PRK术后角膜基质内Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达
作者：齐艳华 王康孙 洪杉
单位：齐艳华(哈尔滨医科大学附属二院眼科，150086)；王康孙(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科)；洪杉(黑龙江省眼科医院，哈尔滨)
关键词：激光手术；角膜；胶原；RNA；信使
PRK术后角膜基质内摘 要：目的：从分子水平探讨PRK术后前基质内Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达情况。方法：24只新西兰白兔，双眼行-5.0D近视治疗。于术后3天、1、2、3、4周取下角膜，用原位杂交方法观察Ⅰ型和Ⅲ型胶原的基因表达情况。结果：所有眼Ⅰ型胶原的mRNA表达均为阳性。术后2周时，Ⅲ型胶原mRNA表达阳性，到4周时表达较明显。讨论：PRK术后上皮下混浊与新生胶原的形成有关，且Ⅲ型胶原是新生胶原的主要成分。
分类号：R772 文献标识码：B
, http://www.100md.com 文章编号：1004-4469(2000)01-0053-02
Expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen mRNA in anterior stroma after PRK
QI Yan-hua
(Department of Ophthalmology，The Second Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086)
Abstract：Objectsive：To study the expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen mRNA in anterior stroma after PRK.Method：24 New Zealand rabbits were operated for myopic ablation of 5.0 diopters.Corneas were studied for the genes expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen with in situ hibridization.Results：We observed the positive expression of type Ⅰ collagen mRNA at 2 weeks，and more evident at 4 weeks.Conclusion：The subepithelial haze was related with formation of new collagen，and type Ⅲ collagen is the major component.
, 百拇医药
Key words：laser surgery；cornea；collagen；RNA，messenger▲
准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive kertectomy，PRK)，由于其切削组织精确、安全性好而成为目前临床治疗中低度近视眼的主要方法。PRK术后早期角膜的愈合过程主要包括上皮再生、上皮下胶原形成、成纤维细胞功能活跃等[1，2]。PRK术后角膜上皮下混浊的形成直接影响术后角膜的稳定性、透明性。为了进一步了解角膜基质内胶原纤维的变化，我们从分子水平探讨PRK术后早期角膜基质内Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达情况，为探讨PRK术后上皮下混浊的机制及治疗提供理论基础。
1 材料和方法
新西兰白兔24只，体重2～2.5Kg，经裂隙灯检查无眼部病变。
1.1 手术方法
, 百拇医药
4只兔(8只眼)作为正常对照组，其余20只兔(40只眼)经耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠进行全身麻醉(每公斤体重1.5ml)，并用1%地卡因滴眼进行表面麻醉。刮除7mm直径角膜上皮后，输入-5.0D的治疗程序进行切削治疗，切削深度为67μm，双眼均治疗，术毕双眼涂抗菌素眼药膏。使用的仪器是美国Chiron-Technolas Keracor 116准分子激光治疗机。每个脉冲能量密度为120mJ/cm2，频率为10Hz，光学消融直径为7mm。
1.2 术后观察
术后每天用手持裂隙灯显微镜观察角膜上皮愈合情况，并排除角膜感染的可能。于术后3天、1、2、3、4周各取兔4只，经2%戊巴比妥钠全身麻醉后，摘除眼球，沿角巩膜缘剪下角
膜，立即放入-197℃液氮中保存。
1.3 实验方法
, 百拇医药
①试剂：Ⅰ、Ⅲ型胶原cDNA质粒由美国学者何天源博士赠送。非放射性DNA标记及试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品，地高辛标记探针[9]。配预杂交液、缓冲液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。②步骤：冰冻切片厚度3～4μm，置于经DEPC水处理的载玻片上，室温干燥。4%多聚甲醛固定5分钟，PBS冲洗3次，室温下预杂交1小时。杂交液37°过夜。然后顺序以2×SSC、1×SSC、0.5×SSC各15分钟，室温摇床洗片。2%绵羊血清封闭30分钟。1∶5000地高辛抗体结合，室温下2小时。用缓冲液Ⅰ和Ⅲ洗片二次。以新鲜配制硝基蓝四氮唑(NBT)与5-溴4-氯3-吲哚磷酸盐显色液显色，室温下避光5～8小时，水冲洗，苏木精-伊红复染，封片。
