胞嘧啶脱氨酶基因治疗人胰腺癌的实验研究
作者：张世能 袁世珍
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院消化内科
关键词：胰腺肿瘤；胞嘧啶脱氨酶；基因疗法；癌胚抗原
中华医学杂志000403 【摘要】 目的 探讨腺病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因用于人胰腺癌基因疗法的可行性。方法 将含癌胚抗原(CEA)启动子的重组腺病毒感染人胰腺癌SW1990细胞和Capan-2细胞以及人宫颈癌Hela细胞，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测CD基因在细胞中的表达，以MTT法比较细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性差异。建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察CD基因的原位治疗效应及安全性。结果 腺病毒介导CD基因仅在分泌CEA的SW1990细胞中呈专一性表达，转导CD基因的SW1990细胞体外对5-FC的敏感性明显提高，IC50低于100 μmol/L，余者均IC50>1 000 μmol/L。体内实验显示CD基因原位转移对裸鼠胰腺癌疗效明显。结论 CD基因靶向性转导结合前体药5-FC疗法，可能成为人胰腺癌基因治疗的新途径。
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Experimental study on human pancreatic carcinoma treated by cytosine deaminase gene therapy
ZHANG Shineng
(Department of Gastroenterology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120, China)
YUAN Shizhen
(Department of Gastroenterology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120, China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To explore the possibility of Escherichia coli cytosine deaminase (CD) gene on human pancreatic carcinoma gene therapy. Methods Recombinant adenoviruses containing a carcinoembryonic antigen (CEA) promoter were transiently introduced into SW1990, Capan-2 and Hela cells, separately. The expression of CD gene mRNA was examined by RT-PCR. CD protein level in the transduced cells was analyzed by Western blotting. The sensitivity of the cells to 5-fluorocytosine (5-FC) was determined by MTT assay. Results A specific expression of cytosine deaminase gene by adenovirus-mediated transfer exhibited only in SW1990 cells (CEA-producing). Transduction of CD gene resulted in significant sensitivity of SW1990 cells to 5-FC. The anticancer effect was seen in vivo in SW1990 xenografts nude mice with in situ CD gene transduction. Conclusion The targeted expression of CD gene combined prodrug 5-FC may be a potential approach for gene therapy for human pancreatic carcinoma.
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【Key words】 Pancreatic neoplasms; Cytosine deaminase; Gene therapy; Carcinoembryonic antigen
胰腺癌是预后甚为恶劣的消化系常见肿瘤之一，探索胰腺癌的基因疗法具有极其重要的意义。新近发现的胞嘧啶脱氨酶基因，仅存在于真菌和大肠杆菌中，由于该酶具有将抗真菌药5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基后代谢为具细胞毒作用的5-氟尿嘧啶(5-FU)而倍受关注[1，2]。本研究选择人胰腺癌SW1990细胞(CEA+)和Capan-2细胞(CEA-)以及非胰腺肿瘤的宫颈癌Hela细胞(CEA-)为实验对象，以含癌胚抗原(CEA)启动子表达CD基因的重组腺病毒为载体，探讨CD基因应用于胰腺癌基因疗法的可行性。
