初均速法预测中药复方注射剂的有效期
作者：江波 侯世祥 孙立立 刘三康 李章万
单位：江波(复旦大学,上海 200433)；侯世祥(华西医科大学 药学院，四川 成都 610044)；孙立立(华西医科大学 药学院，四川 成都 610044)；刘三康(华西医科大学 药学院，四川 成都 610044)；李章万(华西医科大学 药学院，四川 成都 610044)
关键词：中药复方注射剂；初均速法；有效期；葛根素；丹参素
摘 要摘 要：目的：用化学动力学方法预测中药复方注射剂的有效期，为评价其 质量提供依据。方法：采用初均速温度加速实验法预测有效期，复 方中有效成分葛根素和丹参素的含量测定采用HPLC法。结果：注射 剂中有效成分的降解，葛根素符合一级反应规律，丹参素则难以确定；分别以两成分为指标 ，t0.9，25 ℃ 分别为3.49 a和1.69 a。结论：中药复 方注射剂的有效期宜以其中t0.9 较短者为准，本注射剂可暂定为1.5 a。
, 百拇医药
Stable Life Predection for A Complex Injection of Chinese Materia Medica by Initial Average Rate Stability Test
JIANG Bo
(Fudan University, Shanghai 200433，China)
HOU Shi-xiang SUN Li-li LIU San-kang LI Zhang-wan
(School of Pharmacology, West China University of Medical Sciences, Sichuan Chengdu 610044, China)
Abstract：Objective: To predict the stable life for a complex injection of Chinese meteria medica. Method: The prediction was carried out by initial average rate stability tests, and the contents of puerarin and danshensu (major active components of the injection) were assayed by HPLC. Result: The degradation of puerarin followed the first order action,while danshensu was hard to determine; the t0.9,25℃ was 3.49 years and 1.69 years respectively. Conclusion: The stable life of the injection has been determined as 1.5 years.
, 百拇医药
Key words：complex injection of Chinese materia medica; initial average rate stability tests; stable life; puerarin; danshensu▲
稳定性是保证药物制剂安全有效的重要方面。中药制剂尤其是液体制剂，由于所含成分复杂 ，成品质量受到生药原料、制剂工艺等因素的影响，其稳定性问题尤需加倍注意。药物的稳 定性考察常采用留样观察法和加速实验法。留样观察法结果准确可靠，但耗时太长。因此， 加速实验法预测药物稳定性被广泛采用。经典恒温加速法是其中最常用的方法，结果准确， 与留样观察法吻合程度较高，但是分析工作量巨大，数据处理繁琐。由此而发展起来的简化 恒温法有温度指示法、初均速法、单测点法、T0.9 法和威布尔拟合法等[ 1]，可大大减少工作量，在短时间内获得预测结果。
本文以由葛根、丹参等药材组成的中药复方注射剂为样本，以其中主要有效成分葛根素和丹 参素含量为指标，采用初均速法预测了制剂的有效期，并考察了有效成分的降解规律。
, 百拇医药
1 仪器、药品与试剂
中药复方注射剂(含葛根、丹参等药材，自制，批号971127，规格10 ml/支)；葛根素对照 品(含量测定用，中国药品生物制品检定所)；丹参素(上海医科大学药学院，归一化法测定 含量>98%)；其余试剂均为分析纯。
岛津LC-6A高效液相色谱仪;SPD-6A紫外检测器；Shimpack CLC-ODS色谱柱(150 mm×6. 0 mm，5 μm)；超级恒温水浴箱(上海医用分析仪器厂)。
2 注射剂有效成分含量测定
葛根素为中药葛根所含黄酮类的主要成分[2，3]。本文采用HPLC法测定其含量， 具有准确、快速、重现性好等特点。以甲醇-36%醋酸-水(25∶3∶72)为流动相，247 nm 下检测。测得的葛根素标准曲线方程为A=1848+1.38×106C，r=0.9999(n=3)；进样量 0.038～0.608 μg，线性关系良好；日内与日间精密度分别为0.20%和0.50%；平均加样回 收率为100.60%，RSD 1.70%。
, 百拇医药
