长春花内生真菌的分离及其发酵产生药用成分的初步研究△
作者：张玲琪 郭波 李海燕 曾松荣 邵华 谷苏 魏蓉城
单位：张玲琪 郭波 李海燕 曾松荣(云南大学生物系 昆明 650091)；邵华 谷苏 魏蓉城(云南省微生物研究所)
关键词：长春花；内生真菌；尖孢镰刀菌；长春新碱
中草药001103摘 要 首次报道从长春花Catharanthus roseus (L.) G. Don 茎的韧皮部中分离出尖孢镰刀菌Fusarium oxysporu m， 为该植物的一种内生真菌，并用TLC和HPLC对该菌的97CG3菌株培养物进行了分析，初步结 果表明该真菌能产生抗癌药长春新碱成分。 Preliminary Study on the Isolation of Endophytic Fungus of Catharanthus roseus and
Its Fermentation to Produce Products of Therapeutic Value
, http://www.100md.com
Zhang Lingqi Guo Bo Li Haiyan and Zeng Songrong
(Department of Biology, Yunnan University Kunming 650091)
Shao Hua, Gu Su and Wei Rongcheng
(Yunnan Institute of Microbiology)
Abstract An endophytic fungus, Fusarium oxysparum,[ WTBZ (97CG3) was isolated from the phloem (inner bark) of Catharanthus roseus (L. ) G. Don for the first time. Metabolic products of cultured 97CG3 hav e been analysed by TLC and HPLC. It was shown that the fungus can produce vincr istine which has an anticancer activity.
, 百拇医药
Key words Catharanthus roseus (L. ) G. Don endophytic fungus Fusarium oxysporum vincristine
长春花Catharanthus roseus (L.) Don 为夹竹桃科长春花属多年生草本 植物，全草 均可药用，有较高药用价值[1]。五十年代末，发现长春碱和长春新碱具有抗肿瘤 活性，尤其对白血病具显著疗效。此后，从长春花不同部位分离出100 多种生物碱，但这些 生物碱在植物体内含量低，且植物生长缓慢，资源短缺，限制了抗癌药物的进一步开发。人 们又转而进行植物组培研究[2，3]，但植物组培成本高，生产难度大，有效成分含 量低，也未能成功应用于生产[4]。由于植物真菌对植物某些药效成分的形成有重 要影响，甚至会产生和其寄主相同或相似的生理活性成分[5，6]，而且真菌易于培 养，可以通过育种手段和控制培养条件等措施来大幅度提高其有效成分的含量，并便于组织 工业化生产。故利用微生物生产抗癌成分前景十分广阔。本研究不仅对长春花内生真菌的分 离和研究、更拟通过真菌和寄主的特定抗癌成分的对比为以后筛选真菌来生产药物奠定基础 。目前，从长春花内生真菌产生长春碱的研究除我们初报过交链孢属(Altemaria) 真菌的工作外[7]，在国内外尚未见报道。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料：新鲜长春花(2～3 年)来源于云南大理弥渡县、巍山县和西双版纳州。硫酸长 春新碱(vincristine sulfate)对照品购自上海华联制药公司和Sigma公司。
1.2 培养基[8]：马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、查氏培养基、改良的MM培养基。
1.3 内生真菌的分离：按常规无菌操作。取长春花不同部位的叶和茎干，按下列程序表面 消毒：自来水冲洗→75%酒精漂洗(3～5 min)→无菌水冲洗3～4 次→0.1%升汞漂洗(10～ 30 s)→无菌水冲洗5 次。
