雷公藤甲素对异种神经移植后神经再生的影响*
作者：丁文龙 刘德明 温蔚
单位：丁文龙 刘德明 温蔚(江西医学院解剖学教研室，南昌 330006)
关键词：异种神经移植；神经再生；运动终板；感觉神经末梢；雷公藤甲素；大鼠；兔
解剖学报990108
【摘要】 目的 探讨雷公藤甲素对异种神经移植后神经再生的影响。 方法 将日本大耳兔的神经移植于Wistar大鼠坐骨神经后，宿主服用雷公藤甲素。 结果 大鼠存活4、8、12、16、24周，可见再生神经纤维长入移植神经并向远段坐骨神经生长。移植神经和远段神经内的再生神经纤维中有髓纤维和无髓纤维兼有之，大部分再生神经纤维聚集成束。术后12周的腓肠肌AChE呈阳性，并可见再生神经纤维与运动终板相连。12周以后的爪部皮下出现再生神经束，真皮层出现游离神经末梢。未服用雷公藤甲素的对照组因免疫排斥反应而神经不能再生。结论 雷公藤甲素在异种神经移植中具有免疫抑制作用。
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EFFECT OF TRIPTERYGIUM WILFORDII HOOK ON NERVE REGENERATION AFTER HETEROGRAFTING
Ding Wenlong△ Liu Deming Wen Wei
(Department of Anatomy,Jiangxi Medical College.Nanchang 330006)
【Abstract】 Objective In the present experiment,the effect of tripterygium wifordii hook on nerve regeneration in heterograft was explored.Methods The rats were given tripterygium wilfodii hook preparation(C6H1(13)(14)O6) after nerve grafting from rabbits (Japanese big ear stain,as donor)to rats(Wistar,as recipient). Results At 4,8,12,16 and 24 weeks after grafting,it was found that regenerating nerve fibers grew into the graft nerve and extended to the distal nerve segment.In the graft nerve and distal nerve segment,both myelinated and unmyelinated fibers of regenerating nerve were seen.Most of them were arranged in fascicles.Twelve weeks after grafting,gastrocnemius muscle showed positive AChE reaction and the regenerating nerve fibers connected with motor endplates.The regenerating nerve fascicles in subcutaneous tissus of the claws and the free nerve endings in derma were seen.In the control group without Tripterygium wilfordii hook,no nerve regeneration occurred due to the immune rejection. Conclusion The Tripteryguim wilfordii hook might play a role of immunodepression in the nerve heterografting.
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【Key words】 Heterografting; Nerve regeneration; Motor endplates; Sensory nerve endings; Tripterygium wilfordii hook; Rat; Rabbit
周围神经缺损使其支配区域功能丧失，这在临床较常见。异种神经来源丰富，但其存在的抗原性使之移植后因免疫排斥反应而难以存活。有报道异种神经移植前的先期处理[1～4]能减弱或消除异种神经的抗原性，移植后未被排斥、宿主的再生神经纤维能再生，并使去神经支配的骨骼肌运动终板再形成[5]。未经处理的异种神经移植后使用免疫抑制剂，宿主的再生神经纤维能长入移植神经[6～9]。但目前常用的免疫抑制剂Cyclosporin A,价格昂贵、副作用多。而中药雷公藤制剂价格低廉、又能延长同种异体心和肾的存活期[10，11]。本研究探讨雷公藤甲素对异种移植神经的影响、观察神经再生及其对骨骼肌和皮肤靶器官的再支配。
