同组织学类型的表达情况见表1。
除原发绒癌例数太少，未计算百分数和纳入统计外，余4组经多个样本率统计分析，差异无显著性(P>0.05)。
2.p16蛋白表达与肿瘤临床分期的关系：从表2可见，p16蛋白表达在Ⅰ～Ⅱ期患者高于Ⅲ～Ⅳ期患者，但经统计学处理，差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
3.p16蛋白表达与肿瘤预后的关系：随访82例患者，获完整随访资料者69例，随访率84.4%。其中死亡20例。对这69例行Kaplan Meier生存曲线分析，经Log-rank检验，显示p16蛋白表达阳性组患者的生存曲线明显高于p16蛋白表达阴性组，阳性组的生存期明显长于阴性组。
表1 不同肿瘤组织中p16蛋白表达的情况
肿瘤类别
总例数
年龄
(岁)
临床分期(例数)
p16蛋白表达阳性
Ⅰ
, 百拇医药
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
例数
百分率(%)
内胚窦瘤
31
22.0
1
5
22
3
16
51.2
, http://www.100md.com
未成熟畸胎瘤
25
24.5
7
9
9
0
17
68.0
无性细胞瘤
9
23.0
4
, 百拇医药 5
4
0
6
66.7
混合性生殖细胞肿瘤
15
23.0
4
5
6
0
6
40.0
, 百拇医药
原发性绒癌
2
17.5
1
1
0
0
1
1/2
合计
82
17
21
, 百拇医药
41
3
46
56.1
三、讨论
1995年Rodabugh等[4]对上皮性卵巢癌细胞株及浸润和交界性卵巢癌组织p16基因进行测定，在卵巢癌组织中未发现p16基因的缺失和突变，而在细胞系中p16基因的纯合缺失率为50%，认为p16基因的突变可能与卵巢癌的关系不大。本研究对82例卵巢恶性生殖细胞肿瘤组织和20例正常卵巢组织的p16蛋白表达进行了测定。研究提示，在正常卵巢组织p16蛋白几乎完全表达，表达率为95.0%，在肿瘤组织的表达率为56.1%(46/82)，明显低于正常卵巢组织，说明在卵巢组织由正常向恶性转化过程中，p16基因的异常是一个重要因素。同时发现p16蛋白表达与肿瘤不同组织类型无明显相关性，说明p16基因的异常可发生在生殖细胞肿瘤的不同组织学类型中。
, http://www.100md.com
在p16蛋白表达与临床分期关系的研究中发现，Ⅰ～Ⅱ期表达率为68.4%，高于Ⅲ～Ⅳ期的45.5%，但经统计学处理，差异无显著性(P>0.05)。这可能与本研究组织学类型多和病例数不多有关。但是，p16蛋白表达阳性组生存状态及生存期明显好于p16蛋白表达阴性组。经Log-rank检验，差异有显著性。即p16蛋白表达越高，该基因异常越少，患者预后越好，提示p16基因有可能作为预测卵巢生殖细胞肿瘤预后的一个重要指标之一，但还有待今后更多的研究来证实。
附图畸胎瘤，p16细胞浆染色阳性。免疫组化ABC×1000表2 p16蛋白表达与肿瘤临床分期的关系
期别
总例数
p16蛋白表达阳性
, 百拇医药
例数
百分率(%)
Ⅰ～Ⅱ
38
26
68.4
Ⅲ～Ⅳ
44
20
45.5
合计
82
46
, 百拇医药 56.1
*中位数，例数少于10，不计百分率
参考文献
1 Kamb A, Gruis NA, Weave-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potential involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264:436-440.
2 张贤良，步宏，周桥，主编.实用组织病理技术手册.成都：成都科技大学出版社，1992.197.
3 Marks JR, Davidoll Am, Kerns BJ, et al. Overexpression and mutation of p53 in epithelial ovarian cancer. Cancer Res, 1991, 51:2979-2984.
4 Rodabugh KJ, Biggs RB, Oureshi TA, et al. Detailed detection mapping of chromosome 9p and p16 gene alterations in human borderline and invasive epithelial ovarian tumors. Oncogene, 1995, 11:1249-1254.