将上述处理过的叶片和茎在超净台条件下切割成约0.5 cm×0.5 cm的小片(茎取韧皮部)， 然后将小片种植于PDA平板上，置28 ℃温箱培养3～7 d后，即可见样品切割过的边缘有菌丝 长出，经纯化后转接到PDA斜面上备用。
, 百拇医药
为了检查表面消毒是否彻底，做了对照实验。将上述同样条件处理过的茎段不作切割直接种 植于PDA平皿上，置于相同的条件下培养，结果对照用的茎段周围无任何菌长出，多次重复 均如此，证明所分到的菌是韧皮部内的，而不是表面的附生菌。
1.4 内生真菌的液体培养：液体培养基为基本培养基(MM)，将1 000 mL培养液分装在 250 mL的三角瓶中。用接种钩挑取少许菌丝接种于培养瓶中，置于27 ℃摇床(100 r/min) 培养3～4 d，待菌丝体长好后进行提取。
1.5 提取方法：发酵液1 000 mL→碱化(pH>8)→离心(2 500 r/min，15 min)→沉淀 →加CHCl3→浓缩→置青霉素小瓶中备用。
1.6 检测方法
1.6.1 TCL检测硅胶板：自制硅胶板和购自青岛海洋化工厂的硅胶板。展开剂：苯-丙酮 =8∶2；显色采用碘显色。
, 百拇医药
1.6.2 液相色谱分析：仪器：BECKMAN 421A控制器，110B溶剂导入组件；163可变波长检 测器，427积分仪。
条件：检测波长λ=238 nm，吸光度0.5；泵A(重蒸水)1～1.5×69 Pa；泵B(甲醇)1～1.5 ×69 Pa。
流速：0.5 mL/min；泵A 30%、泵B 70%。
2 结果与讨论
2.1 长春花内生真菌97CG3的形态特征及生长特性：从云南不同地点生长的长春花的茎 和叶中分离出20 多个真菌菌株，其中有一菌株97CG3的培养物中含有长春新碱成分，该菌 株经鉴定为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum Schlecht (图1)，97CG3在 查氏固体平板培养基上菌丝体纤细，白色，通常带有紫色，该菌可产生2 种类型的分生孢子 ，大型分生孢子呈纺锤形至镰刀型，多胞无色，小型分生孢子单胞无色呈卵形至椭圆形， 并发现有厚垣孢子呈间生和
, 百拇医药
图1 97CG3显微镜下分生孢子形态(992X)
顶生[9]。在25 ℃，28 ℃，32 ℃ 3 个不同的温度炉条件 下，接种量都一致(均为0.7%)，97CFG3菌株在28 ℃时，最终吸光度值高，生长最好。
图2 97CG3产物的TLC检测[ ST
2.2 长春花内生真菌97CG3培养物中长春新碱的测定：通过不同的展开剂进行薄层层析 都发现与对照品硫酸长春新碱相同的斑点(图2)。但不够理想。为此我们又进一步经HPLC检 测，发现内生真菌97CG3样品在现有设定条件下的保留时间Rt值在2. 59 min时色谱峰与对照品硫酸长春新碱在2.60 min时的波峰相同(图3)。
, 百拇医药
图3 97CG3产物的HPLC检测
2.3 微生物产生与植物一致的次生代谢产物的可能性分析：生物在次生代谢过程中其生化 途径的连续演化会导致有益物质进入到共生体中，其基本的生化过程信息有时还会传递到其 它生物中去，在生物早期的系统发育过程中，一些具有完全互补的遗传特性或参与代谢过程 的其它生物体(如细菌或蓝藻)，被认为可以组合进真核细胞并发育成线粒体和叶绿体[ 10]。
生物之间的相互作用和“协同进化”。“内共生理论”认为，在共生体内，一旦次生代谢中 出现有用生化途径，它就能被其它生物所利用，表现出相互作用和“协同进化”(co-evolu tion)。很多真菌激素，包括有性生殖过程中的一些激素，其化学结构与哺乳动物中的某些 细胞调节机制即是从微生物进化而来[11，12]。因此，用微生物生产与植物相同或类似的次生代谢产物是可行的。
, http://www.100md.com
从测定结果看出，97CG3的液体培养基中含有长春新碱成分，但合成的该物质含量低。今 后，我们将着手纯化该菌株产生的长春新碱成分，以便利用质谱和免疫学方法作进一步鉴定 ，同时也将积极开展菌株的选育工作。
致谢：生物系97届学生葛再伟、王浩，微生物研究所张云峰和省工业微生物发酵 工程重点实验室刘勇和罗氘芸老师等先后参加过部分工作，特在此表示谢忱。
ddress： Zhang Lingqi, Biology Department of Yunnan University, Kunming
