6种金属元素对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响
作者：沈维干 陈彦 李朝军 李霖 季全兰 贡昌春
单位：陈彦(徐州医学院)；李霖(扬州教育学院)；李朝军(南京师范大学生命科学学院)；沈维干 李霖 季全兰 贡昌春(扬州大学医学院，扬州 225001)
关键词：金属元素；卵母细胞；第一极体；生发泡破裂；体外受精
卫生研究000404 摘要：为研究镉、铅、镍、锰、铬、铝元素的生殖毒性，采用卵母细胞体外培养、体外受精的方法，观察它们对卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果显示除了铝外，其它各金属元素均可以明显降低小鼠超排卵数；6个剂量组均可以抑制卵母细胞的成熟，显著降低卵母细胞第一极体释放率、体外受精率和细胞存活率，对体内卵母细胞的生发泡破裂没有影响，但是对体外培养卵母细胞的生发泡破裂有明显的抑制作用(铝组除外)。结果提示，这些金属元素被人体过量吸收后，可以破坏育龄妇女卵母细胞正常成熟，使受精能力下降，甚至导致不孕或不育。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q132.7 X503 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0202-03
Effects of 6 kinds of metal elements on meiotic maturation
and in vitro fertilizaton on mouse oocyte
Shen Weigan, Chen Yan, Li Chaojun, Li Lin, et al.
(Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001，China)
Abstract：To study the effects of Cd, Pb, Ni, Mn, Cr and Al on reproductive toxicity, the meiotic maturation and in vitro fertilization(IVF) of mouse oocytes were studied using in vitro culture and IVF of mouse oocytes. The results showed that except Al(NO3)2, the other groups [CdCl2, Pb(NO3)2, NiCl2, MnSO4 and CrCl3] could significantly reduce the number of superovulation oocyte. All of them could inhibit the meiotic maturation, the rates of IVF and extruding of the first polar body, but there was no impact on the germinal vesicle breakdown (GVBD) in vivo. The results also showed that except Al(NO3)3, other elements could obviously inhibit germinal vesicle breakdown of mouse oocytes. The results suggested that these elements might damage the process of meiotic maturation of oocyte of women at child-bearing age oocyte and reduce the fertility and reproductive capacity and result in sterily.
, 百拇医药
Key words:metal element, oocyte, first polar body, germinal vesicle breakdown,in vitro fertilization
有关研究表明，香烟烟雾以及各类环境污染物中含有较高浓度的镉、铅、镍、锰、铬、铝等元素，如镉的含量在不同品牌香烟中含量可达0.07～2μg/支，铅可达0.2～1.5μg/支[1，2]，而且随着工、农业的发展，人们接触这些金属元素的机会越来越多，如汽车尾气、美容美发及化妆品中高浓度的铅，各种烹调器具、工业“三废”等中均含有较高浓度的这些金属元素。这些金属元素中有些是生命必需的元素，如锰、铬、铝、镍等，有些则是非必需的有毒金属元素，如镉、铅等[1]。相关文献报道显示，这些金属元素在过量时有些具有致癌、致畸、致突变作用，对人类健康产生多方面的损伤；有些具有明显的生殖毒性和发育毒性[1，3～6]。
, 百拇医药 为了进一步研究香烟烟雾的生殖毒性机理，我们采用卵母细胞体外培养和体外受精的方法，研究了这些金属元素对卵母细胞成熟和受精能力的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 培养液 培养液为DMEM(低糖)+牛血清白蛋白(boving serum albumin, BSA)(Sigma产品)；体外受精是在Toyodo Yokojama and Hoshi(TYH)液中进行；胚胎细胞培养是在Chatot Ziomek Bavister(CZB)液+谷氨酰胺(Sigma产品)中进行；操作工作液为M2培养液和M2+次黄嘌呤(用以抑制卵母细胞的自发成熟)。
1.1.2 试剂 氯化镉(CdCl2)、硝酸铅[Pb(NO3)2]、氯化镍(NiCl2)、硫酸锰(MnSO4)、氯化铬(CrCl3)、硝酸铝[Al(NO3)3]、透明质酸酶、矿物油(Sigma产品)；孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)(天津激素厂)；人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)(南大制药厂)。