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材料和方法
5只1.5～2.0kg的日本成年大耳兔为神经供体，麻醉后取出兔的胫神经。成年Wistar大鼠(280～300g)29只为移植神经的受体，戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，于梨状肌下缘10mm处切除右坐骨神经8mm，移植入10mm长的兔胫神经，在额式放大镜下用9/0无损伤线将大鼠坐骨神经的近、远断端与植入的兔神经缝合，植入的兔神经与大鼠的坐骨神经等粗。实验组20只大鼠于术前1d和术后2周口服溶解于自来水中的雷公藤甲素6.6μg/kg.d，术后3周改为3.3μg/kg.d，术后4周为3.3μg/kg.隔日，术后5周为1.7μg/kg.隔日，术后6周停服雷公藤甲素。对照组9只大鼠术后口服自来水。
异种神经移植术后，实验组的大鼠分别存活4、8、12、16、24周，各存活期分别为4只动物。对照组的大鼠分别存活4、8、16周，各存活期分别为3只动物。麻醉后取出移植神经中段、距远端吻合部10mm处的远段坐骨神经，用含2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)4℃固定2h，再入含1%锇酸的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)4℃后固定1h，Epon618包埋，半薄切片经甲苯胺蓝染色，超薄切片常规染色。近段坐骨神经及其相连的移植神经、移植神经及其相连的远段坐骨神经入10%福尔马林固定，石蜡包埋纵切片，Bielschowsky法镀银染色。
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大鼠手术侧腓肠肌入含0.8%戊二醛的0.06mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)4℃固定1h，冰冻切片，按Karnovsky-Roots法显示乙酰胆碱酯酶(AChE)，切片的组织化学反应分为4个组，A组：Karnovsky-Roots孵育液；B组：孵育液中加四异丙基焦磷酰胺(iso-OMPA);C组：孵育液中加毒扁豆碱；D组：孵育液中不加乙酰硫代胆碱。一部分切片AChE结合镀银法染色。手术侧的爪部皮肤经10%福尔马林固定，冰冻切片，按Gross-Schultze改良的Bielschowsky法镀银染色显示皮肤的感觉神经末梢。
结果
1.服用雷公藤甲素的异种神经移植后的神经再生
异种神经移植术后除4周的移植神经稍粗外，其他各存活期的移植神经与宿主的坐骨神经等粗，移植神经的长度仍为10mm。移植神经与周围组织疏松相连、分离容易。
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在光镜下，神经移植后不同存活期均可见再生神经纤维从宿主坐骨神经的近段越过近端吻合部长入移植神经，继而穿过远端吻合部长入远段坐骨神经(图1，2)。但术后4周长入远段坐骨神经的再生神经纤维较存活期长的少。经甲苯胺蓝染色的移植神经和远段坐骨神经的半薄横切片上，再生神经纤维成束聚集或散在分布(图3，4)。术后4周尚可见少量溃变纤维，远段坐骨神经内的再生神经纤维较移植神经段稀疏。
移植神经中段和远段坐骨神经的横切片，在电镜下观察，可见大量再生轴突被Schwann细胞包绕形成有髓纤维，部分再生轴突被同一个Schwann细胞包绕形成无髓纤维，无髓纤维散在于有髓纤维之间。神经束膜包绕再生的有髓和无髓纤维形成神经束(图5)。Schwann细胞之间存在胶原原纤维。随着存活期的延长，再生轴突的直径增粗，有髓纤维的髓鞘增厚，超微结构日趋成熟。异种神经移植术后4周的移植神经段和远段坐骨神经仍存在少量溃变神经纤维及吞噬了细胞碎片和溃变髓鞘的巨噬细胞，移植神经段出现极少量淋巴细胞。其他各存活期的移植神经段和远段坐骨神经未见淋巴细胞和浆细胞。
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2.服用雷公藤甲素的异种神经移植后骨骼肌运动终板的再形成
A、B组：异种神经移植8周以后各存活期的大鼠腓肠肌出现棕褐色反应，AChE呈阳性反应，12周以后的AChE结合镀银染色的切片上，可见与AChE阳性反应分布一致的黑色沉淀，即AChE阳性部位被银颗粒覆盖。再生神经终末纤维与AChE阳性部位——运动终板相连(图6)，再生神经纤维可单独行走，也可从神经束分支而来与运动终板相连，形似葡萄串样。术后4周的大鼠腓肠肌尚存少量分布稀疏、很淡的棕色反应，AChE结合镀银染色的切片未出现银染的神经束及神经终末纤维。
C、D组：术后各存活期的腓肠肌未见任何沉淀，AChE为阴性反应，AChE结合镀银染色的切片未见神经束和神经纤维。