材料与方法
一、材料
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1.主要试剂：5-FC购自美国Sigma公司。引物1 5′-TCGCTGCATAAAACCTTCG-3′，引物2 5′-TTGGCGACAAAGTAATACCG-3′由GIBCO/BRL公司合成。抗CD单克隆抗体(16D8F2)由德国Heidelberg大学分子医学中心Knebel教授惠赠。
2.细胞系和细胞培养：人胰腺癌SW1990、Capan-2细胞由美国加洲大学引进，人宫颈癌Hela细胞由本校实验动物中心提供，于含体积分数0.1的胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。293细胞由上海第二医科大学陈诗书教授惠赠，培养于含体积分数0.1的胎牛血清的MEM培养基中。
3.实验动物：Balb/c裸小鼠由本校实验动物中心提供(SPF级)。
二、方法
1.细胞培养上清CEA检测：酶免疫测定法。
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2.重组腺病毒的构建、扩增及滴度测定：含CEA启动子携带CD基因的重组腺病毒载体Adex1CEAprCD和对照病毒载体Adex1CEAprZ由日本东京癌症化疗中心Hamada博士构建并惠赠。重组腺病毒感染293细胞，2～3 d后收获细胞，反复冻融后离心，收集上清置-80℃保存备用。病毒感染滴度以空斑计数法测定。
3.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：常规异硫氰酸胍法提取细胞RNA，以下游引物合成cDNA，再以其为模板，进行PCR，若阳性表达者预期可扩增出239 bp长度的片段。
4.Western blot：参照文献[3]制备细胞蛋白粗提液，SDS-PAGE结束后，将凝胶蛋白电转移至硝酸纤维素滤膜上，室温下脱脂奶粉封闭，分别结合一抗(16D8F2)，二抗(HRP标记的大鼠抗小鼠IgG)，最后以DAB显色阳性条带。
5.基因转染与细胞体外生长试验：SW1990、Capan-2和Hela细胞分别铺96孔板，每孔约2×103个细胞，置体积分数为0.05的CO2培养箱中37℃静置培养24 h，用MOI为100的感染强度分别加入重组腺病毒Adex1CEA-prZ或Adex1CEA-prCD，12 h后加入含质量浓度为0、1、10、100、1 000 μmol/L 5-FC的培养液继续培养，每一浓度设4个复孔，以MTT法检测细胞存活率。实验重复3次。
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6.Adex1CEA-prCD/5-FC对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用：待SW1990皮下移植瘤长至约5 mm×5 mm时，分5组，每组5只。治疗组小鼠瘤体内注射0.1 ml(1×108 pfu)的Adex1CEA-prCD，对照各组则分别注射同量的PBS、Adex1CEA-prZ，每周2次，共2周。从第1次注射腺病毒后24h开始腹腔注射5-FC(500 mg.kg-1.d-1，连续2周)。治疗开始后每3 d测定肿瘤大小1次，肿瘤体积以3.14/6×长径×短径2计算。疗程结束时，拉颈处死裸鼠，取瘤体、肝、肾、肺、脑和肠组织，行常规组织切片病理检查。
7.统计学处理：各组间差异显著性检验采用方差分析。
结果
一、细胞培养液上清CEA检测
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SW1990细胞CEA检测呈阳性，Capan-2和Hela细胞者均呈阴性。
二、重组腺病毒感染滴度测定
Adex1CEA-prZ和Adex1CEA-prCD感染滴度为1.0×1012 pfu/L。重组腺病毒在293细胞核内复制。典型细胞病变为细胞胞膜收缩、变圆，聚集呈葡萄串状，细胞粘附性降低，最后细胞脱落、漂浮。
三、转染细胞CD基因表达水平的检测
结果显示Adex1CEA-prCD感染的细胞中，仅在SW1990细胞可扩增出239 bp的片段，而Capan-2和Hela细胞则未扩增出该片段。对照的SW1990、Capan-2和Hela细胞亦未扩增出该片段(图1)。Western blot结果亦显示，仅SW1990细胞表达相对分子质量约52 000的CD蛋白(图2)。z
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M.DNA ladder marker；1.阳性对照；2～4.Adex1CEAprCD感染的SW1990、Capan-2和Hela细胞；5～7.野生型SW1990、Capan-2和Hela细胞；8.阴性对照
图1 RT-PCR检测细胞CD基因的表达
1.蛋白分子量标志；2.野生型SW1990细胞；3.SW1990/CD细胞；4.野生型Capan-2细胞；5.Capan-2/CD细胞；6.野生型Hela细胞；7.Hela/CD细胞
图2 Western blot检测细胞CD基因蛋白水平的表达
四、转染细胞体外对5-FC的敏感性
Adex1CEA-prCD感染SW1990细胞后，使SW1990细胞对5-FC的敏感性明显提高，5-FC对SW1990/CD的IC50低于100 μmol/L，而5-FC对未转染CD基因的野生型SW1990细胞IC50>1 000 μmol/L。Capan-2和Hela细胞，野生型者与感染Adex1CEA-prCD者，对5-FC的敏感性未见明显改变(表1)。
, 百拇医药