, 百拇医药
1.1.3 实验动物 21日龄的ICR小鼠(南京铁道医学院动物中心，合格证号为苏动质字第97002号)
1.2 方法
1.2.1 小鼠体内实验和体外受精实验 设立空白对照组(CR组，腹腔注射生理盐水)和CdCl2、Pb(NO3)2、NiCl2、MnSO4、CrCl3、Al(NO3)3腹腔注射组，每组12只小鼠，连续腹腔注射3d，各组小鼠在末次腹腔注射金属盐溶液前2d腹腔注射5IU的PMSG促使卵泡发育，2d后腹腔注射5IU的hCG进行超排卵，hCG作用14～17h后，按沈维干等的方法获取卵母细胞[7]，每组中取6只小鼠，用吸卵管将带有大量颗粒细胞的卵母细胞移入含透明质酸酶(150IU/ml)的培养液中，室温放置20min，待颗粒细胞从卵母细胞上脱落下来，用吸卵管反复吹打后将卵母细胞移入覆盖有矿物油的50μl DMEM+BSA培养液微滴中，立即在倒置显微镜下观察并记录各组卵母细胞的发育情况，以生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)作为减数分裂启动的标志，第一极体释放作为第一次减数分裂完成的标志。接着继续培养，按不同培养时间观察并记录实验结果。用吸卵管将每组另6只小鼠的卵母细胞(含有大量颗粒细胞)移入100μl的TYH液中进行体外受精(in vitro fertilization, IVF),IVF按李朝军等的方法进行[8]，受精6h，再移入100μl的CZB+谷氨酰胺的培养液中继续培养，24h后观察IVF结果，受精率以2-细胞胚胎数(或2-细胞以上胚胎数)占成熟卵母细胞(排出第一极体)的比例表示。
, 百拇医药
1.2.2 小鼠卵母细胞的获取和培养 21d的雌小鼠经5IU的PMSG促进卵泡发育48h后，用颈椎脱位法处死，取出卵巢于M2+次黄嘌呤的操作液中，按沈维干等的方法获取有卵丘细胞的卵母细胞(cumulus-oocyte complexes,COC)和无卵丘细胞的卵母细胞(denuded oocytes,DO)[8],再移入M2中充分洗去次黄嘌呤后进一步筛选出生发泡完整的卵母细胞(COC和DO)，置于覆盖有矿物油的分别含有CdCl2、Pb(NO3)2、NiCl2、MnSO4、CrCl3、Al(NO3)3的50μl DMEM+BSA的培养液微滴中，培养8h时观察各组的卵母细胞的GVBD情况，24h时观察卵母细胞的第一极体释放率和存活率。
卵母细胞培养及体外受精是在37℃、湿度饱和的5% CO2培养箱中进行。
, 百拇医药
1.2.3 统计方法 利用SPSS 8.0统计软件，采用t检验进行统计学处理。
2 实验结果
2.1 金属元素对体内卵母细胞成熟和体外培养的影响
由表1、表2可见，各实验组均可以极显著地抑制体内和体外培养卵母细胞第一极体的释放率和细胞存活率，但是对GVBD没有影响，除了铝外，其他5种金属元素可以降低小鼠平均超排卵母细胞数(CdCl2组t=4.497，v=10,P<0.01；Pb(NO3)2组t=3.595，v=10,P<0.01；NiCl2组t=2.783，v=10,P<0.05；MnSO4组t=7.236，v=10，P<0.01，CrCl3组t=4.692，v=10,P<0.01)。
, http://www.100md.com 表1 金属元素对小鼠卵母细胞成熟的影响 (
±s)(1)% 组别
第一极体释放率
卵母细胞存活率
0h
24h
48h
0h
24h
48h
对照组
63.53±2.75
, http://www.100md.com
73.18±2.67
74.37±3.15
98.31±2.42
84.19±3.75
65.36±4.84
CdCl2
28.41±7.78
42.04±7.71
56.30±6.89
79.54±5.75
55.68±6.47
, 百拇医药
51.14±6.65
Pb(NO3)2
44.05±4.42
48.02±4.73
54.13±4.11
80.04±5.37
66.40±5.79
55.65±6.20a
NiCl2
40.43±6.62
50.02±6.78
, http://www.100md.com
53.19±7.03
83.99±4.50
69.55±5.59
58.47±5.42a
MnSO4
35.71±5.65
36.73±6.68
38.78±7.07
71.43±4.67
56.12±4.98
45.92±5.24
, 百拇医药
CrCl3
45.05±3.68
61.32±3.97
62.07±4.51
75.82±3.44
60.44±4.28
53.85±5.06
Al(NO3)3
45.56±3.69
52.31±4.48
55.71±4.17
, 百拇医药
78.57±3.39
67.72±4.53
58.65±4.99a
注：(1) 与对照组相比，除标a组P<0.05外，其余各组P<0.01表2 金属元素对小鼠平均超排卵数和卵母细胞GVBD的影响 组别
剂量
(mg/kgBW)
平均超排卵数
(±s)
t
, 百拇医药 P
GVBD率
(%)
对照组
0
43.48±3.28
—
—
100
CdCl2
0.02
37.66±4.31
4.497
, 百拇医药
<0.01
100
Pb(NO3)2
0.04
35.37±3.37
3.595
<0.01
100
NiCl2
0.08
39.54±3.08
2.783
, 百拇医药
<0.05
100
MnSO4
0.03
39.40±2.19
7.236
<0.01
100
CrCl3
0.01
36.25±4.37
4.692
, 百拇医药
<0.01
100
Al(NO3)3
0.15
42.43±2.13
100
2.2 金属元素对卵母细胞IVF的影响