3.服用雷公藤甲素的异种神经移植后皮肤感觉神经末梢的再形成
异种神经移植术后8周的爪部皮肤的皮下组织可见成束的再生神经纤维，真皮层出现少量再生神经终末纤维。12周以后的各存活期亦可观察到上述结果，但真皮层的游离神经末梢增多(图7)，部分再生神经终末纤维行走在真皮乳头层内可能与Meissner小体有关。在表皮细胞之间出现的再生神经纤维形成游离的感觉神经末梢。随着存活期的延长，皮肤的再生神经纤维及感觉神经末梢的数量和种类也在增加。术后4周的爪部皮肤的皮下组织、真皮层和表皮均未见神经束及神经终末纤维，表明皮肤感觉神经纤维已溃变。
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4.未服用雷公藤甲素的异种神经移植
异种神经移植术后4周的移植神经较近、远段坐骨神经粗，术后16周的则变细，长度小于10mm。移植神经与周围组织广泛粘连。
光镜下观察，移植神经内充满了不规则排列的结缔组织，其间有大量溃变神经纤维、巨噬细胞、淋巴细胞以及细胞碎片。近端吻合部存在的瘢痕组织使宿主近段神经内的再生神经纤维生长受阻，术后4、8周只有少量再生神经纤维穿行于瘢痕组织之间、越过近端吻合部长入移植神经，但未见再生神经纤维通过远端吻合部长入远段坐骨神经。术后16周的移植神经被结缔组织取代。
术后4、8周的移植神经在电镜下可见大量淋巴细胞、浆细胞、吞噬了溃变神经纤维和细胞碎片的巨噬细胞(图8)，溃变神经纤维之间观察到少量再生的有髓纤维和无髓纤维。术后16周的移植神经出现大量成纤维细胞和胶原原纤维，少量巨噬细胞，但未见再生神经纤维。远段坐骨神经内亦可观察到吞噬了溃变神经纤维和细胞碎片的巨噬细胞，但未见再生神经纤维、淋巴细胞和浆细胞。
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术后4周的腓肠肌仅见颜色很淡的AChE反应，8周以后的腓肠肌AChE呈阴性，AChE结合镀银法染色的腓肠肌未见银染的神经终末纤维和神经束。术后各存活期的爪部皮肤未见任何神经束和神经终末纤维。
讨论
同种异体神经移植的实验研究中曾有人用硫唑嘌呤作为免疫抑制剂[12]，异体神经移植后未被排斥。近年在异体神经移植的研究中，Cylcosporin A作为首选的免疫抑制剂使用后宿主的再生神经纤维能长入异体移植神经[13，14]，但停药后再生神经纤维被排斥[15]，需要Cyclosporin A长期维持，但其昂贵的价格以及副作用多，使人难以接受。中药雷公藤制剂可延长异体心肌[10]和肾[11]的存活期。在肾移植的临床应用中，雷公藤对移植肾功能的恢复较硫唑嘌呤快，雷公藤作为免疫抑制剂作用不亚于硫唑嘌呤[11]。雷公藤价格便宜、毒性反应较CyclosporinA轻，感染发生率低，提高了肾移植的存活率[11]。本研究对接受了异种神经移植的大鼠使用雷公藤甲素，移植神经不仅未被排斥，而且宿主的再生神经纤维能长入异种移植神经并向远段坐骨神经延伸，重新支配了靶器官。雷公藤逐渐减量、停药后移植神经仍能存活，表明雷公藤在异种神经移植中具有免疫抑制作用。雷公藤可减少宿主脾脏T淋巴细胞及亚群的数量和比例，明显抑制宿主脾淋巴细胞白细胞介素2的活性和白细胞介素2受体的表达，雷公藤及其多种组分对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用[10]。
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未口服雷公藤的对照组，异种神经移植后出现免疫排斥反应，早期长入异种移植神经内的少量再生神经纤维，最终因免疫反应而被排斥，不能向远段生长。口服雷公藤的实验组在异种神经移植早期仍出现极少的淋巴细胞，提示弱的免疫反应仍存在，可能是本实验所用的雷公藤甲素的免疫抑制作用不如其他文献报道的雷公藤多甙的作用强；亦或本实验口服雷公藤的用药途径不如灌胃更能达到足够的剂量。虽然早期出现极少的淋巴细胞，但宿主的神经仍能再生，停用雷公藤后未出现排斥异种移植神经的现象，宿主的再生神经纤维继续向远段生长支配靶器官，使去神经支配的骨骼肌运动终板和皮肤感觉神经末梢再形成。AChE是神经递质乙酰胆碱(ACh)的水解酶，AChE的活性反映了ACh的活性，两者的活性有赖于神经元的正常结构与功能状态。AChE结合镀银染色不仅能观察到运动终板，而且可见与其相连的再生神经终末纤维，更为直观地反映再生神经纤维对骨骼肌的再支配。本实验在术后12周的腓肠肌观察到再生神经纤维与AChE阳性部位相连，皮肤出现再生神经纤维束和感觉神经纤维末梢，8周前的未见上述结果，表明随着存活期的延长，再生神经纤维向远段生长，重新支配了靶器官，这些为功能的恢复提供了形态学基础。
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iso-OMPA对非特异性胆碱酯酶有抑制作用，腓肠肌经含iso-OMPA的孵育液反应仍呈阳性，说明本实验观察到的AChE为特异性胆碱脂酶。孵育液中不加乙酰硫代胆碱或加毒扁豆碱的对照组腓肠肌的AChE为阴性，表明实验组的AChE反应并非假阳性反应。术后4周腓肠肌的浅棕色沉淀可能是去神经支配骨骼肌内残存的AChE。