表1 SW1990、Capan-2及Hela细胞对不同浓度
5-FC敏感性比较(抑制率，%) 组别
5-FC浓度(μmol/L)
1
10
100
1 000
野生型SW1990
2.5
4.1
5.7
7.6
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SW1990/Z
2.9**
4.5**
5.5**
9.1**
SW1990/CD
6.9*△
22.6*△
52.8*△
68.1*△
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Capan-2
3.0
3.5
4.0
5.8
Capan-2/Z
3.2
3.9
4.3
6.2
Capan-2/CD
2.8*
3.1*
, 百拇医药
5.3*
8.2*
Hela
3.1
3.3
4.0
6.5
Hela/Z
2.6
3.0
3.5
7.7
Hela/CD
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3.4*
2.9*
4.6*
6.6*
注：与野生型组比较**P>0.05，*P<0.01；与SW1990/Z组比较△P<0.01 五、Adex1CEA-prCD/5-FC对SW1990皮下移植瘤的生长抑制作用
治疗前各组裸鼠肿瘤体积：PBS组、Adex1CEA-prZ组、Adex1CEA-prZ/5-FC组、Adex1CEA-prCD组和Adex1CEA-prCD/5-FC组分别为75 mm3±51 mm3、70 mm3±37 mm3、68 mm3±21 mm3、74 mm3±62 mm3和72 mm3±37 mm3，各组间差异无显著意义(P>0.05)；治疗结束时，上述各组裸鼠肿瘤体积分别为480 mm3±50 mm3、423 mm3±136 mm3、414 mm3±191 mm3、426 mm3±88 mm3和161 mm3±30 mm3，与对照各组相比，Adex1CEA-prCD/5-FC治疗组裸鼠肿瘤体积明显缩小(P<0.01)。且Adex1CEA-prCD/5-FC治疗组的肿瘤组织切片中，肿瘤细胞数目明显少于对照组，以纤维组织为主，肿瘤组织中未见明显坏死灶。与对照各组相比，治疗组裸鼠肝、肾、肺、脑和肠组织未见明显的病理变化。
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讨论
迄今为止，5-FU仍为消化系肿瘤化疗的重要药物，在胰腺癌更成为首选药物[4]。CD基因由于具有将前体药5-FC转化为5-FU而呈现诱人的临床应用前景，由于自杀基因代谢产物多为细胞毒因子，因此，如何将自杀基因选择性表达于靶细胞，达到既可消除肿瘤又能保护正常组织和最大程度减低毒副反应的目的是关系到其能否真正应用于临床的关键[5]。本实验中，我们应用以含CEA启动子的重组腺病毒作为载体，将CD基因靶向性地转导分泌CEA的胰腺癌SW1990细胞。结果显示SW1990细胞在重组腺病毒感染后，外源CD基因在mRNA转录及蛋白水平均呈现阳性表达。同样条件下，外源CD基因在CEA-的Capan-2和Hela细胞中则不表达，从而进一步证实应用组织特异性调控元件可以实现自杀基因的靶向性转导[6]。
我们以重组腺病毒Adex1CEA-prCD感染肿瘤细胞后，转染细胞体外对5-FC敏感性的差异有显著意义，5-FC对SW1990细胞具有显著的生长抑制效应，缘于经基因修饰后，表达CD蛋白的SW1990细胞被赋予了酶解5-FC为5-FU的新的生物学活性，因而导致其对5-FC的敏感性提高，生长受抑，呈现细胞自杀现象。而同时以重组腺病毒Adex1CEA-prZ者，虽然在较高浓度5-FC时可观察到一定的细胞抑制效应，但与前者相比，作用甚微。表明上述作用并非缺陷性腺病毒的作用所致。
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在体内研究中，我们观察到Adex1CEA-prCD/5-FC对裸鼠SW1990胰腺癌皮下移植瘤具有明显的原位治疗效应，观察期内治疗组动物全部存活，同时在肝、肾、肺、脑和肠等重要脏器组织未观察到明显的毒性反应。初步显示转导CD基因合用前体药物5-FC对人胰腺癌具有抗癌作用。然而，众所周知，腺病毒载体并非理想的基因转导载体，其主要不足在于机体对腺病毒载体产生的抗原特异性细胞免疫和体液免疫反应，使腺病毒介导的外源基因仅能短暂表达，且再次进行腺病毒载体转基因时外源基因无法在体内表达；另外，CEA亦并非胰腺癌特异性标志物，因此，真正将CD基因应用到胰腺癌临床尚有大量工作要完成。
基金项目：卫生部临床学科重点基金资助项目(920027-2)
参考文献
1，Austin EA, Huber BE. A first step in development of gene therapy for colorectal carcinoma cloning sequencing and expression of Escherichia coli cytosine deaminase. Mol Pharmacol, 1992, 43: 380-387.
, http://www.100md.com
2，Lawrence TS, Rehemhulla A, Ng EY, et al. Preferential cytotoxicity of cells transduced with cytosine deaminase compared to bystander cells after treatment with 5-flucytosine. Cancer Res, 1998, 58: 2589-2593.