由表3可见，各实验组24h时的总受精率都显著低于对照组(P<0.01)，随着体外培养的进行，实验组的总受精率都有明显提高；除了48h和72h时铝组的总受精率与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，镉、铅、镍、锰、铬组与对照组相比，48h和72h时的总受精率差异均有极显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 金属元素对体外培养小鼠卵母细胞成熟的影响
由表4可见，培养8h时Al组对体外培养卵母细胞GVBD无影响，其它各组的GVBD率与对照组相比下降有显著性，培养24h时各组的第一极体释放率和体外存活率与对照组相比下降均有显著性(P<0.01)。
3 讨论
国内外有关镉、铅、镍、锰、铬、铝对生殖作用的影响的研究表明，镉对哺乳动物有较强的致畸、致癌和致突变作用，被机体吸收后，自然排泄十分缓慢，其生物半衰期达9～30年[1]；镉可以降低IVF后的胚胎移植的成活率，还能导致超排卵的数目减少[3]。镉可以在妇女的血液和滤泡液中聚集，可以对颗粒细胞造成伤害，导致妇女有关生殖的类固醇激素的水平的破坏，造成生殖紊乱；镉可以阻止体外培养卵母细胞进入减数分裂的MII[9]。铅可以抑制着床过程，饮用含铅的水可以使大鼠和小鼠的妊娠率、着床率明显降低；铅还可以经胎盘和乳汁转移，直接对胎儿和婴儿造成危害，导致自然流产、早产、畸胎和婴幼儿行为异常增多[1，4]；镍化合物可以通过胎盘产生胚胎毒性和致畸性[1，5]；雄鼠接触NiCl2会降低雌鼠的怀孕率和胚胎数，显著降低睾丸重量和受精能力[10]；NiCl2可以使输精管萎缩，使曲细精管堵塞，导致精原细胞形成数量下降，生殖力下降；当雌鼠接触NiCl2时，哺乳期的幼子死亡率提高[11]。染锰对大鼠胚胎和子代的生长发育有明显的毒性作用[6]。在妊娠期和哺乳期接触三价铬和六价铬，雌鼠的后代在成年后的生殖功能和生殖能力明显减弱[12]；成年雌雄鼠接触铬对受精力和生殖力都有不利影响，可以引起雄鼠的生殖力显著下降，雌鼠的吸收胎和死胎数增加，着床数、成活胚胎数显著减少，卵巢重量显著下降[13]。铝是自然界含量最多的金属元素之一，过量的铝可以抑制卵母细胞的成熟，并具有致畸作用[1，7]。
, 百拇医药
表3 金属元素对小鼠卵母细胞IVF的影响(±s)% 组别
2-细胞胚胎率
3-细胞胚胎率
总受精率
24h
48h
72h
24h
48h
72h
24h
, http://www.100md.com
48h
72h
对照组
74.16±5.77
20.01±2.55
9.26±2.57
0
52.33±4.41
64.81±2.28
74.16±5.77
74.16±5.77
74.16±5.77
, 百拇医药
CdCl2
18.64±2.21
32.93±3.01
32.18±3.03
0
20.69±3.77
27.59±3.41
18.64±4.15(2)
53.09±5.54(2)
58.91±5.56(2)
Pb(NO3)2
, 百拇医药
29.00±4.18
21.21±3.10
15.15±4.15
0
22.73±3.13
37.88±3.98
29.00±4.18(2)
44.00±8.21(2)
44.00±8.21(2)
NiCl2
28.99±1.12
, 百拇医药
33.33±2.74
17.39±4.88
0
21.74±3.33
39.13±4.76
28.99±1.12(2)
54.23±6.13(2)
55.77±4.28(2)
MnSO4
46.67±2.85
37.18±3.03
, 百拇医药
30.77±5.18
0
14.10±3.65
24.36±3.39
46.67±2.85(2)
49.75±3.33(2)
55.33±1.58(2)
CrCl3
46.25±3.30
38.75±4.79
22.50±5.64
, 百拇医药
0
25.00±3.77
41.25±4.96
46.25±3.30(2)
63.50±6.30(2)
63.50±6.30(2)
Al(NO3)3
61.33±5.76
25.93±3.47
19.75±4.79
, 百拇医药
0
39.51±3.65
45.68±4.58
61.33±5.76(2)
65.33±5.58(1)
65.33±5.58(1)
注：与对照组相比(1)P<0.05(2)P<0.01表4 金属元素对体外培养卵母细胞的影响(±s)% 组别
剂量
(μg/L)
, http://www.100md.com
GVBD
率
第一极体
释放率
卵母细胞
存活率
对照组
0
100
70.01±2.03
85.71±3.13
CdCl2
1.6
, http://www.100md.com
94.08±3.23(2)
41.98±4.45(2)
63.16±6.99(2)
Pb(NO3)2
4.0
93.56±4.39(1)
39.39±5.41(2)
60.48±7.00(2)
NiCl2
, 百拇医药
8.0
95.25±4.18(1)
44.33±4.55(2)
70.59±5.76(2)
MnSO4
2.7
91.35±3.87(2)
33.77±6.03(2)
76.64±4.85(1)
CrCl3
, 百拇医药
1.0
91.79±4.28(2)
41.11±5.52(2)
75.57±3.50(2)
Al(NO3)3
1.5
100
60.01±3.20(2)
74.23±3.44(2)
注：与对照组相比(1)P<0.05 (2)P<0.01 上述金属元素的毒性作用的机制比较复杂，这些金属元素在较高浓度时，一方面可能对遗传物质的有损伤作用，特别是引起卵母细胞染色体的损伤，如引起二倍体卵母细胞的产生，使得卵母细胞不能正常释放第一极体；另一方面，可能会影响细胞内的微管的正常合成和组装，使纺锤体、有丝分裂器不能正常形成和移动，细胞分裂无法正常进行，第一极体不能形成，无法进入第二次减数分裂，精子和卵细胞不能正常受精，从而导致IVF率下降。
, http://www.100md.com