图版说明
图1～7 为服用雷公藤甲素的异种神经移植实验组
图1，2 异种神经移植术后12周，近段坐骨神经(P)内的再生神经纤维通过近端吻合部(▲)长入移植神经段(G)，继而越过远端吻合部(▲)向远段坐骨神经(D)生长 ×60
图3 异种神经移植术后4周，移植神经段内的再生神经纤维。甲苯胺蓝染色 ×240
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图4 异种神经移植术后12周，移植神经内的再生神经纤维。甲苯胺蓝染色 ×240
图5 异种神经移植术后8周，移植神经段内再生的有髓纤维(★)和无髓纤维(▲)被神经束膜包绕(↑) ×5 000
图6 异种神经移植后12周，腓肠肌内的再生神经纤维(↑)与运动终板相连，AChE结合镀银染色 ×60
图7 异种神经移植术后24周，爪部真皮层内的再生神经末梢(▲)和行向表皮的游离神经末梢(↑) ×120
图8 未服用雷公藤甲素的异种神经移植对照组。术后4周移植神经段内的淋巴细胞(*)、巨噬细胞(▲)及细胞碎片 ×3 300
Explanation of figures
Fig.1-7 The heterografting with tripterygium wilfordii hook.These micrographs show nerve regeneration after heterografting.
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Fig.1,2 The regenerating nerve fibers in the proximal part(P) of the sciatie nerve passed through proximal suture(arrow)to the graft(G),the regenerating nerve fibers in the graft(G)passed the distal suture(arrow)to the distal part(D) of the sciatic nerve,at 12th week after transplantation ×60
Fig.3 Four weeks after heterografting,the regenerating nerve fibers in heterograft nerve are seen.Toluidine blue staining ×240
Fig.4 Twelve weeks after heterografting,the regenerating nerve fibers in heterograft nerve are seen.Toluidine blue staining ×240
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Fig.5 Eight weeks after grafting,myelinated(★)and unmyelinated(▲)fibers in the grafting nerve segment are surrounded by perineurium(↑) ×5 000
Fig.6 Twelve weeks after grafting, the regenerating nerve fibers(arrow)in gastrocnemius muscle connected with motor endplates.Silver combined with AChE stain ×60
Fig.7 Twenty four weeks after grafting, regenerating nerve endings in derma (▲) and free nerve endings(↑) extending to epiderm are seen ×120
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Fig.8 The heterografting without Tripterygium wilfordii hook.Four weeks after grafting,lymphocytes(*),macrophages(▲)and cellular debris are found in the grafting nerve segment ×3 300
* 国家自然科学基金资助课题(No.39060029)
△ Department of Anatomy,Jiangxi Medical College,Nanchang 330006,China
参考文献