3，Haack K, Moebius U, van Doeberitz M Knebel, et al. Detective of cytosine deaminase in genetically modified tumor cells by specific antibodies. Hum Gene Ther, 1997, 8:1395-1401.
4，Dippold W, Bernhard H, Meyer zum Buschenfelde KH. Chemotherapy in advanced pancreatic cancer. Int J Pancreatol, 1997, 21: 39-45.
5，张世能, 袁世珍. 胞嘧啶脱氨酶基因治疗消化道肿瘤研究进展. 国外医学.内 科学分册, 1999, 26: 249-251.
6，Kanai F, Lan KH, Shiratori Y, et al. In vivo gene therapy for α-fetoprotein producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer Res, 1997, 57: 461-464.
(收稿日期：1999-09-18), 百拇医药
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院消化内科
关键词：胰腺肿瘤；胞嘧啶脱氨酶；基因疗法；癌胚抗原
中华医学杂志000403 【摘要】 目的 探讨腺病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因用于人胰腺癌基因疗法的可行性。方法 将含癌胚抗原(CEA)启动子的重组腺病毒感染人胰腺癌SW1990细胞和Capan-2细胞以及人宫颈癌Hela细胞，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测CD基因在细胞中的表达，以MTT法比较细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性差异。建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察CD基因的原位治疗效应及安全性。结果 腺病毒介导CD基因仅在分泌CEA的SW1990细胞中呈专一性表达，转导CD基因的SW1990细胞体外对5-FC的敏感性明显提高，IC50低于100 μmol/L，余者均IC50>1 000 μmol/L。体内实验显示CD基因原位转移对裸鼠胰腺癌疗效明显。结论 CD基因靶向性转导结合前体药5-FC疗法，可能成为人胰腺癌基因治疗的新途径。
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Experimental study on human pancreatic carcinoma treated by cytosine deaminase gene therapy
ZHANG Shineng
(Department of Gastroenterology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120, China)
YUAN Shizhen
(Department of Gastroenterology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120, China)
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【Abstract】 Objective To explore the possibility of Escherichia coli cytosine deaminase (CD) gene on human pancreatic carcinoma gene therapy. Methods Recombinant adenoviruses containing a carcinoembryonic antigen (CEA) promoter were transiently introduced into SW1990, Capan-2 and Hela cells, separately. The expression of CD gene mRNA was examined by RT-PCR. CD protein level in the transduced cells was analyzed by Western blotting. The sensitivity of the cells to 5-fluorocytosine (5-FC) was determined by MTT assay. Results A specific expression of cytosine deaminase gene by adenovirus-mediated transfer exhibited only in SW1990 cells (CEA-producing). Transduction of CD gene resulted in significant sensitivity of SW1990 cells to 5-FC. The anticancer effect was seen in vivo in SW1990 xenografts nude mice with in situ CD gene transduction. Conclusion The targeted expression of CD gene combined prodrug 5-FC may be a potential approach for gene therapy for human pancreatic carcinoma.