丹参素为中药丹参水溶性成分中的主要有效成分[4]，其含量测定采用RP-HPLC方 法，可克服样品不稳定以及干扰严重等因素的影响，具有操作简单、快速、重现性好等优点 。以甲醇-0.2 mol.l-1NH4Ac(硫酸调节pH 2.2)(12∶88)为流动相，280 nm下 检测。测得的丹参素标准曲线方程为A=20+1.69×106C，r=0.9999(n=3)。进样量0.3 ～4.9 μg，线性关系良好；日内与日间精密度分别为0.69%和1.61%；平均加样回 收率为100.69%，RSD1.40%。
3 注射剂有效成分降解反应规律考察
取注射剂成品适量，于超级恒温水浴箱中分别加速(95 ℃)0，1，2，4，8，16 h，按时取样 ，迅速冰水浴冷却，按前述含量测定方法测定其中有效成分含量。结果见表1，表2。分别以 C，lgC和1/C对时间T进行线性拟合，结果见表1，表2。
, http://www.100md.com
表1 注射液95 ℃加速实验葛根素含量测定结果
0h
1 h
2 h
4 h
8 h
16 h
r
C
100
99.15
98.20
97.77
, 百拇医药
95.67
92.68
0.9493
lgC
2.0000
1.9963
1.9921
1.9902
1.9797
1.9670
0.9501
1/C
0.01000
, 百拇医药
0.01008
0.01018
0.01022
0.01048
0.01079
0.9446
注：以0 h含量为100计(表2同) 表2 注射液95℃加速实验丹参素含量测定结果
0 h
1 h
2 h
4 h
8 h
, 百拇医药
16 h
r
C
100
99.66
96.22
95.70
93.30
92.44
-0.8744
lgC
2.0000
1.9985
, http://www.100md.com
1.9833
1.9809
1.9699
1.9659
-0.8788
1/C
0.01000
0.01003
0.01039
0.01045
0.01072
0.01082
, http://www.100md.com
0.8832
4 初均速法预测制剂有效期
4.1 方法
取注射液适量，按表3，表4的温度及加速时间安排实验，按时取出，冰水浴冷却，分别按前述方法测定其中有效成分含量。结果见表3，表4。
表3 注射液以葛根素为指标的加速实验结果
T /℃
T-1
×10-3
加速时间
/h
, 百拇医药
含量
/%
初均速/h-1
×10-3
lgV
95
2.7163
4
97.78
5.541
-2.2561
91
, 百拇医药 2.7461
7
95.66
6.199
-2.2077
87
2.7766
9
95.27
5.252
-2.2798
83
2.8078
, 百拇医药
12
95.08
4.098
-2.3874
79
2.8397
24
96.24
1.567
-2.8049
75
2.8723
35
, 百拇医药
95.47
1.295
-2.8877
71
2.9057
66
94.99
0.759
-3.1193
67
2.9399
96
95.47
, http://www.100md.com
0.472
-3.3260
表4 注射液以丹参素为指标的加速实验结果
T/℃
T-1 ×10-3
加速时间
/h
含量
/%
初均速/h-1
×10-3
, http://www.100md.com
lgV
95
2.7163
4
96.51
8.73
-2.0592
91
2.7461
7
93.82
8.83
-2.0540
, 百拇医药
87
2.7766
9
97.46
2.82
-2.5494
83
2.8078
12
93.66
5.28
-2.2771
75
, 百拇医药
2.8723
35
93.66
1.81
-2.7420
71
2.9057
66
93.50
0.985
-3.0066
67
2.9399
, http://www.100md.com
96
93.03
0.726
-3.1390
4.2 数据处理与有效期预测
根据Arrhenius定律，分别以表3，表4中lgV对1/T进行线性回归，得回归方程及其标准偏差s，根据回归方程计算室温下的初均速V25 ℃及其置信区间，并由公式t0.9，25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃计算有效期及其置信区间。
以葛根素为指标：
回归方程为lgV=-5348.991/T+12.4552,r=0.9659，s=0.1211,r｜>r0.01,6=0.834,线性关系显著。
, 百拇医药
当T=298.15K时，V25 ℃=10-5.4854(1/h),t0.9，25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃=3.49 a。
当α=0.1,f=6时，t1-α/2,6=1.9432，lgV25 ℃=-5348.991/298.15+12.4552
±t1-α/2,5×s，V25 ℃=10(-5.4854±0.2353)，t0.9，25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃，上限为6.00 a，下限为2.03 a。
以丹参素为指标：
回归方程为lgV=-4945.841/T+114179，r=-0.9507，s=0.1490，｜r｜>r0.01,5=0.874，线性关系显著。