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收稿1997-11 修回1998-05, 百拇医药
单位：丁文龙 刘德明 温蔚(江西医学院解剖学教研室，南昌 330006)
关键词：异种神经移植；神经再生；运动终板；感觉神经末梢；雷公藤甲素；大鼠；兔
解剖学报990108
【摘要】 目的 探讨雷公藤甲素对异种神经移植后神经再生的影响。 方法 将日本大耳兔的神经移植于Wistar大鼠坐骨神经后，宿主服用雷公藤甲素。 结果 大鼠存活4、8、12、16、24周，可见再生神经纤维长入移植神经并向远段坐骨神经生长。移植神经和远段神经内的再生神经纤维中有髓纤维和无髓纤维兼有之，大部分再生神经纤维聚集成束。术后12周的腓肠肌AChE呈阳性，并可见再生神经纤维与运动终板相连。12周以后的爪部皮下出现再生神经束，真皮层出现游离神经末梢。未服用雷公藤甲素的对照组因免疫排斥反应而神经不能再生。结论 雷公藤甲素在异种神经移植中具有免疫抑制作用。
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Ding Wenlong△ Liu Deming Wen Wei
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【Abstract】 Objective In the present experiment,the effect of tripterygium wifordii hook on nerve regeneration in heterograft was explored.Methods The rats were given tripterygium wilfodii hook preparation(C6H1(13)(14)O6) after nerve grafting from rabbits (Japanese big ear stain,as donor)to rats(Wistar,as recipient). Results At 4,8,12,16 and 24 weeks after grafting,it was found that regenerating nerve fibers grew into the graft nerve and extended to the distal nerve segment.In the graft nerve and distal nerve segment,both myelinated and unmyelinated fibers of regenerating nerve were seen.Most of them were arranged in fascicles.Twelve weeks after grafting,gastrocnemius muscle showed positive AChE reaction and the regenerating nerve fibers connected with motor endplates.The regenerating nerve fascicles in subcutaneous tissus of the claws and the free nerve endings in derma were seen.In the control group without Tripterygium wilfordii hook,no nerve regeneration occurred due to the immune rejection. Conclusion The Tripteryguim wilfordii hook might play a role of immunodepression in the nerve heterografting.
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【Key words】 Heterografting; Nerve regeneration; Motor endplates; Sensory nerve endings; Tripterygium wilfordii hook; Rat; Rabbit
周围神经缺损使其支配区域功能丧失，这在临床较常见。异种神经来源丰富，但其存在的抗原性使之移植后因免疫排斥反应而难以存活。有报道异种神经移植前的先期处理[1～4]能减弱或消除异种神经的抗原性，移植后未被排斥、宿主的再生神经纤维能再生，并使去神经支配的骨骼肌运动终板再形成[5]。未经处理的异种神经移植后使用免疫抑制剂，宿主的再生神经纤维能长入移植神经[6～9]。但目前常用的免疫抑制剂Cyclosporin A,价格昂贵、副作用多。而中药雷公藤制剂价格低廉、又能延长同种异体心和肾的存活期[10，11]。本研究探讨雷公藤甲素对异种移植神经的影响、观察神经再生及其对骨骼肌和皮肤靶器官的再支配。
