口腔粘膜下纤维性变组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组化及定量分析
作者：胥红 刘蜀凡 沈子华 彭解英
单位：胥红(湖南医科大学口腔系，410078；现在广东省中山市妇幼保健院口腔中心)；刘蜀凡(湖南医科大学口腔系，410078)；沈子华(湖南医科大学口腔系，410078)；彭解英(湖南医科大学口腔系，410078)
关键词：胶原；免疫组织化学；口腔粘膜下纤维性变
实用口腔医学杂志000117 摘 要：目的：了解口腔粘膜下纤维性变(OSF)组织中Ⅰ型及Ⅲ型胶原的分布及变化情况。方法：应用免疫组织化学方法观察Ⅰ型及Ⅲ型胶原在OSF中的分布，并应用图像分析仪对正常颊粘膜及OSF各期中的Ⅰ、Ⅲ型胶原进行定量分析。结果：Ⅰ、Ⅲ型胶原在口腔颊粘膜中均有分布；Ⅰ、Ⅲ型胶原随OSF病变程度加深逐渐增加，Ⅰ型胶原在OSF早、中、晚三期增多均有统计学意义，而Ⅲ型胶原仅在OSF晚期增多有显著性差异。结论：随OSF病变程度加深胶原沉积逐渐增多，增多的胶原中Ⅰ型胶原为主要成份。
, http://www.100md.com
分类号：R781.5+9 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0052-03
The expression of collagen type Ⅰ and Ⅲ in oral submucous fibrosis
Xu Hong Liu Shufan Shen Zihua et al.
(Department of Stomatology, Hunan Medical University,Changsha 410078)
Abstract：Objective：To study the distribution and contents of collagen type Ⅰ and Ⅲ in oral submucous fibrosis (OSF). Methods:Collagen type Ⅰ and Ⅲ in OSF were investigated by immunohistochemical examination and image pattern analysis.Results:Collagen type Ⅰ increased significantly at the early,moderately advanced and advanced stages of OSF; collagen type Ⅲ increased significantly only at the advanced stage.Conclusion:Collagen type Ⅰ may be the mainly increased part in OSF.
, 百拇医药
Key words：Collagen, Immunohistochemistry; Oral submucous fibrosis▲
口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis, OSF)是一种慢性胶原性疾病，妨碍口腔各种功能的发挥，世界卫生组织将其列为癌前状态疾病。现有的资料表明OSF胶原的增加是由于病变组织中胶原的代谢失去了平衡，胶原合成的增加和降解的不足导致了胶原纤维的堆积〔1,2〕。为探讨OSF的形成机制，作者以免疫组化手段观察了正常颊粘膜及OSF各期病变中Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布及其含量的变化情况，并分析其意义。
1 材料和方法
1.1 标本
病变组织来源于湖南医科大学口腔系粘膜病专科门诊所收集的OSF患者颊部病变部位组织标本，对照组取自无嚼槟榔、无烟酒嗜好、身体健康的志愿者相应部位颊粘膜。病变标本请病理学专家确诊，并按Pindborg〔3〕的病理学标准进行分期。选择OSF早、中、晚期及正常对照各10例进行研究。
, 百拇医药
1.2 试剂
Ⅰ型胶原抗血清(兔抗牛、与人有交叉抗原性，工作浓度1∶50)
Ⅲ型胶原抗血清(兔抗人，工作浓度1∶50)。
以上两型抗体购自上海医科大学病理学教研室。
生物素化的二抗(美国Sigma公司产品，工作浓度1∶100)
S-P辣根过氧化物酶试剂盒(迈新生物制品有限公司，工作浓度1∶100)。
1.3 免疫组化染色
采用S-P(streptavidin-peroxidase)免疫组化法，标本常规切片，经水化，抑制内源性过氧化物酶，消除非特异性染色后，滴加第一抗体，4 ℃过夜；滴加生物素化第二抗体，室温30 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片。以0.01 mol/L PBS代替第一抗体作阴性对照。
, 百拇医药
1.4 定量分析