, http://www.100md.com
当T=298.15K时，V25 ℃=10-5.1705(1/h)，t0.9,25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃=1.69a。
当α=0.1,f=5时，t1-α/2,5=2.0150，lgV25 ℃=-4945.841/298.15+11.4179
±t1-α/2,5×s，V25 ℃=10-5.1705±0.3002)，t0.9，25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃，上限为3.4 a，下限为0.85 a。
综合上述结果，暂定本注射液有效期为15 a。
5 实验结果与讨论
, 百拇医药
5.1 关于降解反应规律考察 本文降解反应规律考察的目的在于加速实验条件的合理设计与安排。有效成分葛根素浓度的对数与时间线性关系良好，其降解反应规律符合1级反应。丹参素的降解按零级、1级或2级反应拟合，线性关系都较差，提示其降解反应规律复杂；但是由于初均速法的特点，药物有效成分的降解规律对其影响不大，故仍可应用。
5.2 关于初均速法预测制剂有效期 在反应初期药物分解小于10%，反应既可按1级速度过程处理，又可按零级速度过程处理[1]，若按零级反应处理则反应初期的初均速与反应速度常数相等，因此初均速与温度的关系也符合Arrhenius指数规律，将此直线外推至室温，则可得室温下的初均速，进而求得室温有效期。
初均速法预测制剂有效期有以下两个优点：第一，初均速法取样点在反应初期，可排除反应后期副反应的干扰；第二，由于增加了加速实验的温度数(一般7～9个)，因此就增加了按Arrhenius指数规律推算室温有效期的精确度。
, 百拇医药
本文初均速法预测有效期结果尚待室温留样观察进一步证实。
参考文献：
[1]庞贻慧.药物稳定性预测方法.北京：人民卫生出版社，1984.68.
[2]郭建平，孙共荣，周 全，等.葛根药理作用研究进展.中草药，1995，26(3)：163.
[3]张 蕾，朱蓉贞，潘 扬，等.不同品种及产地的葛根中葛根素含量的比较.中国中药杂志，1995，20(7)：399.
[4]李承珠，扬诗春，赵凤娣，等.丹参素抗凝血作用的研究.中西医结合杂志，1983，3(5)：297.
收稿日期：1998-12-07, http://www.100md.com
单位：江波(复旦大学,上海 200433)；侯世祥(华西医科大学 药学院，四川 成都 610044)；孙立立(华西医科大学 药学院，四川 成都 610044)；刘三康(华西医科大学 药学院，四川 成都 610044)；李章万(华西医科大学 药学院，四川 成都 610044)
关键词：中药复方注射剂；初均速法；有效期；葛根素；丹参素
摘 要摘 要：目的：用化学动力学方法预测中药复方注射剂的有效期，为评价其 质量提供依据。方法：采用初均速温度加速实验法预测有效期，复 方中有效成分葛根素和丹参素的含量测定采用HPLC法。结果：注射 剂中有效成分的降解，葛根素符合一级反应规律，丹参素则难以确定；分别以两成分为指标 ，t0.9，25 ℃ 分别为3.49 a和1.69 a。结论：中药复 方注射剂的有效期宜以其中t0.9 较短者为准，本注射剂可暂定为1.5 a。
, 百拇医药
Stable Life Predection for A Complex Injection of Chinese Materia Medica by Initial Average Rate Stability Test
JIANG Bo
(Fudan University, Shanghai 200433，China)
HOU Shi-xiang SUN Li-li LIU San-kang LI Zhang-wan
(School of Pharmacology, West China University of Medical Sciences, Sichuan Chengdu 610044, China)
Abstract：Objective: To predict the stable life for a complex injection of Chinese meteria medica. Method: The prediction was carried out by initial average rate stability tests, and the contents of puerarin and danshensu (major active components of the injection) were assayed by HPLC. Result: The degradation of puerarin followed the first order action,while danshensu was hard to determine; the t0.9,25℃ was 3.49 years and 1.69 years respectively. Conclusion: The stable life of the injection has been determined as 1.5 years.