(收稿：1997-10-08 修回：1998-02-26), http://www.100md.com
单位：610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科(高国兰，彭芝兰，王和，陈爱平)，病理科(姚先莹)
关键词：
中华妇产科杂志980517 p16基因的编码蛋白可特异性抑制CDK4激酶(cyclin dependet kinase 4 )活性而影响细胞周期的调控。由于p16基因这一重要的生物学功能以及在多种肿瘤细胞系中有高频率纯合缺失[1]，因而成为肿瘤基础理论和临床研究的热点之一。有关p16基因在上皮性卵巢癌实体瘤组织及细胞表达的研究仅有少许报道，本研究采用抗p16蛋白的多克隆抗体对卵巢恶性生殖细胞肿瘤的p16蛋白表达进行了研究。以探讨p16基因与生殖细胞肿瘤发生发展的关系。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.材料：取自1975～1995年本院妇科手术切除经石蜡包埋存档的标本，共102例。其中因子宫良性病变而行卵巢切除或活组织检查的正常卵巢组织20例。卵巢恶性生殖细胞肿瘤82例，其中内胚窦瘤31例，无性细胞瘤9例，未成熟畸胎瘤25例，原发性绒癌2例，混合性生殖细胞肿瘤15例。所有纳入对象于标本采取前均未接受放疗及化疗，临床及病理资料完整。
p16多克隆抗体为美国Santa Cruz生物技术公司产品，ABC试剂盒由华美生物技术有限公司提供。
2.方法：首先由妇科病理学专家复查HE切片，确定肿瘤的组织学类型和分级。p16多克隆抗体的工作浓度为1∶100，切片经蛋白酶及微波处理，然后严格按ABC法进行染色[2]。
ABC染色：5 μm厚石蜡切片60℃下处理24小时，37℃下处理24～48小时；二甲苯脱蜡；0.3%过氧化氢-甲醛浸泡30分钟；蛋白酶K 37℃下消化20分钟；在0.01 mol柠檬酸钠(pH 6.1)中用微波处理5分钟；小牛血清封闭20分钟；加一抗后在4℃下过夜；加二抗后37℃下30分钟；加ABC复合物，37℃下30分钟后加DAB，进行显色，苏木素复染。
, 百拇医药
用已知p16阳性的肿瘤组织切片作阳性对照，已知p16阴性的肿瘤组织切片作阴性对照。以细胞浆内是否出现棕黄色颗粒判定阳性或阴性[3]。
3.统计学处理：率的比较采用χ2检验，生存率分析采用Kaplan Meier及对数秩检验。
二、结果
1.p16蛋白在正常组织和恶性肿瘤组织的表达：p16蛋白表达主要定位于细胞浆，少数定位于细胞核和胞膜(附图)。在20例正常卵巢组织中，19例表达阳性(95.0%)；在生殖细胞肿瘤不同组织学类型的表达情况见表1。
除原发绒癌例数太少，未计算百分数和纳入统计外，余4组经多个样本率统计分析，差异无显著性(P>0.05)。
2.p16蛋白表达与肿瘤临床分期的关系：从表2可见，p16蛋白表达在Ⅰ～Ⅱ期患者高于Ⅲ～Ⅳ期患者，但经统计学处理，差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
3.p16蛋白表达与肿瘤预后的关系：随访82例患者，获完整随访资料者69例，随访率84.4%。其中死亡20例。对这69例行Kaplan Meier生存曲线分析，经Log-rank检验，显示p16蛋白表达阳性组患者的生存曲线明显高于p16蛋白表达阴性组，阳性组的生存期明显长于阴性组。
表1 不同肿瘤组织中p16蛋白表达的情况
肿瘤类别
总例数
年龄
(岁)
临床分期(例数)
p16蛋白表达阳性
Ⅰ
, 百拇医药
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
例数
百分率(%)
内胚窦瘤
31
22.0
1
5
22
3
16
51.2
, http://www.100md.com
未成熟畸胎瘤
25
24.5
7
9
9
0
17
68.0
无性细胞瘤
9
23.0
4
, 百拇医药 5
4
0
6
66.7
混合性生殖细胞肿瘤
15
23.0
4
5
6
0
6
40.0
, 百拇医药
原发性绒癌
2
17.5
1
1
0
0
1
1/2
合计
82
17
21
, 百拇医药
41
3
46
56.1
三、讨论
1995年Rodabugh等[4]对上皮性卵巢癌细胞株及浸润和交界性卵巢癌组织p16基因进行测定，在卵巢癌组织中未发现p16基因的缺失和突变，而在细胞系中p16基因的纯合缺失率为50%，认为p16基因的突变可能与卵巢癌的关系不大。本研究对82例卵巢恶性生殖细胞肿瘤组织和20例正常卵巢组织的p16蛋白表达进行了测定。研究提示，在正常卵巢组织p16蛋白几乎完全表达，表达率为95.0%，在肿瘤组织的表达率为56.1%(46/82)，明显低于正常卵巢组织，说明在卵巢组织由正常向恶性转化过程中，p16基因的异常是一个重要因素。同时发现p16蛋白表达与肿瘤不同组织类型无明显相关性，说明p16基因的异常可发生在生殖细胞肿瘤的不同组织学类型中。
, http://www.100md.com
在p16蛋白表达与临床分期关系的研究中发现，Ⅰ～Ⅱ期表达率为68.4%，高于Ⅲ～Ⅳ期的45.5%，但经统计学处理，差异无显著性(P>0.05)。这可能与本研究组织学类型多和病例数不多有关。但是，p16蛋白表达阳性组生存状态及生存期明显好于p16蛋白表达阴性组。经Log-rank检验，差异有显著性。即p16蛋白表达越高，该基因异常越少，患者预后越好，提示p16基因有可能作为预测卵巢生殖细胞肿瘤预后的一个重要指标之一，但还有待今后更多的研究来证实。
附图畸胎瘤，p16细胞浆染色阳性。免疫组化ABC×1000表2 p16蛋白表达与肿瘤临床分期的关系
期别
总例数
p16蛋白表达阳性
, 百拇医药
例数
百分率(%)
Ⅰ～Ⅱ
38
26
68.4
Ⅲ～Ⅳ
44
20
45.5
合计
82
46
, 百拇医药 56.1
*中位数，例数少于10，不计百分率
参考文献
1 Kamb A, Gruis NA, Weave-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potential involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264:436-440.
2 张贤良，步宏，周桥，主编.实用组织病理技术手册.成都：成都科技大学出版社，1992.197.
3 Marks JR, Davidoll Am, Kerns BJ, et al. Overexpression and mutation of p53 in epithelial ovarian cancer. Cancer Res, 1991, 51:2979-2984.
4 Rodabugh KJ, Biggs RB, Oureshi TA, et al. Detailed detection mapping of chromosome 9p and p16 gene alterations in human borderline and invasive epithelial ovarian tumors. Oncogene, 1995, 11:1249-1254.
(收稿：1997-10-08 修回：1998-02-26), http://www.100md.com