我国是烟草生产和销售大国，吸烟人数所占比例较大，妇女、儿童被动吸烟现象十分严重。我国又是一个发展中国家，环境质量不容乐观，各类环境污染相当严重，污染的大气、水源，甚至一些加工食品、生活器具、美容美发及各类化妆品可能含有较高浓度的上述金属元素。我们通过对香烟中含量较高的这几种金属元素对生殖作用影响的研究发现，这些金属元素在较高浓度时均可以损害小鼠卵母细胞第一次减数分裂的进行，抑制卵母细胞的成熟和受精能力，降低卵母细胞的质量和存活率，说明香烟中对生殖作用影响较大的物质可能是含量较高的上述几种金属元素或者还有一些目前尚不清楚的毒性成分，但是其作用机制还有待于进一步研究。
本实验结果提示，育龄妇女在过量接触上述6种金属元素时，可能会导致生殖功能下降，甚至不孕。
基金项目：江苏省自然科学基金(No.BK99064)
作者简介：沈维干，男，硕士，讲师
, 百拇医药
参考文献
1，王夔.生命科学中的微量元素(下卷).北京：中国计量出版社，1992，566—590
2，陆宝玉，陈宝春，赵炳成，等.三种卷烟的成分及其对健康的影响.卫生研究，1990，19(2)：18—21
3，Zenzes MT, Zhang HM, Krishnan S, et al. Cadmium accumulation in follicular fluid of women in vitro fertilization-embryo transfer is higher in smokers. Fertil Steril,1995,64(3)：599—603
4，周仁，施明霞，张银凤，等.铅对女工及其子代健康的影响.劳动医学，1988，5(3)：42—44
, 百拇医药
5，马明月，苏雅，李宏革，等.镍对雌性大鼠生殖功能影响的研究.中国公共卫生学报，1998，17(2)：104—105
6，刘佳娟，杨伯宁，柯铭华，等.锰对雌性大鼠繁殖的影响.广西预防医学，1995，1(6)：346—347
7，沈维干，季全兰，李朝军，等.铝对体外培养小鼠卵母细胞减数分裂的影响.卫生研究，1999，28(5)：267—268
8，李朝军，王斌，范必勤，等.小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究.南京大学学报(自然科学版)，1997，33(2)：265—272
9，Pisa J, Cibulka J, Ptacek M. Effect of subcutaneous application of a single cadmium dose on oocyte maturation in vitro. Physiol Bohemoslov,1990,39(2):182—190
, 百拇医药
10，Xie J, Funakoshi T, Shimada H, et al. Effects of chelating agents on testicular toxicity in mice caused by acute exposure to nickel. Toxicity,1995,103(3):147—155
11，Kakela R, Kakela A, Hyvarinen H. Effects of nickel chloride on reproduction of the rat and possible antagonistic role of selenium. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol,1999,123(1):27—37
12，Al Hamood MH, Elbetieha A, Bataineh H. Sexual maturation and fertility of male and female mice exposed prenatally and postnatally to trivalent and hexavalent chromium compounds. Reprod Fertil Dev, 1998,10(2):179—183
13，Elbetieha A, Al Hamood MH. Long-term exposure of male and female mice to trivalent and hexavalent chromium compounds effect on fertility. Toxicity,1997,116(1—3)：39—47
(1999-10-27收稿), 百拇医药
单位：陈彦(徐州医学院)；李霖(扬州教育学院)；李朝军(南京师范大学生命科学学院)；沈维干 李霖 季全兰 贡昌春(扬州大学医学院，扬州 225001)
关键词：金属元素；卵母细胞；第一极体；生发泡破裂；体外受精
卫生研究000404 摘要：为研究镉、铅、镍、锰、铬、铝元素的生殖毒性，采用卵母细胞体外培养、体外受精的方法，观察它们对卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果显示除了铝外，其它各金属元素均可以明显降低小鼠超排卵数；6个剂量组均可以抑制卵母细胞的成熟，显著降低卵母细胞第一极体释放率、体外受精率和细胞存活率，对体内卵母细胞的生发泡破裂没有影响，但是对体外培养卵母细胞的生发泡破裂有明显的抑制作用(铝组除外)。结果提示，这些金属元素被人体过量吸收后，可以破坏育龄妇女卵母细胞正常成熟，使受精能力下降，甚至导致不孕或不育。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q132.7 X503 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0202-03
Effects of 6 kinds of metal elements on meiotic maturation
and in vitro fertilizaton on mouse oocyte
Shen Weigan, Chen Yan, Li Chaojun, Li Lin, et al.
(Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001，China)
Abstract：To study the effects of Cd, Pb, Ni, Mn, Cr and Al on reproductive toxicity, the meiotic maturation and in vitro fertilization(IVF) of mouse oocytes were studied using in vitro culture and IVF of mouse oocytes. The results showed that except Al(NO3)2, the other groups [CdCl2, Pb(NO3)2, NiCl2, MnSO4 and CrCl3] could significantly reduce the number of superovulation oocyte. All of them could inhibit the meiotic maturation, the rates of IVF and extruding of the first polar body, but there was no impact on the germinal vesicle breakdown (GVBD) in vivo. The results also showed that except Al(NO3)3, other elements could obviously inhibit germinal vesicle breakdown of mouse oocytes. The results suggested that these elements might damage the process of meiotic maturation of oocyte of women at child-bearing age oocyte and reduce the fertility and reproductive capacity and result in sterily.
, 百拇医药
Key words:metal element, oocyte, first polar body, germinal vesicle breakdown,in vitro fertilization
有关研究表明，香烟烟雾以及各类环境污染物中含有较高浓度的镉、铅、镍、锰、铬、铝等元素，如镉的含量在不同品牌香烟中含量可达0.07～2μg/支，铅可达0.2～1.5μg/支[1，2]，而且随着工、农业的发展，人们接触这些金属元素的机会越来越多，如汽车尾气、美容美发及化妆品中高浓度的铅，各种烹调器具、工业“三废”等中均含有较高浓度的这些金属元素。这些金属元素中有些是生命必需的元素，如锰、铬、铝、镍等，有些则是非必需的有毒金属元素，如镉、铅等[1]。相关文献报道显示，这些金属元素在过量时有些具有致癌、致畸、致突变作用，对人类健康产生多方面的损伤；有些具有明显的生殖毒性和发育毒性[1，3～6]。
, 百拇医药 为了进一步研究香烟烟雾的生殖毒性机理，我们采用卵母细胞体外培养和体外受精的方法，研究了这些金属元素对卵母细胞成熟和受精能力的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 培养液 培养液为DMEM(低糖)+牛血清白蛋白(boving serum albumin, BSA)(Sigma产品)；体外受精是在Toyodo Yokojama and Hoshi(TYH)液中进行；胚胎细胞培养是在Chatot Ziomek Bavister(CZB)液+谷氨酰胺(Sigma产品)中进行；操作工作液为M2培养液和M2+次黄嘌呤(用以抑制卵母细胞的自发成熟)。
1.1.2 试剂 氯化镉(CdCl2)、硝酸铅[Pb(NO3)2]、氯化镍(NiCl2)、硫酸锰(MnSO4)、氯化铬(CrCl3)、硝酸铝[Al(NO3)3]、透明质酸酶、矿物油(Sigma产品)；孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)(天津激素厂)；人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)(南大制药厂)。
, 百拇医药
1.1.3 实验动物 21日龄的ICR小鼠(南京铁道医学院动物中心，合格证号为苏动质字第97002号)
1.2 方法
