丙型肝炎病毒山东分离株核衣壳蛋白区cDNA的序列测定
作者：王笑峰 张文卿 于红 邵济钧
单位：青岛医学院微生物学教研室(青岛 266021)
关键词：肝炎病毒组，丙型；基因型；序列分析，DNA
青岛医学院学报990301 【摘要】 ①目的 通过核衣壳蛋白区(C区)基因序列分析，对丙型肝炎病毒(HCV)山东分离株进行定型。②方法 应用反转录套式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)方法,从山东省HCV抗体阳性血清中扩增出HCV C区基因的一个片段(432bp)，对其进行TA克隆及测序，并通过DNASIS软件和Genebank进行序列分析。③结果 此分离株与基因型1b的HCV分离株同源性最高，与4个已知1b型分离株的核苷酸相应序列同源性为96.528%～98.144%，其推导的氨基酸同源性为94.444%～96.032%.④结论 此分离株归为1b型。
中国图书馆分类法分类号 R373.2
, 百拇医药
ANALYSIS OF GENOMIC REGION SEQUENCE OF HEPATITIS C VIRUS CORE PROTEINS FROM SHANDONG PATIENTS
Wang Xiaofeng, Zhang Wenqing, Yu Hong, et al
Department of Microbiology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To genotype the HCV isolate obtained from Shandong province on the basis of core region sequence. Methods RT-nested-PCR method was used to amplify the core region of HCV genome from a anti- HCV-positive serum sample in Shandong province. The amplified fragment were TA cloned and sequenced. The sequence analysis was done by means of DNASIS soft ware and Genebank. Results A comparison between the nucleotide sequence of our isolate with that of all reported isolates of Genebank showed that our isolate was most similar to the strains of genotype 1b and the nucleotides homology was 96.528%-98.144%. The homology of deduced amino acid sequence was 94.444%-96.032%. Conclusion The isolate was classified as genotype 1b.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 hepatitis C virus; genotype; sequence analysis,DNA
丙型肝炎病毒(HCV)为RNA病毒，属黄病毒科。HCV感染后，约有50%以上的病人发展为持续性慢性肝炎、肝硬化，HCV和原发性肝癌的关系十分密切，还可与其他类型的肝炎病毒混合感染〔1〕。HCV基因组为单股正链线状RNA，约为9.5kbp，由9个基因区组成。不同地理区域分离株的基因组结构有较大差异，一般认为5′NCR最为保守；其次是C区、NS3区、NS5区和NS4区；E1区、E2/NS1，NS2及3′NCR变异性较大〔2,3〕。根据病毒编码区和非编码区核苷酸序列的不同，可把病毒分为不同的基因型。有报道证实，HCV感染引起的疾病进程及对抗病毒药物如干扰素的治疗反应随着基因型的不同而有差异〔4〕。因此，研究HCV的基因型，对于病原学、传染病学、疫苗的研制、抗病毒药物的治疗及流行病学等的研究均有极为重要的意义。本研究对山东省HCV地方株的C区进行了序列测定及分析，首次报道了山东省HCV分离株的基因型。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本和试剂
国产ELISA试剂盒筛选所得HCV抗体阳性血清，取自青岛医学院附属医院。UBIHCVEIA 4.0合成多肽抗原试剂盒(Akzo Nobli Germany)、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、琼脂糖凝胶、100bp ladder DNA Marker，pGEM-TVector Systems，限制性内切酶ScaⅠ均购自Promega公司;PCR产物纯化试剂盒为Qiaegen公司产品;DH5α为本研究室贮存菌株,引物见表1.
表1 RT-nested-PCR 的引物 引物名称
位置
极性
序列 (5′ to 3′)
, http://www.100md.com
HC1
248～267
+
AGTGTTGGGTCGCGAAAGGC
HC2
715～734
-
CCCCATGAGGTCGGCGAAGC
HC3
276～295
+
ACTGCCTGATAGGGTGCTTG
, 百拇医药
HC4
688～707
-
AAGGGTATCGATGACCTTAC
1.2 实验方法
1.2.1 阳性标本的确认 用UBIHCVEIA 4.0合成多肽抗原试剂盒对HCV抗体阳性血清进行确认，实验按照试剂盒说明书中的方法进行。
1.2.2 血清RNA的提取 取HCV抗体阳性血清100μL,用总RNA提取试剂盒提取血清RNA.实验按照试剂盒说明书方法进行。
1.2.3 逆转录(RT)反应 以血清RNA为模板,应用引物HC2取代Oligo(dT)15进行RT.