2 结果
原位杂交结果显示，所有切片上Ⅰ型胶原的mRNA表达都很丰富，mRNA存在于上皮细胞间和成纤维细胞的胞浆中。术后3天和1周时，切片上Ⅲ型胶原的mRNA表达阴性，术后2周时，上皮下可见Ⅲ型胶原的mRNA阳性表达，术后4周时，前基质内Ⅲ型胶原的mRNA表达较丰富，见图1～3。
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图 1 正常对照组角膜Ⅲ型胶原mRNA表达阴性
图 2 PRK术后2周，Ⅲ型胶原mRNA表达阳性
图 3 PRK术后4周，Ⅲ型胶原mRNA表达阳性
3 讨论
我们知道正常角膜基质中80%是胶原纤维。Ⅰ型胶原是基质中的主要胶原，排列有序的Ⅰ型胶原保证了角膜的透明性，Ⅴ型胶原占10%左右，前弹力膜和后弹力膜主要是Ⅳ型胶原，其它类型所占的比例更小[3]。但目前关于Ⅲ型胶原是否存在于正常角膜组织中争议很大。由于动物种属差异或检测方法不同，使研究结果相悖。一些研究表明在成人角膜中出现Ⅲ型胶原，但也有人证明，Ⅲ型胶原只出现在婴儿角膜中[4～6]。SundarRaj[7]用免疫组织化学的方法对PRK术后猴眼角膜Ⅲ型胶原进行分析，发现正常角膜无Ⅲ型胶原染色，但于PRK术后3周发现明显的Ⅲ型胶原染色，并持续术后18个月仍有Ⅲ型胶原存在。Winter[8]报道1例PRK术后，角膜基质的胶原变化主要是Ⅲ型胶原。
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我们用原位杂交的方法从分子水平研究PRK术后角膜Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达情况，结果表明Ⅰ型胶原mRNA表达存在于所有切片中，说明Ⅰ型胶原是角膜的主要成分。术后2周时，上皮下出现Ⅲ型胶原的mRNA表达，术后4周时，Ⅲ型胶原mRNA表达较明显，而正常角膜和术后3天、1周的角膜Ⅲ型胶原的mRNA表达阴性，说明Ⅲ型胶原是PRK术后上皮下新生胶原的主要成分。
角膜的透明性是由于角膜内无血管，且基质内板层相互平行，挤得很紧。Maurice提出的格子理论阐明角膜的透明性问题，他认为基质中胶原直径相等，且排列成格子状，同时纤维与纤维间隔距离小于一个波长。这种纤维格子网对所有散射光线起栅栏作用，产生破坏性干扰，使其相互抵消，而对那些与投射光相同方向的光线则不进行干扰，反而互相加强，使组织显得透明。PRK术后胶原纤维正常排列被破坏，就会不同程度影响角膜透明性。
角膜上皮下混浊是PRK术后严重的合并症，它直接影响PRK术后屈光矫正的效果。通过本研究发现PRK术后上皮下混浊与前基质中新生成的Ⅲ型胶原有关，为进一步研究PRK术后上皮下混浊机制提供理论依据。■
, 百拇医药
参考文献：
[1] Tuft ST.Photorefractive keratectomy：implication of corneal wound.Br J Ophthalmol，1993，77(2)：243.
[2] Wilson CS，Stark WJ，Green WR.Corneal wound healing after 193￣nm excimer laser keratectomy.Arch Ophthalmol，1991，109(10)：1426.
[3] 孙秉基，徐锦堂.角膜病的理论基础与临床.北京：科学技术文献出版社，1994，24.
[4] Newsome DA，Gross J，Hassell JR，et al.Human corneal stroma contains three distinct collagens.Invest Ophthalmol Vis Sci，1982，22(1)：376.
, 百拇医药
(上接第54页)
[5] Nakayasu K，Tanaka M，Konomi H，et al.Distribution of type Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ and Ⅴ collagen in normal and keratoconus corneas.Ophthalmic Res，1986，18(1)：1.
[6] Ben-Zvi A，Rodrigues MM，Krachmer JH，et al.Immunohistochemical characterization of extracellular matrix in the developing human cornea.Curr Eye Res，1986，5(1)：105.
[7] SundarRaj N，Geiss MJ，Fantes F，et al.Healing of excimer laser ablated monkey corneas：an immunohistochemical evaluation.Arch Ophthalmol 1990，108(12)：1604.
[8] Winter M，Behrendt S，Binder PS.Ultrastructural and immunohistochemical findings after linear excimer laser keratectomy.J Refract Surg，1997，13(1)：60.