1.2.1 小鼠体内实验和体外受精实验 设立空白对照组(CR组，腹腔注射生理盐水)和CdCl2、Pb(NO3)2、NiCl2、MnSO4、CrCl3、Al(NO3)3腹腔注射组，每组12只小鼠，连续腹腔注射3d，各组小鼠在末次腹腔注射金属盐溶液前2d腹腔注射5IU的PMSG促使卵泡发育，2d后腹腔注射5IU的hCG进行超排卵，hCG作用14～17h后，按沈维干等的方法获取卵母细胞[7]，每组中取6只小鼠，用吸卵管将带有大量颗粒细胞的卵母细胞移入含透明质酸酶(150IU/ml)的培养液中，室温放置20min，待颗粒细胞从卵母细胞上脱落下来，用吸卵管反复吹打后将卵母细胞移入覆盖有矿物油的50μl DMEM+BSA培养液微滴中，立即在倒置显微镜下观察并记录各组卵母细胞的发育情况，以生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)作为减数分裂启动的标志，第一极体释放作为第一次减数分裂完成的标志。接着继续培养，按不同培养时间观察并记录实验结果。用吸卵管将每组另6只小鼠的卵母细胞(含有大量颗粒细胞)移入100μl的TYH液中进行体外受精(in vitro fertilization, IVF),IVF按李朝军等的方法进行[8]，受精6h，再移入100μl的CZB+谷氨酰胺的培养液中继续培养，24h后观察IVF结果，受精率以2-细胞胚胎数(或2-细胞以上胚胎数)占成熟卵母细胞(排出第一极体)的比例表示。
, 百拇医药
1.2.2 小鼠卵母细胞的获取和培养 21d的雌小鼠经5IU的PMSG促进卵泡发育48h后，用颈椎脱位法处死，取出卵巢于M2+次黄嘌呤的操作液中，按沈维干等的方法获取有卵丘细胞的卵母细胞(cumulus-oocyte complexes,COC)和无卵丘细胞的卵母细胞(denuded oocytes,DO)[8],再移入M2中充分洗去次黄嘌呤后进一步筛选出生发泡完整的卵母细胞(COC和DO)，置于覆盖有矿物油的分别含有CdCl2、Pb(NO3)2、NiCl2、MnSO4、CrCl3、Al(NO3)3的50μl DMEM+BSA的培养液微滴中，培养8h时观察各组的卵母细胞的GVBD情况，24h时观察卵母细胞的第一极体释放率和存活率。
卵母细胞培养及体外受精是在37℃、湿度饱和的5% CO2培养箱中进行。
, 百拇医药
1.2.3 统计方法 利用SPSS 8.0统计软件，采用t检验进行统计学处理。
2 实验结果
2.1 金属元素对体内卵母细胞成熟和体外培养的影响
由表1、表2可见，各实验组均可以极显著地抑制体内和体外培养卵母细胞第一极体的释放率和细胞存活率，但是对GVBD没有影响，除了铝外，其他5种金属元素可以降低小鼠平均超排卵母细胞数(CdCl2组t=4.497，v=10,P<0.01；Pb(NO3)2组t=3.595，v=10,P<0.01；NiCl2组t=2.783，v=10,P<0.05；MnSO4组t=7.236，v=10，P<0.01，CrCl3组t=4.692，v=10,P<0.01)。
, http://www.100md.com 表1 金属元素对小鼠卵母细胞成熟的影响 (
±s)(1)% 组别第一极体释放率
卵母细胞存活率
0h
24h
48h
0h
24h
48h
对照组
63.53±2.75
, http://www.100md.com
73.18±2.67
74.37±3.15
98.31±2.42
84.19±3.75
65.36±4.84
CdCl2
28.41±7.78
42.04±7.71
56.30±6.89
79.54±5.75
55.68±6.47
, 百拇医药
51.14±6.65
Pb(NO3)2
44.05±4.42
48.02±4.73
54.13±4.11
80.04±5.37
66.40±5.79
55.65±6.20a
NiCl2
40.43±6.62
50.02±6.78
, http://www.100md.com
53.19±7.03
83.99±4.50
69.55±5.59
58.47±5.42a
MnSO4
35.71±5.65
36.73±6.68
38.78±7.07
71.43±4.67
56.12±4.98
45.92±5.24
, 百拇医药
CrCl3
45.05±3.68
61.32±3.97
62.07±4.51
75.82±3.44
60.44±4.28
53.85±5.06
Al(NO3)3
45.56±3.69
52.31±4.48
55.71±4.17
, 百拇医药
78.57±3.39
67.72±4.53
58.65±4.99a
注：(1) 与对照组相比，除标a组P<0.05外，其余各组P<0.01表2 金属元素对小鼠平均超排卵数和卵母细胞GVBD的影响 组别
剂量
(mg/kgBW)
平均超排卵数
(
±s)t
, 百拇医药 P
GVBD率
(%)
对照组
0
43.48±3.28
—
—
100
CdCl2
0.02
37.66±4.31
4.497
, 百拇医药
<0.01
100
Pb(NO3)2
0.04
35.37±3.37
3.595
<0.01
100
NiCl2
0.08
39.54±3.08
2.783
, 百拇医药
<0.05
100
MnSO4
0.03
39.40±2.19
7.236
<0.01
100
CrCl3
0.01
36.25±4.37
4.692
, 百拇医药
<0.01
100
Al(NO3)3
0.15
42.43±2.13
100
2.2 金属元素对卵母细胞IVF的影响
