白斑脱落粘膜上皮细胞与组织上皮细胞微核率相关性分析
作者：孙正 李宁 张中仪 沈胜利
单位：孙正 张中仪 沈胜利(100050 首都医科大学附属北京口腔医院口腔内科)；李宁(中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所)
关键词：粘膜白斑病；口腔；口腔肿瘤；微核
中华口腔医学杂志000612 【摘要】 目的 检测口腔白斑患者脱落粘膜细胞微核细胞率及相应组织细胞微核细胞率，并进行相关性分析，为将该项指标应用于口腔白斑的治疗和判断预后提供依据。方法 采用Feuglen染色方法，对59例单纯增生、32例轻和中度异常增生性白斑及28例重度异常增生性白斑和口腔鳞癌患者的口腔脱落粘膜细胞和组织上皮细胞微核进行了检测，同时检测了100例健康人的口腔脱落粘膜细胞微核作为正常对照。结果 口腔白斑患者脱落粘膜细胞微核细胞率明显高于对照组，且随着病变程度的加重微核细胞率也增高，与病变程度呈正相关(r=0.999 7，P<0.001)。各病变组口腔粘膜脱落细胞与组织细胞微核细胞率显著相关。 结论 口腔脱落粘膜细胞微核细胞率可反映组织病变程度，可作为白斑辅助诊断和预测其转归的指标，并可代替口腔粘膜组织微核作为口腔癌的中间生物学标志物。
, 百拇医药
The correlation analysis between frequency of micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells and oral mucosa cells in different grading of oral leukoplakia lesions
SUN Zheng, LI Ning, ZHANG Zhongyi, et al.
(Department of Oral Medicine, Beijing Hospital for Stomatology，Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China)
【Abstract】 Objective To provide evidence for using micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells in diagnosis and treatment of oral leukoplakias and chemopreventive studies of oral cancer. Methods Micronuclei of exfoliated oral mucosa cells and oral mucosa cells in 119 patients comprising 59 simple hyperplasia,32 mild and moderate oral leukoplakia and 28 severe oral leukoplakia and oral squamous carcinoma by Feulgen stain method were examined , and micronuclei of exfoliated oral mucosa cells in 100 normal persons were also examined.Results Frequency of micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells in oral leukoplakia lesions was higher than that of normal persons. Frequency of micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells had a positive correlation with oral leukoplakia lesions(r=0.999 7, P< 0.001) and with frequency of micronucleated cells of oral mucosa cells (P<0.001). Conclusions Frequency of micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells are useful markers to the clinician to predict oral leukoplakia behaviour and prognosis and substitute for frequency of micronucleated cells of oral mucosa cells as intermediate endpoint in chemopreventive trials.
, 百拇医药
【Key words】 Leukoplakia，oral； Mouth neoplasms； Micronuclei
在我国，口腔癌的发病率约占全部恶性肿瘤的3%，而在印度、菲律宾、巴西和斯里兰卡等发展中国家发病率较高，可占全部恶性肿瘤的25%。近年来，口腔癌发病率和病死率在我国及美国、日本、法国和德国等国家均呈上升趋势[1]，因此，口腔癌的化学预防研究具有重要意义。口腔粘膜白斑是WHO认定的口腔癌前病变，其癌变率为7%～15%，非均质型白斑可达 15%～40%。因此，阻断口腔粘膜白斑的发展和恶变是预防口腔癌的重要措施。白斑癌变可经历几年到几十年，问题是如何确定这些病损的转归，因此,许多学者开始致力于口腔白斑癌变标志物的研究。口腔脱落粘膜细胞微核是近年来国外研究较多的标志物。研究表明，口腔白斑患者病损区脱落粘膜细胞微核细胞率增高[2] ,由于脱落粘膜细胞取材方便，对机体无损伤性， 所以在以口腔白斑为研究对象进行的口腔癌干预试验研究中已被广泛用于反映 DNA 损伤的中间生物学终点[3]。