, 百拇医药
1.2.4 套式PCR(nested-PCR)反应 以全部RT产物(20μL)为模板进行外侧PCR反应,10×buffer 5μL,MgCl2 5mmol/L,4×dNTP 0.2mmol/L,Taq DNA聚合酶2U,引物HC1,HC2各0.5μmol,加水至50μL.扩增条件为94℃变性60s,55℃退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,最后72℃延伸7min.然后以外侧PCR产物4μL为模板进行内侧PCR反应,10×buffer 10μL,MgCl2 5mmol/L,4×dNTP 0.2mmol/L,Taq DNA聚合酶4U,引物HC3,HC4各0.5μmol/L，加水至100μL,扩增条件同外侧PCR.取内侧PCR产物10μL经15g/L的琼脂糖凝胶(含EB 0.5mg/L)电泳,以100bp Ladder DNA Marker作为参照,于紫外透射仪下观察电泳结果。
1.2.5 TA克隆 取内侧PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后连接T载体(pGEM-TVector),并转入大肠杆菌DH5α进行克隆。
, 百拇医药
1.2.6 核酸序列测定及分析 阳性克隆产物经酶切和PCR方法鉴定无误后,纯化并在DNA自动测序仪上进行序列测定。测得序列的比较用DNASIS软件自动完成。同源性分析在Internet上通过与Genebank的所有HCV毒株的序列比较完成。
2 结果
2.1 RT-nested-PCR反应的结果
内侧PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶(含EB 0.5mg/L)电泳后,与100bp Ladder DNA Marker相比，可见432bp的阳性扩增条带。
2.2 核酸和氨基酸序列分析
HCV山东分离株C区核苷酸序列与4个已知基因型1b分离株HCU 63376，HPC 5TRJ4，HPCCGENOM,HPC1B1的相应序列的同源性分别为98.144%,96.528%,96.752%,96.752%;由其推导的氨基酸的同源性则分别为96.032%,95.238%,96.032%,94.444%.
, 百拇医药
3 讨论
与其他单链RNA病毒一样，HCV的基因容易发生变异，其变异可能是病毒在体内持续存在的原因之一。变异的原因主要有两个:①HCV是一种RNA病毒，在复制期间，RNA聚合酶缺少“校读”功能。据估计RNA聚合酶的误配率为10-4.②宿主免疫压力选择作用的影响。另外，准种系特性的存在，可使准种系成员之间发生RNA重组〔5〕。
本文对山东省HCV分离株C区432bp的核苷酸序列进行了测定,与Genebank里所有的HCV分离株的序列进行了比较，结果表明，山东省分离株与基因型1b的HCV分离株同源性最高，与多个1b型分离株的相应序列核苷酸同源性在95%以上。氨基酸序列分析发现，山东省HCV分离株与上述4个已知HCV 1b分离株相应区段氨基酸的同源性皆为95%左右。由此可见，此分离株属HCV 1b基因型。HCV分子流行病学研究表明，HCV的核酸存在广泛的异质性，其基因组具有地域分布特征，不同国家不同地区的HCV分离株核酸序列有所差异，各地的主要流行株也不尽相同。我国由于地域辽阔，不同地区HCV基因型的分布亦有较大差异。目前已完整克隆的河北株、北京株、台湾株，部分克隆的上海株，相互间的核酸序列亦有较大差异。在我国大陆地区主要HCV流行株的基因型为1b和2a.本研究得到的山东省HCV分离株为1b型，证明1b型为我省HCV普遍流行的基因型，这与我国HCV基因型的流行情况是一致的。
, 百拇医药
本文为山东省科委基金资助课题(批准号：961226722)
参考文献
1 Nizar NZ, David HP. Hepatitis C virus genotypes: current trends and future implications. Mayo Clin Proc,1996,71:458
2 Takeshi, Kyoko, Kenjiro I, et al. Significance of specific antibody assay for genotyping of hepatitis C virus. Hepatology,1994,19(6):1347
3 Hisaya I, Chatchawann, Ken-Ichi ,et al. Hepatitis C virus (HCV) subtype prevalence in Chiang Mai, Thailand, and identification of novel subtypes of HCV major type 6. J Clin Microbiol,1996,34(3)569
, 百拇医药
4 Oni A, Harrison. Genotypes of hepatitis C nigeria. J Med Virol,1996,49:178
5 Martell M, Esteban JI, Quer J, et al. Hepatitis C virus(HCV) circulates as a population of different but closely related genomes: quasispecies nature of HCV genome distribution. J Virol,1992,66:3225
(1999-04-28收稿 1999-06-30修回), http://www.100md.com
单位：青岛医学院微生物学教研室(青岛 266021)
关键词：肝炎病毒组，丙型；基因型；序列分析，DNA