国家自然科学基金资助项目(No 39860005)；云南省应用基础研究基金资助项目(No 96C009M)
张玲琪 女，57岁，1964年毕业于云南大学。现任生物系教授，硕士生导师。长期从事基础 微生物学及应用微生物学的教学和科研工作，先后主持和参与国家和省自然科学基金以及有 关部门委托的纵横向课题10余项，在内生真菌、菌根菌以及环保和食品微生物等方面均完成 了较多的工作，获得过部、省级科技进步奖，已发表有关论文40 余篇，并合著出版著作2 本。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，中国科学院 植物研究所编.中国高等植物图鉴.北京：科学出版社，1985：430
2，Barry V C. Secondary Products from Plant Tissue Culture. Oxf oed， 1990:224
3，Schie O, Berlin J. Plant Cell Tissue Organ Cult, 1 987,8(2):153
4，郑珍贵，刘 涤，胡之壁，等.国外医药-植物药分册，1996，11(5) ：204
5，江东福，马 萍，张玲琪，等.云南植物研究，1995，17(1)：79
6，Stierle A, Strobel G, Stierle D. Science, 1993,260(4):214
, http://www.100md.com
7，郭 波，李海燕，张玲琪.云南大学学报(自然科学版)，1998，20(3) ：214
8，范秀蓉，李广武，沈 萍编.微生物学实验.北京：高等教育出版社， 1989：260
9，C. 布斯著.陈其泽译.镰刀菌属.北京：农业出版社，1998：152
10，翟中和主编.细胞生物学.北京：高等教育出版社，1995：379
11，王伯荪，李鸣光，彭少麟著.植物种群学.广州：广东高等教育出版社，1995 ：294
12，Roth J, Leroith V. Annals of the New York Academy of Science， 1986, 436:1
(1999-12-18收稿), 百拇医药
单位：张玲琪 郭波 李海燕 曾松荣(云南大学生物系 昆明 650091)；邵华 谷苏 魏蓉城(云南省微生物研究所)
关键词：长春花；内生真菌；尖孢镰刀菌；长春新碱
中草药001103摘 要 首次报道从长春花Catharanthus roseus (L.) G. Don 茎的韧皮部中分离出尖孢镰刀菌Fusarium oxysporu m， 为该植物的一种内生真菌，并用TLC和HPLC对该菌的97CG3菌株培养物进行了分析，初步结 果表明该真菌能产生抗癌药长春新碱成分。 Preliminary Study on the Isolation of Endophytic Fungus of Catharanthus roseus and
Its Fermentation to Produce Products of Therapeutic Value
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Zhang Lingqi Guo Bo Li Haiyan and Zeng Songrong
(Department of Biology, Yunnan University Kunming 650091)
Shao Hua, Gu Su and Wei Rongcheng
(Yunnan Institute of Microbiology)
Abstract An endophytic fungus, Fusarium oxysparum,[ WTBZ (97CG3) was isolated from the phloem (inner bark) of Catharanthus roseus (L. ) G. Don for the first time. Metabolic products of cultured 97CG3 hav e been analysed by TLC and HPLC. It was shown that the fungus can produce vincr istine which has an anticancer activity.