收稿日期：1998-08-17
修稿日期：1999-06-28, 百拇医药
单位：齐艳华(哈尔滨医科大学附属二院眼科，150086)；王康孙(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科)；洪杉(黑龙江省眼科医院，哈尔滨)
关键词：激光手术；角膜；胶原；RNA；信使
PRK术后角膜基质内摘 要：目的：从分子水平探讨PRK术后前基质内Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达情况。方法：24只新西兰白兔，双眼行-5.0D近视治疗。于术后3天、1、2、3、4周取下角膜，用原位杂交方法观察Ⅰ型和Ⅲ型胶原的基因表达情况。结果：所有眼Ⅰ型胶原的mRNA表达均为阳性。术后2周时，Ⅲ型胶原mRNA表达阳性，到4周时表达较明显。讨论：PRK术后上皮下混浊与新生胶原的形成有关，且Ⅲ型胶原是新生胶原的主要成分。
分类号：R772 文献标识码：B
, http://www.100md.com 文章编号：1004-4469(2000)01-0053-02
Expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen mRNA in anterior stroma after PRK
QI Yan-hua
(Department of Ophthalmology，The Second Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086)
Abstract：Objectsive：To study the expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen mRNA in anterior stroma after PRK.Method：24 New Zealand rabbits were operated for myopic ablation of 5.0 diopters.Corneas were studied for the genes expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen with in situ hibridization.Results：We observed the positive expression of type Ⅰ collagen mRNA at 2 weeks，and more evident at 4 weeks.Conclusion：The subepithelial haze was related with formation of new collagen，and type Ⅲ collagen is the major component.
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Key words：laser surgery；cornea；collagen；RNA，messenger▲
准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive kertectomy，PRK)，由于其切削组织精确、安全性好而成为目前临床治疗中低度近视眼的主要方法。PRK术后早期角膜的愈合过程主要包括上皮再生、上皮下胶原形成、成纤维细胞功能活跃等[1，2]。PRK术后角膜上皮下混浊的形成直接影响术后角膜的稳定性、透明性。为了进一步了解角膜基质内胶原纤维的变化，我们从分子水平探讨PRK术后早期角膜基质内Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达情况，为探讨PRK术后上皮下混浊的机制及治疗提供理论基础。
1 材料和方法
新西兰白兔24只，体重2～2.5Kg，经裂隙灯检查无眼部病变。
1.1 手术方法
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4只兔(8只眼)作为正常对照组，其余20只兔(40只眼)经耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠进行全身麻醉(每公斤体重1.5ml)，并用1%地卡因滴眼进行表面麻醉。刮除7mm直径角膜上皮后，输入-5.0D的治疗程序进行切削治疗，切削深度为67μm，双眼均治疗，术毕双眼涂抗菌素眼药膏。使用的仪器是美国Chiron-Technolas Keracor 116准分子激光治疗机。每个脉冲能量密度为120mJ/cm2，频率为10Hz，光学消融直径为7mm。
1.2 术后观察
术后每天用手持裂隙灯显微镜观察角膜上皮愈合情况，并排除角膜感染的可能。于术后3天、1、2、3、4周各取兔4只，经2%戊巴比妥钠全身麻醉后，摘除眼球，沿角巩膜缘剪下角
膜，立即放入-197℃液氮中保存。
1.3 实验方法
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①试剂：Ⅰ、Ⅲ型胶原cDNA质粒由美国学者何天源博士赠送。非放射性DNA标记及试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品，地高辛标记探针[9]。配预杂交液、缓冲液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。②步骤：冰冻切片厚度3～4μm，置于经DEPC水处理的载玻片上，室温干燥。4%多聚甲醛固定5分钟，PBS冲洗3次，室温下预杂交1小时。杂交液37°过夜。然后顺序以2×SSC、1×SSC、0.5×SSC各15分钟，室温摇床洗片。2%绵羊血清封闭30分钟。1∶5000地高辛抗体结合，室温下2小时。用缓冲液Ⅰ和Ⅲ洗片二次。以新鲜配制硝基蓝四氮唑(NBT)与5-溴4-氯3-吲哚磷酸盐显色液显色，室温下避光5～8小时，水冲洗，苏木精-伊红复染，封片。