在MIAS-160型(美国)自动图像分析仪下，每侧标本随机选取3个部位进行分析，取其平均值，测算Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性面积占目标面积(0.014 cm2)的百分比，统计分析用t检验，检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 免疫组化染色
正常颊粘膜中，I型胶原定位于整个粘膜固有层，呈较粗大的囊状，有规律的纵横交错(图1)。OSF早期I型胶原增多，分布与正常颊粘膜近似。OSF中期I型胶原增多更明显，主要定位于固有层深层，表现为粗大的条索状(图2)。OSF晚期I型胶原更多，形态增粗，部分区域呈团块状(图3)。Ⅲ型胶原在整个固有层中亦有分布，呈细网状，较纤细。从OSF早期到中期再到脱期Ⅲ型胶原逐渐增多，纤维增粗(图4)。
, 百拇医药
图1 正常颊粘膜中的I型胶原(×10)
图2 OSF中期颊粘膜中的I型胶原(×10)
图3 OSF晚期颊粘膜中的I型胶原(×20)
图4 OSF中期颊粘膜中Ⅲ型胶原增多(×10)
2.2 图像分析结果
Ⅰ、Ⅲ型胶原在正常颊粘膜及OSF各期中的百分比分别见表1、2。
表1 I型胶原的百分比 (
±s) 分期
, 百拇医药
百分比(%)
P
正常
45.85±4.92
OSF早期
56.14±6.29
<0.05
OSF中期
60.99±15.98
<0.05
OSF晚期
66.00±5.65
, http://www.100md.com
<0.05
表2 Ⅲ型胶原的百分比 (±s) 分期
百分比(%)
P
正 常
14.56±2.88
OSF早期
15.71±3.49
>0.05
OSF中期
18.42±3.33
, http://www.100md.com
>0.05
OSF晚期
20.00±1.57
<0.05
3 讨 论
胶原纤维是构成细胞间质的主要成分，现已分离出17种不同基因型胶原，各自间及种属间均有抗原特异性。I型胶原为间质型胶原，是绝大多数结缔组织中的主要成分〔4〕。本研究结果表明在正常颊粘膜中I型胶原占45.85%。同其他结缔组织相同，I型胶原是口腔颊粘膜的主要成分。Ⅲ型胶原占14.56%，说明Ⅲ型胶原也为颊粘膜中较多的一种成份。
细胞培养、动物实验以及电镜观察表明I型胶原是一种成熟型胶原，Ⅲ型胶原是一种新生幼稚型胶原〔4〕。Ⅰ型胶原交联紧密，抗张力强，是疤痕组织中的主要胶原成分〔5〕。本研究结果发现，I型胶原随OSF病变程度加深逐渐增加，并均有统计学意义，而Ⅲ型胶原虽然也随病程加深逐渐增多，但在OSF早中两期没有统计学意义，仅在OSF晚期显著性增多，表明OSF胶原的增多以I型胶原为主，亦即主要为成熟型胶原的增多。
, 百拇医药
在正常的新陈代谢中，胶原的合成和分解处于一种动态平衡状态，机体既能合成新生的胶原亦能降解老化变性的胶原，故不会导致胶原纤维的堆积，且胶原纤维的形态也保持正常，不形成纤维化。当机体受到某些内在或外界因素的刺激，胶原代谢失去平衡时，则可导致纤维化的发生。一种情形为胶原合成正常，降解不足；另一种为胶原合成过度，降解正常；第三种为胶原合成的过度加上降解不足而形成纤维化。本研究的结果显示：OSF以成熟型的I型胶原增加为主，辅以幼稚型的Ⅲ型胶原增加，提示OSF的形成主要由降解胶原不足引起，胶原合成的增加为次要因素。至于胶原降解不足的原因可能与成纤维细胞对胶原的吞噬作用减少及胶原酶活性降低有关〔2，6〕。
参考文献：
[1]Kuo MY,Chen HM,Hahn LJ,et al.Collagen biosynthesis in human oral submucous fibrosis fibroblast culture.J Dent Res,1995,74(11):1783
, http://www.100md.com
[2]Shieh TY,Yang JF.Collagenase activity in oral submucous fibrosis.Proc Nati Sci Counc Repub China B,1992,16(2):106
[3]Pindborg JJ,Sirsat SM.Oral submucous fibrosis.Oral Surg Oral Med Oral Pathal,1966,22:764
[4]李玉瑞(主编).细胞外间质的生物化学及研究方法.北京：人民卫生出版社，1988.1～146
[5]郑金旭, 贾友明,许祖德,等.I型和Ⅲ型胶原的测定对隐源性致纤维化肺泡炎活动性诊断意义的探讨.上海医科大学学报，1993,20(3):192
[6]McCulloch CA,Knowles GC.Deficiency of collagen phagocytosis by human fibroblasts in vitro:A mechanism for fibrosis?J Cell Physiol,1993,155:461
收稿日期：1999-02-09
修改日期：1999-05-06, 百拇医药