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Key words Catharanthus roseus (L. ) G. Don endophytic fungus Fusarium oxysporum vincristine
长春花Catharanthus roseus (L.) Don 为夹竹桃科长春花属多年生草本 植物，全草 均可药用，有较高药用价值[1]。五十年代末，发现长春碱和长春新碱具有抗肿瘤 活性，尤其对白血病具显著疗效。此后，从长春花不同部位分离出100 多种生物碱，但这些 生物碱在植物体内含量低，且植物生长缓慢，资源短缺，限制了抗癌药物的进一步开发。人 们又转而进行植物组培研究[2，3]，但植物组培成本高，生产难度大，有效成分含 量低，也未能成功应用于生产[4]。由于植物真菌对植物某些药效成分的形成有重 要影响，甚至会产生和其寄主相同或相似的生理活性成分[5，6]，而且真菌易于培 养，可以通过育种手段和控制培养条件等措施来大幅度提高其有效成分的含量，并便于组织 工业化生产。故利用微生物生产抗癌成分前景十分广阔。本研究不仅对长春花内生真菌的分 离和研究、更拟通过真菌和寄主的特定抗癌成分的对比为以后筛选真菌来生产药物奠定基础 。目前，从长春花内生真菌产生长春碱的研究除我们初报过交链孢属(Altemaria) 真菌的工作外[7]，在国内外尚未见报道。
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1 材料和方法
1.1 材料：新鲜长春花(2～3 年)来源于云南大理弥渡县、巍山县和西双版纳州。硫酸长 春新碱(vincristine sulfate)对照品购自上海华联制药公司和Sigma公司。
1.2 培养基[8]：马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、查氏培养基、改良的MM培养基。
1.3 内生真菌的分离：按常规无菌操作。取长春花不同部位的叶和茎干，按下列程序表面 消毒：自来水冲洗→75%酒精漂洗(3～5 min)→无菌水冲洗3～4 次→0.1%升汞漂洗(10～ 30 s)→无菌水冲洗5 次。
将上述处理过的叶片和茎在超净台条件下切割成约0.5 cm×0.5 cm的小片(茎取韧皮部)， 然后将小片种植于PDA平板上，置28 ℃温箱培养3～7 d后，即可见样品切割过的边缘有菌丝 长出，经纯化后转接到PDA斜面上备用。
, 百拇医药
为了检查表面消毒是否彻底，做了对照实验。将上述同样条件处理过的茎段不作切割直接种 植于PDA平皿上，置于相同的条件下培养，结果对照用的茎段周围无任何菌长出，多次重复 均如此，证明所分到的菌是韧皮部内的，而不是表面的附生菌。
1.4 内生真菌的液体培养：液体培养基为基本培养基(MM)，将1 000 mL培养液分装在 250 mL的三角瓶中。用接种钩挑取少许菌丝接种于培养瓶中，置于27 ℃摇床(100 r/min) 培养3～4 d，待菌丝体长好后进行提取。
1.5 提取方法：发酵液1 000 mL→碱化(pH>8)→离心(2 500 r/min，15 min)→沉淀 →加CHCl3→浓缩→置青霉素小瓶中备用。
1.6 检测方法
1.6.1 TCL检测硅胶板：自制硅胶板和购自青岛海洋化工厂的硅胶板。展开剂：苯-丙酮 =8∶2；显色采用碘显色。
, 百拇医药
1.6.2 液相色谱分析：仪器：BECKMAN 421A控制器，110B溶剂导入组件；163可变波长检 测器，427积分仪。
条件：检测波长λ=238 nm，吸光度0.5；泵A(重蒸水)1～1.5×69 Pa；泵B(甲醇)1～1.5 ×69 Pa。
流速：0.5 mL/min；泵A 30%、泵B 70%。
2 结果与讨论
2.1 长春花内生真菌97CG3的形态特征及生长特性：从云南不同地点生长的长春花的茎 和叶中分离出20 多个真菌菌株，其中有一菌株97CG3的培养物中含有长春新碱成分，该菌 株经鉴定为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum Schlecht (图1)，97CG3在 查氏固体平板培养基上菌丝体纤细，白色，通常带有紫色，该菌可产生2 种类型的分生孢子 ，大型分生孢子呈纺锤形至镰刀型，多胞无色，小型分生孢子单胞无色呈卵形至椭圆形， 并发现有厚垣孢子呈间生和