青岛医学院学报990301 【摘要】 ①目的 通过核衣壳蛋白区(C区)基因序列分析，对丙型肝炎病毒(HCV)山东分离株进行定型。②方法 应用反转录套式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)方法,从山东省HCV抗体阳性血清中扩增出HCV C区基因的一个片段(432bp)，对其进行TA克隆及测序，并通过DNASIS软件和Genebank进行序列分析。③结果 此分离株与基因型1b的HCV分离株同源性最高，与4个已知1b型分离株的核苷酸相应序列同源性为96.528%～98.144%，其推导的氨基酸同源性为94.444%～96.032%.④结论 此分离株归为1b型。
中国图书馆分类法分类号 R373.2
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ANALYSIS OF GENOMIC REGION SEQUENCE OF HEPATITIS C VIRUS CORE PROTEINS FROM SHANDONG PATIENTS
Wang Xiaofeng, Zhang Wenqing, Yu Hong, et al
Department of Microbiology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To genotype the HCV isolate obtained from Shandong province on the basis of core region sequence. Methods RT-nested-PCR method was used to amplify the core region of HCV genome from a anti- HCV-positive serum sample in Shandong province. The amplified fragment were TA cloned and sequenced. The sequence analysis was done by means of DNASIS soft ware and Genebank. Results A comparison between the nucleotide sequence of our isolate with that of all reported isolates of Genebank showed that our isolate was most similar to the strains of genotype 1b and the nucleotides homology was 96.528%-98.144%. The homology of deduced amino acid sequence was 94.444%-96.032%. Conclusion The isolate was classified as genotype 1b.
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【KEY WORDS】 hepatitis C virus; genotype; sequence analysis,DNA
丙型肝炎病毒(HCV)为RNA病毒，属黄病毒科。HCV感染后，约有50%以上的病人发展为持续性慢性肝炎、肝硬化，HCV和原发性肝癌的关系十分密切，还可与其他类型的肝炎病毒混合感染〔1〕。HCV基因组为单股正链线状RNA，约为9.5kbp，由9个基因区组成。不同地理区域分离株的基因组结构有较大差异，一般认为5′NCR最为保守；其次是C区、NS3区、NS5区和NS4区；E1区、E2/NS1，NS2及3′NCR变异性较大〔2,3〕。根据病毒编码区和非编码区核苷酸序列的不同，可把病毒分为不同的基因型。有报道证实，HCV感染引起的疾病进程及对抗病毒药物如干扰素的治疗反应随着基因型的不同而有差异〔4〕。因此，研究HCV的基因型，对于病原学、传染病学、疫苗的研制、抗病毒药物的治疗及流行病学等的研究均有极为重要的意义。本研究对山东省HCV地方株的C区进行了序列测定及分析，首次报道了山东省HCV分离株的基因型。
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1 材料与方法
1.1 标本和试剂
国产ELISA试剂盒筛选所得HCV抗体阳性血清，取自青岛医学院附属医院。UBIHCVEIA 4.0合成多肽抗原试剂盒(Akzo Nobli Germany)、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、琼脂糖凝胶、100bp ladder DNA Marker，pGEM-TVector Systems，限制性内切酶ScaⅠ均购自Promega公司;PCR产物纯化试剂盒为Qiaegen公司产品;DH5α为本研究室贮存菌株,引物见表1.
表1 RT-nested-PCR 的引物 引物名称
位置
极性
序列 (5′ to 3′)
, http://www.100md.com
HC1
248～267
+
AGTGTTGGGTCGCGAAAGGC
HC2
715～734
-
CCCCATGAGGTCGGCGAAGC
HC3
276～295
+
ACTGCCTGATAGGGTGCTTG
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HC4
688～707
-
AAGGGTATCGATGACCTTAC
1.2 实验方法
1.2.1 阳性标本的确认 用UBIHCVEIA 4.0合成多肽抗原试剂盒对HCV抗体阳性血清进行确认，实验按照试剂盒说明书中的方法进行。
1.2.2 血清RNA的提取 取HCV抗体阳性血清100μL,用总RNA提取试剂盒提取血清RNA.实验按照试剂盒说明书方法进行。
1.2.3 逆转录(RT)反应 以血清RNA为模板,应用引物HC2取代Oligo(dT)15进行RT.