单位：胥红(湖南医科大学口腔系，410078；现在广东省中山市妇幼保健院口腔中心)；刘蜀凡(湖南医科大学口腔系，410078)；沈子华(湖南医科大学口腔系，410078)；彭解英(湖南医科大学口腔系，410078)
关键词：胶原；免疫组织化学；口腔粘膜下纤维性变
实用口腔医学杂志000117 摘 要：目的：了解口腔粘膜下纤维性变(OSF)组织中Ⅰ型及Ⅲ型胶原的分布及变化情况。方法：应用免疫组织化学方法观察Ⅰ型及Ⅲ型胶原在OSF中的分布，并应用图像分析仪对正常颊粘膜及OSF各期中的Ⅰ、Ⅲ型胶原进行定量分析。结果：Ⅰ、Ⅲ型胶原在口腔颊粘膜中均有分布；Ⅰ、Ⅲ型胶原随OSF病变程度加深逐渐增加，Ⅰ型胶原在OSF早、中、晚三期增多均有统计学意义，而Ⅲ型胶原仅在OSF晚期增多有显著性差异。结论：随OSF病变程度加深胶原沉积逐渐增多，增多的胶原中Ⅰ型胶原为主要成份。
, http://www.100md.com
分类号：R781.5+9 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0052-03
The expression of collagen type Ⅰ and Ⅲ in oral submucous fibrosis
Xu Hong Liu Shufan Shen Zihua et al.
(Department of Stomatology, Hunan Medical University,Changsha 410078)
Abstract：Objective：To study the distribution and contents of collagen type Ⅰ and Ⅲ in oral submucous fibrosis (OSF). Methods:Collagen type Ⅰ and Ⅲ in OSF were investigated by immunohistochemical examination and image pattern analysis.Results:Collagen type Ⅰ increased significantly at the early,moderately advanced and advanced stages of OSF; collagen type Ⅲ increased significantly only at the advanced stage.Conclusion:Collagen type Ⅰ may be the mainly increased part in OSF.
, 百拇医药
Key words：Collagen, Immunohistochemistry; Oral submucous fibrosis▲
口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis, OSF)是一种慢性胶原性疾病，妨碍口腔各种功能的发挥，世界卫生组织将其列为癌前状态疾病。现有的资料表明OSF胶原的增加是由于病变组织中胶原的代谢失去了平衡，胶原合成的增加和降解的不足导致了胶原纤维的堆积〔1,2〕。为探讨OSF的形成机制，作者以免疫组化手段观察了正常颊粘膜及OSF各期病变中Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布及其含量的变化情况，并分析其意义。
1 材料和方法
1.1 标本
病变组织来源于湖南医科大学口腔系粘膜病专科门诊所收集的OSF患者颊部病变部位组织标本，对照组取自无嚼槟榔、无烟酒嗜好、身体健康的志愿者相应部位颊粘膜。病变标本请病理学专家确诊，并按Pindborg〔3〕的病理学标准进行分期。选择OSF早、中、晚期及正常对照各10例进行研究。
, 百拇医药
1.2 试剂
Ⅰ型胶原抗血清(兔抗牛、与人有交叉抗原性，工作浓度1∶50)
Ⅲ型胶原抗血清(兔抗人，工作浓度1∶50)。
以上两型抗体购自上海医科大学病理学教研室。
生物素化的二抗(美国Sigma公司产品，工作浓度1∶100)
S-P辣根过氧化物酶试剂盒(迈新生物制品有限公司，工作浓度1∶100)。
1.3 免疫组化染色
采用S-P(streptavidin-peroxidase)免疫组化法，标本常规切片，经水化，抑制内源性过氧化物酶，消除非特异性染色后，滴加第一抗体，4 ℃过夜；滴加生物素化第二抗体，室温30 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片。以0.01 mol/L PBS代替第一抗体作阴性对照。
, 百拇医药
1.4 定量分析
在MIAS-160型(美国)自动图像分析仪下，每侧标本随机选取3个部位进行分析，取其平均值，测算Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性面积占目标面积(0.014 cm2)的百分比，统计分析用t检验，检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 免疫组化染色