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材料和方法
5只1.5～2.0kg的日本成年大耳兔为神经供体，麻醉后取出兔的胫神经。成年Wistar大鼠(280～300g)29只为移植神经的受体，戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，于梨状肌下缘10mm处切除右坐骨神经8mm，移植入10mm长的兔胫神经，在额式放大镜下用9/0无损伤线将大鼠坐骨神经的近、远断端与植入的兔神经缝合，植入的兔神经与大鼠的坐骨神经等粗。实验组20只大鼠于术前1d和术后2周口服溶解于自来水中的雷公藤甲素6.6μg/kg.d，术后3周改为3.3μg/kg.d，术后4周为3.3μg/kg.隔日，术后5周为1.7μg/kg.隔日，术后6周停服雷公藤甲素。对照组9只大鼠术后口服自来水。
异种神经移植术后，实验组的大鼠分别存活4、8、12、16、24周，各存活期分别为4只动物。对照组的大鼠分别存活4、8、16周，各存活期分别为3只动物。麻醉后取出移植神经中段、距远端吻合部10mm处的远段坐骨神经，用含2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)4℃固定2h，再入含1%锇酸的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)4℃后固定1h，Epon618包埋，半薄切片经甲苯胺蓝染色，超薄切片常规染色。近段坐骨神经及其相连的移植神经、移植神经及其相连的远段坐骨神经入10%福尔马林固定，石蜡包埋纵切片，Bielschowsky法镀银染色。
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大鼠手术侧腓肠肌入含0.8%戊二醛的0.06mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)4℃固定1h，冰冻切片，按Karnovsky-Roots法显示乙酰胆碱酯酶(AChE)，切片的组织化学反应分为4个组，A组：Karnovsky-Roots孵育液；B组：孵育液中加四异丙基焦磷酰胺(iso-OMPA);C组：孵育液中加毒扁豆碱；D组：孵育液中不加乙酰硫代胆碱。一部分切片AChE结合镀银法染色。手术侧的爪部皮肤经10%福尔马林固定，冰冻切片，按Gross-Schultze改良的Bielschowsky法镀银染色显示皮肤的感觉神经末梢。
结果
1.服用雷公藤甲素的异种神经移植后的神经再生
异种神经移植术后除4周的移植神经稍粗外，其他各存活期的移植神经与宿主的坐骨神经等粗，移植神经的长度仍为10mm。移植神经与周围组织疏松相连、分离容易。
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在光镜下，神经移植后不同存活期均可见再生神经纤维从宿主坐骨神经的近段越过近端吻合部长入移植神经，继而穿过远端吻合部长入远段坐骨神经(图1，2)。但术后4周长入远段坐骨神经的再生神经纤维较存活期长的少。经甲苯胺蓝染色的移植神经和远段坐骨神经的半薄横切片上，再生神经纤维成束聚集或散在分布(图3，4)。术后4周尚可见少量溃变纤维，远段坐骨神经内的再生神经纤维较移植神经段稀疏。
移植神经中段和远段坐骨神经的横切片，在电镜下观察，可见大量再生轴突被Schwann细胞包绕形成有髓纤维，部分再生轴突被同一个Schwann细胞包绕形成无髓纤维，无髓纤维散在于有髓纤维之间。神经束膜包绕再生的有髓和无髓纤维形成神经束(图5)。Schwann细胞之间存在胶原原纤维。随着存活期的延长，再生轴突的直径增粗，有髓纤维的髓鞘增厚，超微结构日趋成熟。异种神经移植术后4周的移植神经段和远段坐骨神经仍存在少量溃变神经纤维及吞噬了细胞碎片和溃变髓鞘的巨噬细胞，移植神经段出现极少量淋巴细胞。其他各存活期的移植神经段和远段坐骨神经未见淋巴细胞和浆细胞。
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2.服用雷公藤甲素的异种神经移植后骨骼肌运动终板的再形成
A、B组：异种神经移植8周以后各存活期的大鼠腓肠肌出现棕褐色反应，AChE呈阳性反应，12周以后的AChE结合镀银染色的切片上，可见与AChE阳性反应分布一致的黑色沉淀，即AChE阳性部位被银颗粒覆盖。再生神经终末纤维与AChE阳性部位——运动终板相连(图6)，再生神经纤维可单独行走，也可从神经束分支而来与运动终板相连，形似葡萄串样。术后4周的大鼠腓肠肌尚存少量分布稀疏、很淡的棕色反应，AChE结合镀银染色的切片未出现银染的神经束及神经终末纤维。
C、D组：术后各存活期的腓肠肌未见任何沉淀，AChE为阴性反应，AChE结合镀银染色的切片未见神经束和神经纤维。
3.服用雷公藤甲素的异种神经移植后皮肤感觉神经末梢的再形成