由表3可见，各实验组24h时的总受精率都显著低于对照组(P<0.01)，随着体外培养的进行，实验组的总受精率都有明显提高；除了48h和72h时铝组的总受精率与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，镉、铅、镍、锰、铬组与对照组相比，48h和72h时的总受精率差异均有极显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 金属元素对体外培养小鼠卵母细胞成熟的影响
由表4可见，培养8h时Al组对体外培养卵母细胞GVBD无影响，其它各组的GVBD率与对照组相比下降有显著性，培养24h时各组的第一极体释放率和体外存活率与对照组相比下降均有显著性(P<0.01)。
3 讨论
国内外有关镉、铅、镍、锰、铬、铝对生殖作用的影响的研究表明，镉对哺乳动物有较强的致畸、致癌和致突变作用，被机体吸收后，自然排泄十分缓慢，其生物半衰期达9～30年[1]；镉可以降低IVF后的胚胎移植的成活率，还能导致超排卵的数目减少[3]。镉可以在妇女的血液和滤泡液中聚集，可以对颗粒细胞造成伤害，导致妇女有关生殖的类固醇激素的水平的破坏，造成生殖紊乱；镉可以阻止体外培养卵母细胞进入减数分裂的MII[9]。铅可以抑制着床过程，饮用含铅的水可以使大鼠和小鼠的妊娠率、着床率明显降低；铅还可以经胎盘和乳汁转移，直接对胎儿和婴儿造成危害，导致自然流产、早产、畸胎和婴幼儿行为异常增多[1，4]；镍化合物可以通过胎盘产生胚胎毒性和致畸性[1，5]；雄鼠接触NiCl2会降低雌鼠的怀孕率和胚胎数，显著降低睾丸重量和受精能力[10]；NiCl2可以使输精管萎缩，使曲细精管堵塞，导致精原细胞形成数量下降，生殖力下降；当雌鼠接触NiCl2时，哺乳期的幼子死亡率提高[11]。染锰对大鼠胚胎和子代的生长发育有明显的毒性作用[6]。在妊娠期和哺乳期接触三价铬和六价铬，雌鼠的后代在成年后的生殖功能和生殖能力明显减弱[12]；成年雌雄鼠接触铬对受精力和生殖力都有不利影响，可以引起雄鼠的生殖力显著下降，雌鼠的吸收胎和死胎数增加，着床数、成活胚胎数显著减少，卵巢重量显著下降[13]。铝是自然界含量最多的金属元素之一，过量的铝可以抑制卵母细胞的成熟，并具有致畸作用[1，7]。
, 百拇医药
表3 金属元素对小鼠卵母细胞IVF的影响(
±s)% 组别2-细胞胚胎率
3-细胞胚胎率
总受精率
24h
48h
72h
24h
48h
72h
24h
, http://www.100md.com
48h
72h
对照组
74.16±5.77
20.01±2.55
9.26±2.57
0
52.33±4.41
64.81±2.28
74.16±5.77
74.16±5.77
74.16±5.77
, 百拇医药
CdCl2
18.64±2.21
32.93±3.01
32.18±3.03
0
20.69±3.77
27.59±3.41
18.64±4.15(2)
53.09±5.54(2)
58.91±5.56(2)
Pb(NO3)2
, 百拇医药
29.00±4.18
21.21±3.10
15.15±4.15
0
22.73±3.13
37.88±3.98
29.00±4.18(2)
44.00±8.21(2)
44.00±8.21(2)
NiCl2
28.99±1.12
, 百拇医药
33.33±2.74
17.39±4.88
0
21.74±3.33
39.13±4.76
28.99±1.12(2)
54.23±6.13(2)
55.77±4.28(2)
MnSO4
46.67±2.85
37.18±3.03
, 百拇医药
30.77±5.18
0
14.10±3.65
24.36±3.39
46.67±2.85(2)
49.75±3.33(2)
55.33±1.58(2)
CrCl3
46.25±3.30
38.75±4.79
22.50±5.64
, 百拇医药
0
25.00±3.77
41.25±4.96
46.25±3.30(2)
63.50±6.30(2)
63.50±6.30(2)
Al(NO3)3
61.33±5.76
25.93±3.47
19.75±4.79
, 百拇医药
0
39.51±3.65
45.68±4.58
61.33±5.76(2)
65.33±5.58(1)
65.33±5.58(1)
注：与对照组相比(1)P<0.05(2)P<0.01表4 金属元素对体外培养卵母细胞的影响(
±s)% 组别剂量
(μg/L)
, http://www.100md.com
GVBD
率
第一极体
释放率
卵母细胞
存活率
对照组
0
100
70.01±2.03
85.71±3.13
CdCl2
1.6
, http://www.100md.com
94.08±3.23(2)
41.98±4.45(2)
63.16±6.99(2)
Pb(NO3)2
4.0
93.56±4.39(1)
39.39±5.41(2)
60.48±7.00(2)
NiCl2
, 百拇医药
8.0
95.25±4.18(1)
44.33±4.55(2)
70.59±5.76(2)
MnSO4
2.7
91.35±3.87(2)
33.77±6.03(2)
76.64±4.85(1)
CrCl3
, 百拇医药
1.0
91.79±4.28(2)
41.11±5.52(2)
75.57±3.50(2)
Al(NO3)3
1.5
100