, 百拇医药
材料与方法
1. 材料：在首都医科大学附属北京口腔医院粘膜科门诊就诊、经组织病理诊断为口腔白斑和鳞癌的患者119例，其中单纯增生59例，轻度和中度异常增生32例，重度异常增生和口腔癌患者28例。患者年龄23～76岁，男性69例，女性50例。同时对100名年龄相当的健康人进行口腔脱落粘膜细胞微核检测，作为正常对照。
2.方法：
(1) 口腔脱落粘膜细胞微核检测：用竹制刮板刮取口腔白斑病损区脱落粘膜细胞，均匀涂于载玻片上，每例每处病损区涂2张涂片。空气自然干燥；用甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定15 min；行Feuglen染色，涂片在室温下于1 mol/L盐酸中作用1 min，放入56℃ 1 mol/L盐酸中作用10 min,再于室温1 mol/L盐酸中作用1 min，置Schiff碱染液中室温下作用90 min，用1%偏重亚硫酸钾水洗3次，每次2 min，用1%的亮绿染45 s，结果细胞核染成红色，细胞浆染成绿色。每张涂片计数1 000个细胞，取平均值作为其微核率，以千分率表示。微核判定标准为与主核在一个平片面，与主核分离，染色一致，并小于主核1/3～1/5。
, 百拇医药
(2)病变组织上皮细胞微核检测：在相应部位取病损区粘膜组织进行常规固定，石蜡包埋，进行切片。将3张切片脱蜡，梯度乙醇水化后，进行Feuglen染色，染色方法与步骤同上。在100倍油镜下进行口腔上皮细胞微核细胞数观察，每张切片计数500个上皮细胞，共计1 500个细胞中的微核细胞数，微核细胞率以千分率表示。用泊松分布检验方法进行统计分析。
结果
由表1可见，口腔白斑患者脱落粘膜上皮细胞微核细胞率明显高于健康对照组，且随着病变程度的加重微核细胞率也增高，与病变程度呈正相关(r=0.999 7, P< 0.001)。同时可见各病变组口腔脱落粘膜上皮细胞微核细胞率与相应组织上皮细胞微核细胞率显著相关，r分别为0.93、0.91及0.88。
讨论
微核是细胞受到致癌物作用后染色体受损产生的断片，受损后的染色体断片或无着丝粒染色体环在分裂后期不能定向移动而留在细胞质中形成微核。因此，靶细胞中微核发生率的高低可反映靶组织接触致癌物后DNA受损伤的程度，并可随着接触致癌物的程度而变化，它是组织癌变过程中的一项早期生物学标志物，与癌发生的危险性显著相关[4]。微核率的降低反映组织癌变的危险性降低。由于在癌症的化学预防研究中，用癌发生率作为观察终点，所需样本量大，观察时间长，实施起来较困难，因此用癌发生过程中的中间生物学标志物替代癌发生率作为观察终点是癌症化学预防研究的方向。
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表1 各组脱落粘膜细胞与组织细胞微核细胞率分析(
±s) 组别
例数
脱落细胞
微核细胞率
组织细胞
微核细胞率
r值
健康对照
100
1.2±0.6
-
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-
单纯增生
59
8.4±4.1*
9.5±4.4*
0.93
轻、中度异常增生
32
14.9±3.9*
15.9±3.8*
0.91
重度异常增生和鳞癌
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28
21.4±3.5*
23.1±4.7*
0.88
注：*:各组间两两比较，经泊松分布检验，P<0.01 口腔粘膜组织细胞微核是一项直接反映口腔癌发生危险性的生物学中间标志物，但由于反复取材患者不易接受，因此，在口腔癌的化学预防研究中，国外学者用口腔脱落粘膜细胞微核细胞率作为反映口腔癌的标志物。口腔粘膜细胞微核在基底细胞中形成后移行到表层，可在脱落粘膜细胞中检测到。国外有研究报道，口腔白斑患者脱落粘膜细胞微核细胞率增高，用化学预防剂如维生素A和胡萝卜素等治疗后，微核细胞率下降，临床病损缩小[5]。但对脱落粘膜细胞微核与病变的相关性未见报道。本项研究发现，口腔粘膜微核细胞率的高低与组织病变的程度显著相关，说明口腔微核可反映组织病变程度，由于脱落粘膜上皮细胞取材方便，对机体无损伤，且易检测辨认，所以口腔粘膜脱落细胞微核细胞率可作为口腔癌前病变的追踪观察，推测病变预后的标志物，特别是对表面发生糜烂、溃疡等不宜活检而又需密切随访的可疑病例，用这种方法定期检测是很有价值的。本研究同时显示，口腔脱落粘膜上皮细胞微核细胞率与病变组织上皮微核细胞率显著相关，说明口腔脱落粘膜细胞微核可代替口腔粘膜组织微核作为口腔癌的中间生物学标志物。用口腔脱落粘膜细胞微核替代口腔癌作为观察终点，在口腔癌的化学预防研究中已有应用，用中间标志物作为观察终点，可减少样本量，缩短观察时间，提高化学预防研究的有效性，本研究验证了用口腔脱落粘膜细胞微核替代口腔粘膜组织微核作为口腔癌化学预防研究中间生物学终点的准确性。
, 百拇医药
参考文献
1.Parkin DM, Laara E, Muir CS.Estimats of the worldwide frequency of sixteen major cancers in 1980. Int J Cancer, 1988, 41:184-197.