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1.2.4 套式PCR(nested-PCR)反应 以全部RT产物(20μL)为模板进行外侧PCR反应,10×buffer 5μL,MgCl2 5mmol/L,4×dNTP 0.2mmol/L,Taq DNA聚合酶2U,引物HC1,HC2各0.5μmol,加水至50μL.扩增条件为94℃变性60s,55℃退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,最后72℃延伸7min.然后以外侧PCR产物4μL为模板进行内侧PCR反应,10×buffer 10μL,MgCl2 5mmol/L,4×dNTP 0.2mmol/L,Taq DNA聚合酶4U,引物HC3,HC4各0.5μmol/L，加水至100μL,扩增条件同外侧PCR.取内侧PCR产物10μL经15g/L的琼脂糖凝胶(含EB 0.5mg/L)电泳,以100bp Ladder DNA Marker作为参照,于紫外透射仪下观察电泳结果。
1.2.5 TA克隆 取内侧PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后连接T载体(pGEM-TVector),并转入大肠杆菌DH5α进行克隆。
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1.2.6 核酸序列测定及分析 阳性克隆产物经酶切和PCR方法鉴定无误后,纯化并在DNA自动测序仪上进行序列测定。测得序列的比较用DNASIS软件自动完成。同源性分析在Internet上通过与Genebank的所有HCV毒株的序列比较完成。
2 结果
2.1 RT-nested-PCR反应的结果
内侧PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶(含EB 0.5mg/L)电泳后,与100bp Ladder DNA Marker相比，可见432bp的阳性扩增条带。
2.2 核酸和氨基酸序列分析
HCV山东分离株C区核苷酸序列与4个已知基因型1b分离株HCU 63376，HPC 5TRJ4，HPCCGENOM,HPC1B1的相应序列的同源性分别为98.144%,96.528%,96.752%,96.752%;由其推导的氨基酸的同源性则分别为96.032%,95.238%,96.032%,94.444%.
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3 讨论
与其他单链RNA病毒一样，HCV的基因容易发生变异，其变异可能是病毒在体内持续存在的原因之一。变异的原因主要有两个:①HCV是一种RNA病毒，在复制期间，RNA聚合酶缺少“校读”功能。据估计RNA聚合酶的误配率为10-4.②宿主免疫压力选择作用的影响。另外，准种系特性的存在，可使准种系成员之间发生RNA重组〔5〕。
本文对山东省HCV分离株C区432bp的核苷酸序列进行了测定,与Genebank里所有的HCV分离株的序列进行了比较，结果表明，山东省分离株与基因型1b的HCV分离株同源性最高，与多个1b型分离株的相应序列核苷酸同源性在95%以上。氨基酸序列分析发现，山东省HCV分离株与上述4个已知HCV 1b分离株相应区段氨基酸的同源性皆为95%左右。由此可见，此分离株属HCV 1b基因型。HCV分子流行病学研究表明，HCV的核酸存在广泛的异质性，其基因组具有地域分布特征，不同国家不同地区的HCV分离株核酸序列有所差异，各地的主要流行株也不尽相同。我国由于地域辽阔，不同地区HCV基因型的分布亦有较大差异。目前已完整克隆的河北株、北京株、台湾株，部分克隆的上海株，相互间的核酸序列亦有较大差异。在我国大陆地区主要HCV流行株的基因型为1b和2a.本研究得到的山东省HCV分离株为1b型，证明1b型为我省HCV普遍流行的基因型，这与我国HCV基因型的流行情况是一致的。
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本文为山东省科委基金资助课题(批准号：961226722)
参考文献
1 Nizar NZ, David HP. Hepatitis C virus genotypes: current trends and future implications. Mayo Clin Proc,1996,71:458
2 Takeshi, Kyoko, Kenjiro I, et al. Significance of specific antibody assay for genotyping of hepatitis C virus. Hepatology,1994,19(6):1347
3 Hisaya I, Chatchawann, Ken-Ichi ,et al. Hepatitis C virus (HCV) subtype prevalence in Chiang Mai, Thailand, and identification of novel subtypes of HCV major type 6. J Clin Microbiol,1996,34(3)569
, 百拇医药
4 Oni A, Harrison. Genotypes of hepatitis C nigeria. J Med Virol,1996,49:178
5 Martell M, Esteban JI, Quer J, et al. Hepatitis C virus(HCV) circulates as a population of different but closely related genomes: quasispecies nature of HCV genome distribution. J Virol,1992,66:3225
(1999-04-28收稿 1999-06-30修回), http://www.100md.com