60.01±3.20(2)
74.23±3.44(2)
注：与对照组相比(1)P<0.05 (2)P<0.01 上述金属元素的毒性作用的机制比较复杂，这些金属元素在较高浓度时，一方面可能对遗传物质的有损伤作用，特别是引起卵母细胞染色体的损伤，如引起二倍体卵母细胞的产生，使得卵母细胞不能正常释放第一极体；另一方面，可能会影响细胞内的微管的正常合成和组装，使纺锤体、有丝分裂器不能正常形成和移动，细胞分裂无法正常进行，第一极体不能形成，无法进入第二次减数分裂，精子和卵细胞不能正常受精，从而导致IVF率下降。
, http://www.100md.com
我国是烟草生产和销售大国，吸烟人数所占比例较大，妇女、儿童被动吸烟现象十分严重。我国又是一个发展中国家，环境质量不容乐观，各类环境污染相当严重，污染的大气、水源，甚至一些加工食品、生活器具、美容美发及各类化妆品可能含有较高浓度的上述金属元素。我们通过对香烟中含量较高的这几种金属元素对生殖作用影响的研究发现，这些金属元素在较高浓度时均可以损害小鼠卵母细胞第一次减数分裂的进行，抑制卵母细胞的成熟和受精能力，降低卵母细胞的质量和存活率，说明香烟中对生殖作用影响较大的物质可能是含量较高的上述几种金属元素或者还有一些目前尚不清楚的毒性成分，但是其作用机制还有待于进一步研究。
本实验结果提示，育龄妇女在过量接触上述6种金属元素时，可能会导致生殖功能下降，甚至不孕。
基金项目：江苏省自然科学基金(No.BK99064)
作者简介：沈维干，男，硕士，讲师
, 百拇医药
参考文献
1，王夔.生命科学中的微量元素(下卷).北京：中国计量出版社，1992，566—590
2，陆宝玉，陈宝春，赵炳成，等.三种卷烟的成分及其对健康的影响.卫生研究，1990，19(2)：18—21
3，Zenzes MT, Zhang HM, Krishnan S, et al. Cadmium accumulation in follicular fluid of women in vitro fertilization-embryo transfer is higher in smokers. Fertil Steril,1995,64(3)：599—603
4，周仁，施明霞，张银凤，等.铅对女工及其子代健康的影响.劳动医学，1988，5(3)：42—44
, 百拇医药
5，马明月，苏雅，李宏革，等.镍对雌性大鼠生殖功能影响的研究.中国公共卫生学报，1998，17(2)：104—105
6，刘佳娟，杨伯宁，柯铭华，等.锰对雌性大鼠繁殖的影响.广西预防医学，1995，1(6)：346—347
7，沈维干，季全兰，李朝军，等.铝对体外培养小鼠卵母细胞减数分裂的影响.卫生研究，1999，28(5)：267—268
8，李朝军，王斌，范必勤，等.小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究.南京大学学报(自然科学版)，1997，33(2)：265—272
9，Pisa J, Cibulka J, Ptacek M. Effect of subcutaneous application of a single cadmium dose on oocyte maturation in vitro. Physiol Bohemoslov,1990,39(2):182—190
, 百拇医药
10，Xie J, Funakoshi T, Shimada H, et al. Effects of chelating agents on testicular toxicity in mice caused by acute exposure to nickel. Toxicity,1995,103(3):147—155
11，Kakela R, Kakela A, Hyvarinen H. Effects of nickel chloride on reproduction of the rat and possible antagonistic role of selenium. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol,1999,123(1):27—37
12，Al Hamood MH, Elbetieha A, Bataineh H. Sexual maturation and fertility of male and female mice exposed prenatally and postnatally to trivalent and hexavalent chromium compounds. Reprod Fertil Dev, 1998,10(2):179—183
13，Elbetieha A, Al Hamood MH. Long-term exposure of male and female mice to trivalent and hexavalent chromium compounds effect on fertility. Toxicity,1997,116(1—3)：39—47
(1999-10-27收稿), 百拇医药