, 百拇医药
Key words：complex injection of Chinese materia medica; initial average rate stability tests; stable life; puerarin; danshensu▲
稳定性是保证药物制剂安全有效的重要方面。中药制剂尤其是液体制剂，由于所含成分复杂 ，成品质量受到生药原料、制剂工艺等因素的影响，其稳定性问题尤需加倍注意。药物的稳 定性考察常采用留样观察法和加速实验法。留样观察法结果准确可靠，但耗时太长。因此， 加速实验法预测药物稳定性被广泛采用。经典恒温加速法是其中最常用的方法，结果准确， 与留样观察法吻合程度较高，但是分析工作量巨大，数据处理繁琐。由此而发展起来的简化 恒温法有温度指示法、初均速法、单测点法、T0.9 法和威布尔拟合法等[ 1]，可大大减少工作量，在短时间内获得预测结果。
本文以由葛根、丹参等药材组成的中药复方注射剂为样本，以其中主要有效成分葛根素和丹 参素含量为指标，采用初均速法预测了制剂的有效期，并考察了有效成分的降解规律。
, 百拇医药
1 仪器、药品与试剂
中药复方注射剂(含葛根、丹参等药材，自制，批号971127，规格10 ml/支)；葛根素对照 品(含量测定用，中国药品生物制品检定所)；丹参素(上海医科大学药学院，归一化法测定 含量>98%)；其余试剂均为分析纯。
岛津LC-6A高效液相色谱仪;SPD-6A紫外检测器；Shimpack CLC-ODS色谱柱(150 mm×6. 0 mm，5 μm)；超级恒温水浴箱(上海医用分析仪器厂)。
2 注射剂有效成分含量测定
葛根素为中药葛根所含黄酮类的主要成分[2，3]。本文采用HPLC法测定其含量， 具有准确、快速、重现性好等特点。以甲醇-36%醋酸-水(25∶3∶72)为流动相，247 nm 下检测。测得的葛根素标准曲线方程为A=1848+1.38×106C，r=0.9999(n=3)；进样量 0.038～0.608 μg，线性关系良好；日内与日间精密度分别为0.20%和0.50%；平均加样回 收率为100.60%，RSD 1.70%。
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丹参素为中药丹参水溶性成分中的主要有效成分[4]，其含量测定采用RP-HPLC方 法，可克服样品不稳定以及干扰严重等因素的影响，具有操作简单、快速、重现性好等优点 。以甲醇-0.2 mol.l-1NH4Ac(硫酸调节pH 2.2)(12∶88)为流动相，280 nm下 检测。测得的丹参素标准曲线方程为A=20+1.69×106C，r=0.9999(n=3)。进样量0.3 ～4.9 μg，线性关系良好；日内与日间精密度分别为0.69%和1.61%；平均加样回 收率为100.69%，RSD1.40%。
3 注射剂有效成分降解反应规律考察
取注射剂成品适量，于超级恒温水浴箱中分别加速(95 ℃)0，1，2，4，8，16 h，按时取样 ，迅速冰水浴冷却，按前述含量测定方法测定其中有效成分含量。结果见表1，表2。分别以 C，lgC和1/C对时间T进行线性拟合，结果见表1，表2。
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表1 注射液95 ℃加速实验葛根素含量测定结果
0h
1 h
2 h
4 h
8 h
16 h
r
C
100
99.15
98.20
97.77
, 百拇医药
95.67
92.68
0.9493
lgC
2.0000
1.9963
1.9921
1.9902
1.9797
1.9670
0.9501
1/C
0.01000
, 百拇医药
0.01008
0.01018
0.01022
0.01048
0.01079
0.9446
注：以0 h含量为100计(表2同) 表2 注射液95℃加速实验丹参素含量测定结果
0 h
1 h
2 h
4 h
8 h
, 百拇医药
16 h
r
C
100
99.66
96.22
95.70
93.30
92.44
-0.8744
lgC
2.0000
1.9985
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1.9833
1.9809
1.9699
1.9659
-0.8788
1/C
0.01000
0.01003
0.01039
0.01045
0.01072
0.01082
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0.8832
4 初均速法预测制剂有效期
4.1 方法
取注射液适量，按表3，表4的温度及加速时间安排实验，按时取出，冰水浴冷却，分别按前述方法测定其中有效成分含量。结果见表3，表4。
表3 注射液以葛根素为指标的加速实验结果
T /℃
T-1
×10-3
加速时间
/h
, 百拇医药
含量
/%
初均速/h-1
×10-3
lgV
95
2.7163
4
97.78
5.541
-2.2561
91
, 百拇医药 2.7461
7
95.66
6.199
-2.2077
87
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5.252
-2.2798
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2.8078
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12
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4.098
-2.3874