2.Greenwald P, Witkin KM , Malone WF. The study of markers of biological effect in cancer prevention research trials. Int J Cancer, 1992, 52: 189-196.
3.Prasad MPR, Mukundan MA, Krishnaswamy K. Micronuclei and carcinogen DNA adducts as intermediate end points in nutrient intervention trial of precancerous lesions in the oral cavity. Oral Oncol Eur J Cancer, 1995, 31B: 155-159.
, 百拇医药
4.Garewal HS, Ramsey L , Kaugars G, et al. Clinical experience with the micronucleus assay .J Cell Biochem, 1993，17F:206-212.
5.Stich HF, Stich W , Rosin MP, et al. Use of the micronucleus test to monitor the effect of vitaminA, beta-carotene and canthaxanthin on the buccal mucosa of betel nut/tobacco chewers. Int J Cancer, 1984,34:745-750.
(收稿日期：2000-03-15), http://www.100md.com
单位：孙正 张中仪 沈胜利(100050 首都医科大学附属北京口腔医院口腔内科)；李宁(中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所)
关键词：粘膜白斑病；口腔；口腔肿瘤；微核
中华口腔医学杂志000612 【摘要】 目的 检测口腔白斑患者脱落粘膜细胞微核细胞率及相应组织细胞微核细胞率，并进行相关性分析，为将该项指标应用于口腔白斑的治疗和判断预后提供依据。方法 采用Feuglen染色方法，对59例单纯增生、32例轻和中度异常增生性白斑及28例重度异常增生性白斑和口腔鳞癌患者的口腔脱落粘膜细胞和组织上皮细胞微核进行了检测，同时检测了100例健康人的口腔脱落粘膜细胞微核作为正常对照。结果 口腔白斑患者脱落粘膜细胞微核细胞率明显高于对照组，且随着病变程度的加重微核细胞率也增高，与病变程度呈正相关(r=0.999 7，P<0.001)。各病变组口腔粘膜脱落细胞与组织细胞微核细胞率显著相关。 结论 口腔脱落粘膜细胞微核细胞率可反映组织病变程度，可作为白斑辅助诊断和预测其转归的指标，并可代替口腔粘膜组织微核作为口腔癌的中间生物学标志物。
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The correlation analysis between frequency of micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells and oral mucosa cells in different grading of oral leukoplakia lesions
SUN Zheng, LI Ning, ZHANG Zhongyi, et al.