2 结果
原位杂交结果显示，所有切片上Ⅰ型胶原的mRNA表达都很丰富，mRNA存在于上皮细胞间和成纤维细胞的胞浆中。术后3天和1周时，切片上Ⅲ型胶原的mRNA表达阴性，术后2周时，上皮下可见Ⅲ型胶原的mRNA阳性表达，术后4周时，前基质内Ⅲ型胶原的mRNA表达较丰富，见图1～3。
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图 1 正常对照组角膜Ⅲ型胶原mRNA表达阴性
图 2 PRK术后2周，Ⅲ型胶原mRNA表达阳性
图 3 PRK术后4周，Ⅲ型胶原mRNA表达阳性
3 讨论
我们知道正常角膜基质中80%是胶原纤维。Ⅰ型胶原是基质中的主要胶原，排列有序的Ⅰ型胶原保证了角膜的透明性，Ⅴ型胶原占10%左右，前弹力膜和后弹力膜主要是Ⅳ型胶原，其它类型所占的比例更小[3]。但目前关于Ⅲ型胶原是否存在于正常角膜组织中争议很大。由于动物种属差异或检测方法不同，使研究结果相悖。一些研究表明在成人角膜中出现Ⅲ型胶原，但也有人证明，Ⅲ型胶原只出现在婴儿角膜中[4～6]。SundarRaj[7]用免疫组织化学的方法对PRK术后猴眼角膜Ⅲ型胶原进行分析，发现正常角膜无Ⅲ型胶原染色，但于PRK术后3周发现明显的Ⅲ型胶原染色，并持续术后18个月仍有Ⅲ型胶原存在。Winter[8]报道1例PRK术后，角膜基质的胶原变化主要是Ⅲ型胶原。
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我们用原位杂交的方法从分子水平研究PRK术后角膜Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达情况，结果表明Ⅰ型胶原mRNA表达存在于所有切片中，说明Ⅰ型胶原是角膜的主要成分。术后2周时，上皮下出现Ⅲ型胶原的mRNA表达，术后4周时，Ⅲ型胶原mRNA表达较明显，而正常角膜和术后3天、1周的角膜Ⅲ型胶原的mRNA表达阴性，说明Ⅲ型胶原是PRK术后上皮下新生胶原的主要成分。
角膜的透明性是由于角膜内无血管，且基质内板层相互平行，挤得很紧。Maurice提出的格子理论阐明角膜的透明性问题，他认为基质中胶原直径相等，且排列成格子状，同时纤维与纤维间隔距离小于一个波长。这种纤维格子网对所有散射光线起栅栏作用，产生破坏性干扰，使其相互抵消，而对那些与投射光相同方向的光线则不进行干扰，反而互相加强，使组织显得透明。PRK术后胶原纤维正常排列被破坏，就会不同程度影响角膜透明性。
角膜上皮下混浊是PRK术后严重的合并症，它直接影响PRK术后屈光矫正的效果。通过本研究发现PRK术后上皮下混浊与前基质中新生成的Ⅲ型胶原有关，为进一步研究PRK术后上皮下混浊机制提供理论依据。■
, 百拇医药
参考文献：
[1] Tuft ST.Photorefractive keratectomy：implication of corneal wound.Br J Ophthalmol，1993，77(2)：243.
[2] Wilson CS，Stark WJ，Green WR.Corneal wound healing after 193￣nm excimer laser keratectomy.Arch Ophthalmol，1991，109(10)：1426.
[3] 孙秉基，徐锦堂.角膜病的理论基础与临床.北京：科学技术文献出版社，1994，24.
[4] Newsome DA，Gross J，Hassell JR，et al.Human corneal stroma contains three distinct collagens.Invest Ophthalmol Vis Sci，1982，22(1)：376.
, 百拇医药
(上接第54页)
[5] Nakayasu K，Tanaka M，Konomi H，et al.Distribution of type Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ and Ⅴ collagen in normal and keratoconus corneas.Ophthalmic Res，1986，18(1)：1.
[6] Ben-Zvi A，Rodrigues MM，Krachmer JH，et al.Immunohistochemical characterization of extracellular matrix in the developing human cornea.Curr Eye Res，1986，5(1)：105.
[7] SundarRaj N，Geiss MJ，Fantes F，et al.Healing of excimer laser ablated monkey corneas：an immunohistochemical evaluation.Arch Ophthalmol 1990，108(12)：1604.
[8] Winter M，Behrendt S，Binder PS.Ultrastructural and immunohistochemical findings after linear excimer laser keratectomy.J Refract Surg，1997，13(1)：60.
收稿日期：1998-08-17
修稿日期：1999-06-28, 百拇医药