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【Key words】 Pancreatic neoplasms; Cytosine deaminase; Gene therapy; Carcinoembryonic antigen
胰腺癌是预后甚为恶劣的消化系常见肿瘤之一，探索胰腺癌的基因疗法具有极其重要的意义。新近发现的胞嘧啶脱氨酶基因，仅存在于真菌和大肠杆菌中，由于该酶具有将抗真菌药5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基后代谢为具细胞毒作用的5-氟尿嘧啶(5-FU)而倍受关注[1，2]。本研究选择人胰腺癌SW1990细胞(CEA+)和Capan-2细胞(CEA-)以及非胰腺肿瘤的宫颈癌Hela细胞(CEA-)为实验对象，以含癌胚抗原(CEA)启动子表达CD基因的重组腺病毒为载体，探讨CD基因应用于胰腺癌基因疗法的可行性。
材料与方法
一、材料
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1.主要试剂：5-FC购自美国Sigma公司。引物1 5′-TCGCTGCATAAAACCTTCG-3′，引物2 5′-TTGGCGACAAAGTAATACCG-3′由GIBCO/BRL公司合成。抗CD单克隆抗体(16D8F2)由德国Heidelberg大学分子医学中心Knebel教授惠赠。
2.细胞系和细胞培养：人胰腺癌SW1990、Capan-2细胞由美国加洲大学引进，人宫颈癌Hela细胞由本校实验动物中心提供，于含体积分数0.1的胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。293细胞由上海第二医科大学陈诗书教授惠赠，培养于含体积分数0.1的胎牛血清的MEM培养基中。
3.实验动物：Balb/c裸小鼠由本校实验动物中心提供(SPF级)。
二、方法
1.细胞培养上清CEA检测：酶免疫测定法。
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2.重组腺病毒的构建、扩增及滴度测定：含CEA启动子携带CD基因的重组腺病毒载体Adex1CEAprCD和对照病毒载体Adex1CEAprZ由日本东京癌症化疗中心Hamada博士构建并惠赠。重组腺病毒感染293细胞，2～3 d后收获细胞，反复冻融后离心，收集上清置-80℃保存备用。病毒感染滴度以空斑计数法测定。
3.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：常规异硫氰酸胍法提取细胞RNA，以下游引物合成cDNA，再以其为模板，进行PCR，若阳性表达者预期可扩增出239 bp长度的片段。
4.Western blot：参照文献[3]制备细胞蛋白粗提液，SDS-PAGE结束后，将凝胶蛋白电转移至硝酸纤维素滤膜上，室温下脱脂奶粉封闭，分别结合一抗(16D8F2)，二抗(HRP标记的大鼠抗小鼠IgG)，最后以DAB显色阳性条带。
5.基因转染与细胞体外生长试验：SW1990、Capan-2和Hela细胞分别铺96孔板，每孔约2×103个细胞，置体积分数为0.05的CO2培养箱中37℃静置培养24 h，用MOI为100的感染强度分别加入重组腺病毒Adex1CEA-prZ或Adex1CEA-prCD，12 h后加入含质量浓度为0、1、10、100、1 000 μmol/L 5-FC的培养液继续培养，每一浓度设4个复孔，以MTT法检测细胞存活率。实验重复3次。
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6.Adex1CEA-prCD/5-FC对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用：待SW1990皮下移植瘤长至约5 mm×5 mm时，分5组，每组5只。治疗组小鼠瘤体内注射0.1 ml(1×108 pfu)的Adex1CEA-prCD，对照各组则分别注射同量的PBS、Adex1CEA-prZ，每周2次，共2周。从第1次注射腺病毒后24h开始腹腔注射5-FC(500 mg.kg-1.d-1，连续2周)。治疗开始后每3 d测定肿瘤大小1次，肿瘤体积以3.14/6×长径×短径2计算。疗程结束时，拉颈处死裸鼠，取瘤体、肝、肾、肺、脑和肠组织，行常规组织切片病理检查。
7.统计学处理：各组间差异显著性检验采用方差分析。
结果
一、细胞培养液上清CEA检测
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SW1990细胞CEA检测呈阳性，Capan-2和Hela细胞者均呈阴性。
二、重组腺病毒感染滴度测定
Adex1CEA-prZ和Adex1CEA-prCD感染滴度为1.0×1012 pfu/L。重组腺病毒在293细胞核内复制。典型细胞病变为细胞胞膜收缩、变圆，聚集呈葡萄串状，细胞粘附性降低，最后细胞脱落、漂浮。
三、转染细胞CD基因表达水平的检测
结果显示Adex1CEA-prCD感染的细胞中，仅在SW1990细胞可扩增出239 bp的片段，而Capan-2和Hela细胞则未扩增出该片段。对照的SW1990、Capan-2和Hela细胞亦未扩增出该片段(图1)。Western blot结果亦显示，仅SW1990细胞表达相对分子质量约52 000的CD蛋白(图2)。z
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M.DNA ladder marker；1.阳性对照；2～4.Adex1CEAprCD感染的SW1990、Capan-2和Hela细胞；5～7.野生型SW1990、Capan-2和Hela细胞；8.阴性对照
图1 RT-PCR检测细胞CD基因的表达