(Department of Oral Medicine, Beijing Hospital for Stomatology，Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China)
【Abstract】 Objective To provide evidence for using micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells in diagnosis and treatment of oral leukoplakias and chemopreventive studies of oral cancer. Methods Micronuclei of exfoliated oral mucosa cells and oral mucosa cells in 119 patients comprising 59 simple hyperplasia,32 mild and moderate oral leukoplakia and 28 severe oral leukoplakia and oral squamous carcinoma by Feulgen stain method were examined , and micronuclei of exfoliated oral mucosa cells in 100 normal persons were also examined.Results Frequency of micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells in oral leukoplakia lesions was higher than that of normal persons. Frequency of micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells had a positive correlation with oral leukoplakia lesions(r=0.999 7, P< 0.001) and with frequency of micronucleated cells of oral mucosa cells (P<0.001). Conclusions Frequency of micronucleated cells of exfoliated oral mucosa cells are useful markers to the clinician to predict oral leukoplakia behaviour and prognosis and substitute for frequency of micronucleated cells of oral mucosa cells as intermediate endpoint in chemopreventive trials.
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【Key words】 Leukoplakia，oral； Mouth neoplasms； Micronuclei
在我国，口腔癌的发病率约占全部恶性肿瘤的3%，而在印度、菲律宾、巴西和斯里兰卡等发展中国家发病率较高，可占全部恶性肿瘤的25%。近年来，口腔癌发病率和病死率在我国及美国、日本、法国和德国等国家均呈上升趋势[1]，因此，口腔癌的化学预防研究具有重要意义。口腔粘膜白斑是WHO认定的口腔癌前病变，其癌变率为7%～15%，非均质型白斑可达 15%～40%。因此，阻断口腔粘膜白斑的发展和恶变是预防口腔癌的重要措施。白斑癌变可经历几年到几十年，问题是如何确定这些病损的转归，因此,许多学者开始致力于口腔白斑癌变标志物的研究。口腔脱落粘膜细胞微核是近年来国外研究较多的标志物。研究表明，口腔白斑患者病损区脱落粘膜细胞微核细胞率增高[2] ,由于脱落粘膜细胞取材方便，对机体无损伤性， 所以在以口腔白斑为研究对象进行的口腔癌干预试验研究中已被广泛用于反映 DNA 损伤的中间生物学终点[3]。
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材料与方法
1. 材料：在首都医科大学附属北京口腔医院粘膜科门诊就诊、经组织病理诊断为口腔白斑和鳞癌的患者119例，其中单纯增生59例，轻度和中度异常增生32例，重度异常增生和口腔癌患者28例。患者年龄23～76岁，男性69例，女性50例。同时对100名年龄相当的健康人进行口腔脱落粘膜细胞微核检测，作为正常对照。
2.方法：
(1) 口腔脱落粘膜细胞微核检测：用竹制刮板刮取口腔白斑病损区脱落粘膜细胞，均匀涂于载玻片上，每例每处病损区涂2张涂片。空气自然干燥；用甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定15 min；行Feuglen染色，涂片在室温下于1 mol/L盐酸中作用1 min，放入56℃ 1 mol/L盐酸中作用10 min,再于室温1 mol/L盐酸中作用1 min，置Schiff碱染液中室温下作用90 min，用1%偏重亚硫酸钾水洗3次，每次2 min，用1%的亮绿染45 s，结果细胞核染成红色，细胞浆染成绿色。每张涂片计数1 000个细胞，取平均值作为其微核率，以千分率表示。微核判定标准为与主核在一个平片面，与主核分离，染色一致，并小于主核1/3～1/5。