正常颊粘膜中，I型胶原定位于整个粘膜固有层，呈较粗大的囊状，有规律的纵横交错(图1)。OSF早期I型胶原增多，分布与正常颊粘膜近似。OSF中期I型胶原增多更明显，主要定位于固有层深层，表现为粗大的条索状(图2)。OSF晚期I型胶原更多，形态增粗，部分区域呈团块状(图3)。Ⅲ型胶原在整个固有层中亦有分布，呈细网状，较纤细。从OSF早期到中期再到脱期Ⅲ型胶原逐渐增多，纤维增粗(图4)。
, 百拇医药
图1 正常颊粘膜中的I型胶原(×10)
图2 OSF中期颊粘膜中的I型胶原(×10)
图3 OSF晚期颊粘膜中的I型胶原(×20)
图4 OSF中期颊粘膜中Ⅲ型胶原增多(×10)
2.2 图像分析结果
Ⅰ、Ⅲ型胶原在正常颊粘膜及OSF各期中的百分比分别见表1、2。
表1 I型胶原的百分比 (
±s) 分期, 百拇医药
百分比(%)
P
正常
45.85±4.92
OSF早期
56.14±6.29
<0.05
OSF中期
60.99±15.98
<0.05
OSF晚期
66.00±5.65
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<0.05
表2 Ⅲ型胶原的百分比 (
±s) 分期百分比(%)
P
正 常
14.56±2.88
OSF早期
15.71±3.49
>0.05
OSF中期
18.42±3.33
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>0.05
OSF晚期
20.00±1.57
<0.05
3 讨 论
胶原纤维是构成细胞间质的主要成分，现已分离出17种不同基因型胶原，各自间及种属间均有抗原特异性。I型胶原为间质型胶原，是绝大多数结缔组织中的主要成分〔4〕。本研究结果表明在正常颊粘膜中I型胶原占45.85%。同其他结缔组织相同，I型胶原是口腔颊粘膜的主要成分。Ⅲ型胶原占14.56%，说明Ⅲ型胶原也为颊粘膜中较多的一种成份。
细胞培养、动物实验以及电镜观察表明I型胶原是一种成熟型胶原，Ⅲ型胶原是一种新生幼稚型胶原〔4〕。Ⅰ型胶原交联紧密，抗张力强，是疤痕组织中的主要胶原成分〔5〕。本研究结果发现，I型胶原随OSF病变程度加深逐渐增加，并均有统计学意义，而Ⅲ型胶原虽然也随病程加深逐渐增多，但在OSF早中两期没有统计学意义，仅在OSF晚期显著性增多，表明OSF胶原的增多以I型胶原为主，亦即主要为成熟型胶原的增多。
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在正常的新陈代谢中，胶原的合成和分解处于一种动态平衡状态，机体既能合成新生的胶原亦能降解老化变性的胶原，故不会导致胶原纤维的堆积，且胶原纤维的形态也保持正常，不形成纤维化。当机体受到某些内在或外界因素的刺激，胶原代谢失去平衡时，则可导致纤维化的发生。一种情形为胶原合成正常，降解不足；另一种为胶原合成过度，降解正常；第三种为胶原合成的过度加上降解不足而形成纤维化。本研究的结果显示：OSF以成熟型的I型胶原增加为主，辅以幼稚型的Ⅲ型胶原增加，提示OSF的形成主要由降解胶原不足引起，胶原合成的增加为次要因素。至于胶原降解不足的原因可能与成纤维细胞对胶原的吞噬作用减少及胶原酶活性降低有关〔2，6〕。
参考文献：
[1]Kuo MY,Chen HM,Hahn LJ,et al.Collagen biosynthesis in human oral submucous fibrosis fibroblast culture.J Dent Res,1995,74(11):1783
, http://www.100md.com
[2]Shieh TY,Yang JF.Collagenase activity in oral submucous fibrosis.Proc Nati Sci Counc Repub China B,1992,16(2):106
[3]Pindborg JJ,Sirsat SM.Oral submucous fibrosis.Oral Surg Oral Med Oral Pathal,1966,22:764
[4]李玉瑞(主编).细胞外间质的生物化学及研究方法.北京：人民卫生出版社，1988.1～146
[5]郑金旭, 贾友明,许祖德,等.I型和Ⅲ型胶原的测定对隐源性致纤维化肺泡炎活动性诊断意义的探讨.上海医科大学学报，1993,20(3):192
[6]McCulloch CA,Knowles GC.Deficiency of collagen phagocytosis by human fibroblasts in vitro:A mechanism for fibrosis?J Cell Physiol,1993,155:461
收稿日期：1999-02-09
修改日期：1999-05-06, 百拇医药