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图1 97CG3显微镜下分生孢子形态(992X)
顶生[9]。在25 ℃，28 ℃，32 ℃ 3 个不同的温度炉条件 下，接种量都一致(均为0.7%)，97CFG3菌株在28 ℃时，最终吸光度值高，生长最好。
图2 97CG3产物的TLC检测[ ST
2.2 长春花内生真菌97CG3培养物中长春新碱的测定：通过不同的展开剂进行薄层层析 都发现与对照品硫酸长春新碱相同的斑点(图2)。但不够理想。为此我们又进一步经HPLC检 测，发现内生真菌97CG3样品在现有设定条件下的保留时间Rt值在2. 59 min时色谱峰与对照品硫酸长春新碱在2.60 min时的波峰相同(图3)。
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图3 97CG3产物的HPLC检测
2.3 微生物产生与植物一致的次生代谢产物的可能性分析：生物在次生代谢过程中其生化 途径的连续演化会导致有益物质进入到共生体中，其基本的生化过程信息有时还会传递到其 它生物中去，在生物早期的系统发育过程中，一些具有完全互补的遗传特性或参与代谢过程 的其它生物体(如细菌或蓝藻)，被认为可以组合进真核细胞并发育成线粒体和叶绿体[ 10]。
生物之间的相互作用和“协同进化”。“内共生理论”认为，在共生体内，一旦次生代谢中 出现有用生化途径，它就能被其它生物所利用，表现出相互作用和“协同进化”(co-evolu tion)。很多真菌激素，包括有性生殖过程中的一些激素，其化学结构与哺乳动物中的某些 细胞调节机制即是从微生物进化而来[11，12]。因此，用微生物生产与植物相同或类似的次生代谢产物是可行的。
, http://www.100md.com
从测定结果看出，97CG3的液体培养基中含有长春新碱成分，但合成的该物质含量低。今 后，我们将着手纯化该菌株产生的长春新碱成分，以便利用质谱和免疫学方法作进一步鉴定 ，同时也将积极开展菌株的选育工作。
致谢：生物系97届学生葛再伟、王浩，微生物研究所张云峰和省工业微生物发酵 工程重点实验室刘勇和罗氘芸老师等先后参加过部分工作，特在此表示谢忱。
ddress： Zhang Lingqi, Biology Department of Yunnan University, Kunming
国家自然科学基金资助项目(No 39860005)；云南省应用基础研究基金资助项目(No 96C009M)
张玲琪 女，57岁，1964年毕业于云南大学。现任生物系教授，硕士生导师。长期从事基础 微生物学及应用微生物学的教学和科研工作，先后主持和参与国家和省自然科学基金以及有 关部门委托的纵横向课题10余项，在内生真菌、菌根菌以及环保和食品微生物等方面均完成 了较多的工作，获得过部、省级科技进步奖，已发表有关论文40 余篇，并合著出版著作2 本。
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参 考 文 献
1，中国科学院 植物研究所编.中国高等植物图鉴.北京：科学出版社，1985：430
2，Barry V C. Secondary Products from Plant Tissue Culture. Oxf oed， 1990:224
3，Schie O, Berlin J. Plant Cell Tissue Organ Cult, 1 987,8(2):153
4，郑珍贵，刘 涤，胡之壁，等.国外医药-植物药分册，1996，11(5) ：204
5，江东福，马 萍，张玲琪，等.云南植物研究，1995，17(1)：79
6，Stierle A, Strobel G, Stierle D. Science, 1993,260(4):214
, http://www.100md.com
7，郭 波，李海燕，张玲琪.云南大学学报(自然科学版)，1998，20(3) ：214
8，范秀蓉，李广武，沈 萍编.微生物学实验.北京：高等教育出版社， 1989：260
9，C. 布斯著.陈其泽译.镰刀菌属.北京：农业出版社，1998：152
10，翟中和主编.细胞生物学.北京：高等教育出版社，1995：379
11，王伯荪，李鸣光，彭少麟著.植物种群学.广州：广东高等教育出版社，1995 ：294
12，Roth J, Leroith V. Annals of the New York Academy of Science， 1986, 436:1
(1999-12-18收稿), 百拇医药