异种神经移植术后8周的爪部皮肤的皮下组织可见成束的再生神经纤维，真皮层出现少量再生神经终末纤维。12周以后的各存活期亦可观察到上述结果，但真皮层的游离神经末梢增多(图7)，部分再生神经终末纤维行走在真皮乳头层内可能与Meissner小体有关。在表皮细胞之间出现的再生神经纤维形成游离的感觉神经末梢。随着存活期的延长，皮肤的再生神经纤维及感觉神经末梢的数量和种类也在增加。术后4周的爪部皮肤的皮下组织、真皮层和表皮均未见神经束及神经终末纤维，表明皮肤感觉神经纤维已溃变。
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4.未服用雷公藤甲素的异种神经移植
异种神经移植术后4周的移植神经较近、远段坐骨神经粗，术后16周的则变细，长度小于10mm。移植神经与周围组织广泛粘连。
光镜下观察，移植神经内充满了不规则排列的结缔组织，其间有大量溃变神经纤维、巨噬细胞、淋巴细胞以及细胞碎片。近端吻合部存在的瘢痕组织使宿主近段神经内的再生神经纤维生长受阻，术后4、8周只有少量再生神经纤维穿行于瘢痕组织之间、越过近端吻合部长入移植神经，但未见再生神经纤维通过远端吻合部长入远段坐骨神经。术后16周的移植神经被结缔组织取代。
术后4、8周的移植神经在电镜下可见大量淋巴细胞、浆细胞、吞噬了溃变神经纤维和细胞碎片的巨噬细胞(图8)，溃变神经纤维之间观察到少量再生的有髓纤维和无髓纤维。术后16周的移植神经出现大量成纤维细胞和胶原原纤维，少量巨噬细胞，但未见再生神经纤维。远段坐骨神经内亦可观察到吞噬了溃变神经纤维和细胞碎片的巨噬细胞，但未见再生神经纤维、淋巴细胞和浆细胞。
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术后4周的腓肠肌仅见颜色很淡的AChE反应，8周以后的腓肠肌AChE呈阴性，AChE结合镀银法染色的腓肠肌未见银染的神经终末纤维和神经束。术后各存活期的爪部皮肤未见任何神经束和神经终末纤维。
讨论
同种异体神经移植的实验研究中曾有人用硫唑嘌呤作为免疫抑制剂[12]，异体神经移植后未被排斥。近年在异体神经移植的研究中，Cylcosporin A作为首选的免疫抑制剂使用后宿主的再生神经纤维能长入异体移植神经[13，14]，但停药后再生神经纤维被排斥[15]，需要Cyclosporin A长期维持，但其昂贵的价格以及副作用多，使人难以接受。中药雷公藤制剂可延长异体心肌[10]和肾[11]的存活期。在肾移植的临床应用中，雷公藤对移植肾功能的恢复较硫唑嘌呤快，雷公藤作为免疫抑制剂作用不亚于硫唑嘌呤[11]。雷公藤价格便宜、毒性反应较CyclosporinA轻，感染发生率低，提高了肾移植的存活率[11]。本研究对接受了异种神经移植的大鼠使用雷公藤甲素，移植神经不仅未被排斥，而且宿主的再生神经纤维能长入异种移植神经并向远段坐骨神经延伸，重新支配了靶器官。雷公藤逐渐减量、停药后移植神经仍能存活，表明雷公藤在异种神经移植中具有免疫抑制作用。雷公藤可减少宿主脾脏T淋巴细胞及亚群的数量和比例，明显抑制宿主脾淋巴细胞白细胞介素2的活性和白细胞介素2受体的表达，雷公藤及其多种组分对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用[10]。
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未口服雷公藤的对照组，异种神经移植后出现免疫排斥反应，早期长入异种移植神经内的少量再生神经纤维，最终因免疫反应而被排斥，不能向远段生长。口服雷公藤的实验组在异种神经移植早期仍出现极少的淋巴细胞，提示弱的免疫反应仍存在，可能是本实验所用的雷公藤甲素的免疫抑制作用不如其他文献报道的雷公藤多甙的作用强；亦或本实验口服雷公藤的用药途径不如灌胃更能达到足够的剂量。虽然早期出现极少的淋巴细胞，但宿主的神经仍能再生，停用雷公藤后未出现排斥异种移植神经的现象，宿主的再生神经纤维继续向远段生长支配靶器官，使去神经支配的骨骼肌运动终板和皮肤感觉神经末梢再形成。AChE是神经递质乙酰胆碱(ACh)的水解酶，AChE的活性反映了ACh的活性，两者的活性有赖于神经元的正常结构与功能状态。AChE结合镀银染色不仅能观察到运动终板，而且可见与其相连的再生神经终末纤维，更为直观地反映再生神经纤维对骨骼肌的再支配。本实验在术后12周的腓肠肌观察到再生神经纤维与AChE阳性部位相连，皮肤出现再生神经纤维束和感觉神经纤维末梢，8周前的未见上述结果，表明随着存活期的延长，再生神经纤维向远段生长，重新支配了靶器官，这些为功能的恢复提供了形态学基础。
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iso-OMPA对非特异性胆碱酯酶有抑制作用，腓肠肌经含iso-OMPA的孵育液反应仍呈阳性，说明本实验观察到的AChE为特异性胆碱脂酶。孵育液中不加乙酰硫代胆碱或加毒扁豆碱的对照组腓肠肌的AChE为阴性，表明实验组的AChE反应并非假阳性反应。术后4周腓肠肌的浅棕色沉淀可能是去神经支配骨骼肌内残存的AChE。