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(2)病变组织上皮细胞微核检测：在相应部位取病损区粘膜组织进行常规固定，石蜡包埋，进行切片。将3张切片脱蜡，梯度乙醇水化后，进行Feuglen染色，染色方法与步骤同上。在100倍油镜下进行口腔上皮细胞微核细胞数观察，每张切片计数500个上皮细胞，共计1 500个细胞中的微核细胞数，微核细胞率以千分率表示。用泊松分布检验方法进行统计分析。
结果
由表1可见，口腔白斑患者脱落粘膜上皮细胞微核细胞率明显高于健康对照组，且随着病变程度的加重微核细胞率也增高，与病变程度呈正相关(r=0.999 7, P< 0.001)。同时可见各病变组口腔脱落粘膜上皮细胞微核细胞率与相应组织上皮细胞微核细胞率显著相关，r分别为0.93、0.91及0.88。
讨论
微核是细胞受到致癌物作用后染色体受损产生的断片，受损后的染色体断片或无着丝粒染色体环在分裂后期不能定向移动而留在细胞质中形成微核。因此，靶细胞中微核发生率的高低可反映靶组织接触致癌物后DNA受损伤的程度，并可随着接触致癌物的程度而变化，它是组织癌变过程中的一项早期生物学标志物，与癌发生的危险性显著相关[4]。微核率的降低反映组织癌变的危险性降低。由于在癌症的化学预防研究中，用癌发生率作为观察终点，所需样本量大，观察时间长，实施起来较困难，因此用癌发生过程中的中间生物学标志物替代癌发生率作为观察终点是癌症化学预防研究的方向。
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表1 各组脱落粘膜细胞与组织细胞微核细胞率分析(
±s) 组别例数
脱落细胞
微核细胞率
组织细胞
微核细胞率
r值
健康对照
100
1.2±0.6
-
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-
单纯增生
59
8.4±4.1*
9.5±4.4*
0.93
轻、中度异常增生
32
14.9±3.9*
15.9±3.8*
0.91
重度异常增生和鳞癌
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28
21.4±3.5*
23.1±4.7*
0.88
注：*:各组间两两比较，经泊松分布检验，P<0.01 口腔粘膜组织细胞微核是一项直接反映口腔癌发生危险性的生物学中间标志物，但由于反复取材患者不易接受，因此，在口腔癌的化学预防研究中，国外学者用口腔脱落粘膜细胞微核细胞率作为反映口腔癌的标志物。口腔粘膜细胞微核在基底细胞中形成后移行到表层，可在脱落粘膜细胞中检测到。国外有研究报道，口腔白斑患者脱落粘膜细胞微核细胞率增高，用化学预防剂如维生素A和胡萝卜素等治疗后，微核细胞率下降，临床病损缩小[5]。但对脱落粘膜细胞微核与病变的相关性未见报道。本项研究发现，口腔粘膜微核细胞率的高低与组织病变的程度显著相关，说明口腔微核可反映组织病变程度，由于脱落粘膜上皮细胞取材方便，对机体无损伤，且易检测辨认，所以口腔粘膜脱落细胞微核细胞率可作为口腔癌前病变的追踪观察，推测病变预后的标志物，特别是对表面发生糜烂、溃疡等不宜活检而又需密切随访的可疑病例，用这种方法定期检测是很有价值的。本研究同时显示，口腔脱落粘膜上皮细胞微核细胞率与病变组织上皮微核细胞率显著相关，说明口腔脱落粘膜细胞微核可代替口腔粘膜组织微核作为口腔癌的中间生物学标志物。用口腔脱落粘膜细胞微核替代口腔癌作为观察终点，在口腔癌的化学预防研究中已有应用，用中间标志物作为观察终点，可减少样本量，缩短观察时间，提高化学预防研究的有效性，本研究验证了用口腔脱落粘膜细胞微核替代口腔粘膜组织微核作为口腔癌化学预防研究中间生物学终点的准确性。
, 百拇医药
参考文献
1.Parkin DM, Laara E, Muir CS.Estimats of the worldwide frequency of sixteen major cancers in 1980. Int J Cancer, 1988, 41:184-197.
2.Greenwald P, Witkin KM , Malone WF. The study of markers of biological effect in cancer prevention research trials. Int J Cancer, 1992, 52: 189-196.
3.Prasad MPR, Mukundan MA, Krishnaswamy K. Micronuclei and carcinogen DNA adducts as intermediate end points in nutrient intervention trial of precancerous lesions in the oral cavity. Oral Oncol Eur J Cancer, 1995, 31B: 155-159.
, 百拇医药
4.Garewal HS, Ramsey L , Kaugars G, et al. Clinical experience with the micronucleus assay .J Cell Biochem, 1993，17F:206-212.
5.Stich HF, Stich W , Rosin MP, et al. Use of the micronucleus test to monitor the effect of vitaminA, beta-carotene and canthaxanthin on the buccal mucosa of betel nut/tobacco chewers. Int J Cancer, 1984,34:745-750.
(收稿日期：2000-03-15), http://www.100md.com