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24
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1.567
-2.8049
75
2.8723
35
, 百拇医药
95.47
1.295
-2.8877
71
2.9057
66
94.99
0.759
-3.1193
67
2.9399
96
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0.472
-3.3260
表4 注射液以丹参素为指标的加速实验结果
T/℃
T-1 ×10-3
加速时间
/h
含量
/%
初均速/h-1
×10-3
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lgV
95
2.7163
4
96.51
8.73
-2.0592
91
2.7461
7
93.82
8.83
-2.0540
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87
2.7766
9
97.46
2.82
-2.5494
83
2.8078
12
93.66
5.28
-2.2771
75
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2.8723
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1.81
-2.7420
71
2.9057
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93.50
0.985
-3.0066
67
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96
93.03
0.726
-3.1390
4.2 数据处理与有效期预测
根据Arrhenius定律，分别以表3，表4中lgV对1/T进行线性回归，得回归方程及其标准偏差s，根据回归方程计算室温下的初均速V25 ℃及其置信区间，并由公式t0.9，25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃计算有效期及其置信区间。
以葛根素为指标：
回归方程为lgV=-5348.991/T+12.4552,r=0.9659，s=0.1211,r｜>r0.01,6=0.834,线性关系显著。
, 百拇医药
当T=298.15K时，V25 ℃=10-5.4854(1/h),t0.9，25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃=3.49 a。
当α=0.1,f=6时，t1-α/2,6=1.9432，lgV25 ℃=-5348.991/298.15+12.4552
±t1-α/2,5×s，V25 ℃=10(-5.4854±0.2353)，t0.9，25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃，上限为6.00 a，下限为2.03 a。
以丹参素为指标：
回归方程为lgV=-4945.841/T+114179，r=-0.9507，s=0.1490，｜r｜>r0.01,5=0.874，线性关系显著。
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当T=298.15K时，V25 ℃=10-5.1705(1/h)，t0.9,25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃=1.69a。
当α=0.1,f=5时，t1-α/2,5=2.0150，lgV25 ℃=-4945.841/298.15+11.4179
±t1-α/2,5×s，V25 ℃=10-5.1705±0.3002)，t0.9，25 ℃=(100%-90%)/V25 ℃，上限为3.4 a，下限为0.85 a。
综合上述结果，暂定本注射液有效期为15 a。
5 实验结果与讨论
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5.1 关于降解反应规律考察 本文降解反应规律考察的目的在于加速实验条件的合理设计与安排。有效成分葛根素浓度的对数与时间线性关系良好，其降解反应规律符合1级反应。丹参素的降解按零级、1级或2级反应拟合，线性关系都较差，提示其降解反应规律复杂；但是由于初均速法的特点，药物有效成分的降解规律对其影响不大，故仍可应用。
5.2 关于初均速法预测制剂有效期 在反应初期药物分解小于10%，反应既可按1级速度过程处理，又可按零级速度过程处理[1]，若按零级反应处理则反应初期的初均速与反应速度常数相等，因此初均速与温度的关系也符合Arrhenius指数规律，将此直线外推至室温，则可得室温下的初均速，进而求得室温有效期。
初均速法预测制剂有效期有以下两个优点：第一，初均速法取样点在反应初期，可排除反应后期副反应的干扰；第二，由于增加了加速实验的温度数(一般7～9个)，因此就增加了按Arrhenius指数规律推算室温有效期的精确度。
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本文初均速法预测有效期结果尚待室温留样观察进一步证实。
参考文献：
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收稿日期：1998-12-07, http://www.100md.com