1.蛋白分子量标志；2.野生型SW1990细胞；3.SW1990/CD细胞；4.野生型Capan-2细胞；5.Capan-2/CD细胞；6.野生型Hela细胞；7.Hela/CD细胞
图2 Western blot检测细胞CD基因蛋白水平的表达
四、转染细胞体外对5-FC的敏感性
Adex1CEA-prCD感染SW1990细胞后，使SW1990细胞对5-FC的敏感性明显提高，5-FC对SW1990/CD的IC50低于100 μmol/L，而5-FC对未转染CD基因的野生型SW1990细胞IC50>1 000 μmol/L。Capan-2和Hela细胞，野生型者与感染Adex1CEA-prCD者，对5-FC的敏感性未见明显改变(表1)。
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表1 SW1990、Capan-2及Hela细胞对不同浓度
5-FC敏感性比较(抑制率，%) 组别
5-FC浓度(μmol/L)
1
10
100
1 000
野生型SW1990
2.5
4.1
5.7
7.6
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SW1990/Z
2.9**
4.5**
5.5**
9.1**
SW1990/CD
6.9*△
22.6*△
52.8*△
68.1*△
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Capan-2
3.0
3.5
4.0
5.8
Capan-2/Z
3.2
3.9
4.3
6.2
Capan-2/CD
2.8*
3.1*
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8.2*
Hela
3.1
3.3
4.0
6.5
Hela/Z
2.6
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3.5
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Hela/CD
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2.9*
4.6*
6.6*
注：与野生型组比较**P>0.05，*P<0.01；与SW1990/Z组比较△P<0.01 五、Adex1CEA-prCD/5-FC对SW1990皮下移植瘤的生长抑制作用
治疗前各组裸鼠肿瘤体积：PBS组、Adex1CEA-prZ组、Adex1CEA-prZ/5-FC组、Adex1CEA-prCD组和Adex1CEA-prCD/5-FC组分别为75 mm3±51 mm3、70 mm3±37 mm3、68 mm3±21 mm3、74 mm3±62 mm3和72 mm3±37 mm3，各组间差异无显著意义(P>0.05)；治疗结束时，上述各组裸鼠肿瘤体积分别为480 mm3±50 mm3、423 mm3±136 mm3、414 mm3±191 mm3、426 mm3±88 mm3和161 mm3±30 mm3，与对照各组相比，Adex1CEA-prCD/5-FC治疗组裸鼠肿瘤体积明显缩小(P<0.01)。且Adex1CEA-prCD/5-FC治疗组的肿瘤组织切片中，肿瘤细胞数目明显少于对照组，以纤维组织为主，肿瘤组织中未见明显坏死灶。与对照各组相比，治疗组裸鼠肝、肾、肺、脑和肠组织未见明显的病理变化。
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讨论
迄今为止，5-FU仍为消化系肿瘤化疗的重要药物，在胰腺癌更成为首选药物[4]。CD基因由于具有将前体药5-FC转化为5-FU而呈现诱人的临床应用前景，由于自杀基因代谢产物多为细胞毒因子，因此，如何将自杀基因选择性表达于靶细胞，达到既可消除肿瘤又能保护正常组织和最大程度减低毒副反应的目的是关系到其能否真正应用于临床的关键[5]。本实验中，我们应用以含CEA启动子的重组腺病毒作为载体，将CD基因靶向性地转导分泌CEA的胰腺癌SW1990细胞。结果显示SW1990细胞在重组腺病毒感染后，外源CD基因在mRNA转录及蛋白水平均呈现阳性表达。同样条件下，外源CD基因在CEA-的Capan-2和Hela细胞中则不表达，从而进一步证实应用组织特异性调控元件可以实现自杀基因的靶向性转导[6]。
我们以重组腺病毒Adex1CEA-prCD感染肿瘤细胞后，转染细胞体外对5-FC敏感性的差异有显著意义，5-FC对SW1990细胞具有显著的生长抑制效应，缘于经基因修饰后，表达CD蛋白的SW1990细胞被赋予了酶解5-FC为5-FU的新的生物学活性，因而导致其对5-FC的敏感性提高，生长受抑，呈现细胞自杀现象。而同时以重组腺病毒Adex1CEA-prZ者，虽然在较高浓度5-FC时可观察到一定的细胞抑制效应，但与前者相比，作用甚微。表明上述作用并非缺陷性腺病毒的作用所致。
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在体内研究中，我们观察到Adex1CEA-prCD/5-FC对裸鼠SW1990胰腺癌皮下移植瘤具有明显的原位治疗效应，观察期内治疗组动物全部存活，同时在肝、肾、肺、脑和肠等重要脏器组织未观察到明显的毒性反应。初步显示转导CD基因合用前体药物5-FC对人胰腺癌具有抗癌作用。然而，众所周知，腺病毒载体并非理想的基因转导载体，其主要不足在于机体对腺病毒载体产生的抗原特异性细胞免疫和体液免疫反应，使腺病毒介导的外源基因仅能短暂表达，且再次进行腺病毒载体转基因时外源基因无法在体内表达；另外，CEA亦并非胰腺癌特异性标志物，因此，真正将CD基因应用到胰腺癌临床尚有大量工作要完成。
基金项目：卫生部临床学科重点基金资助项目(920027-2)
参考文献
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(收稿日期：1999-09-18), 百拇医药