图版说明
图1～7 为服用雷公藤甲素的异种神经移植实验组
图1，2 异种神经移植术后12周，近段坐骨神经(P)内的再生神经纤维通过近端吻合部(▲)长入移植神经段(G)，继而越过远端吻合部(▲)向远段坐骨神经(D)生长 ×60
图3 异种神经移植术后4周，移植神经段内的再生神经纤维。甲苯胺蓝染色 ×240
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图4 异种神经移植术后12周，移植神经内的再生神经纤维。甲苯胺蓝染色 ×240
图5 异种神经移植术后8周，移植神经段内再生的有髓纤维(★)和无髓纤维(▲)被神经束膜包绕(↑) ×5 000
图6 异种神经移植后12周，腓肠肌内的再生神经纤维(↑)与运动终板相连，AChE结合镀银染色 ×60
图7 异种神经移植术后24周，爪部真皮层内的再生神经末梢(▲)和行向表皮的游离神经末梢(↑) ×120
图8 未服用雷公藤甲素的异种神经移植对照组。术后4周移植神经段内的淋巴细胞(*)、巨噬细胞(▲)及细胞碎片 ×3 300
Explanation of figures
Fig.1-7 The heterografting with tripterygium wilfordii hook.These micrographs show nerve regeneration after heterografting.
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Fig.1,2 The regenerating nerve fibers in the proximal part(P) of the sciatie nerve passed through proximal suture(arrow)to the graft(G),the regenerating nerve fibers in the graft(G)passed the distal suture(arrow)to the distal part(D) of the sciatic nerve,at 12th week after transplantation ×60
Fig.3 Four weeks after heterografting,the regenerating nerve fibers in heterograft nerve are seen.Toluidine blue staining ×240
Fig.4 Twelve weeks after heterografting,the regenerating nerve fibers in heterograft nerve are seen.Toluidine blue staining ×240
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Fig.5 Eight weeks after grafting,myelinated(★)and unmyelinated(▲)fibers in the grafting nerve segment are surrounded by perineurium(↑) ×5 000
Fig.6 Twelve weeks after grafting, the regenerating nerve fibers(arrow)in gastrocnemius muscle connected with motor endplates.Silver combined with AChE stain ×60
Fig.7 Twenty four weeks after grafting, regenerating nerve endings in derma (▲) and free nerve endings(↑) extending to epiderm are seen ×120
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Fig.8 The heterografting without Tripterygium wilfordii hook.Four weeks after grafting,lymphocytes(*),macrophages(▲)and cellular debris are found in the grafting nerve segment ×3 300
* 国家自然科学基金资助课题(No.39060029)
△ Department of Anatomy,Jiangxi Medical College,Nanchang 330006,China
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收稿1997-11 修回1998-05, 百拇医药