成人白血病患者DNA含量及细胞周期测定的临床意义
作者：袁宇宁 刘国勋 杨 勤 蔡康荣
单位：袁宇宁 刘国勋 杨 勤(广东医学院附属医院血液内科(524001))；蔡康荣(广东医学院中心实验室(524023))
关键词：流式细胞仪；白血病；DNA含量；细胞周期
广东医学991215 【摘要】 目的 探讨成人白血病患者骨髓细胞的周期分布、非整倍体及其与临床疗效的关系。方法 应用流式细胞仪测定了56例不同类型初诊白血病患者及10例正常对照者骨髓细胞DNA指数、细胞周期。结果 急性白血病患者骨髓非整倍体检出率为36.3%，慢粒组为33.4%；急性白血病非整倍体患者治疗首次完全缓解率(CR1)明显低于二倍体患者(P<0.05)；各型初诊白血病病例S+G2M%均低于对照组(P<0.05)。结论 白血病患者骨髓DNA含量和细胞周期测定可为预后提供参考依据。
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研究白血病细胞的生物学特性，对指导白血病治疗，判断预后有重要意义。流式细胞仪(FCM)用于白血病细胞DNA含量和细胞周期分布的分析已有不少文献报告[1～3]，但结果仍存在着争论。我们用FCM测定56例不同类型白血病患者骨髓细胞的DNA含量和细胞周期分布，并探讨其临床意义。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 56例白血病患者中，男38例，女18例，年龄16～68岁。诊断按天津1986年白血病会议标准进行[4]。急性非淋巴细胞白血病(ANLL)28例，其中M2型6例，M3型3例，M4型5例，M5型11例，M7型1例，浆细胞白血病2例，急性淋巴细胞白血病(ALL)16例，均为L2型。慢性粒细胞白血病(CML)慢性期12例。均为初治患者。对照组10例系无血液系统异常人之骨髓。
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1.2 样品制备 每份标本取骨髓0.5 mL加肝素(1 mg/mL)抗凝，并加入磷酸缓冲液(pH 7.4)稀释1倍，然后将标本轻轻加入盛有3 mL淋巴细胞分离液的试管内(淋巴细胞液比重1.077±0.002，上海试剂二厂)，离心2 000 r/min 20 min，将红细胞界面上的有核白细胞吸出，以磷酸缓冲液漂洗2次，离心1 500 r/min 5 min去上清液后即得单细胞样品，每份样品的细胞数为1×105/mL。
1.3 细胞DNA荧光染色 采用碘化丙啶荧光染色方法，每份样品加入染料1.0 mL，同时取正常人外周血淋巴细胞作为外标。在4℃冰箱内染色30 min，350目尼龙网过滤1次，即可在FCM上检测，每份样品检测2×104细胞。
1.4 定量细胞DNA方法 流式细胞仪(FCM)为美国Coulter生产(EPICS，XL)，每次测定样品前均用Coulter标准荧光微球校准仪器，使HPCV<2.0，再用Multicycle-DNAcycle analysis Software进行细胞周期分析。
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1.5 DNA倍体判断 根据DNA指数(DI)判断。DI指白血病细胞G1/O与正常二倍体G1/O细胞DNA荧光强度之比。DI正常范围为0.9～1.1，大于或小于本范围且与倍数无关称非整倍体。
1.6 统计学方法 χ2检验，t检验。
2 结果
2.1 对照组和白血病患者骨髓非整倍体检出率比较
对照组10例骨髓非整体检出率为0(0/10)，急性白血病组骨髓非整倍体检出率为36.3%(16/44)，其中ANLL为35.7%(10/28)，ALL为37.5%(6/16)，CML组为33.4%(4/12)，三组间比较差异无显著性(P>0.05)。
2.2 急性白血病患者DNA倍体与疗效关系 急性白血病二倍体组的CR1率为50.0%，而非整倍体组的CR1率为18.7%，两组比较差异有显著性(P<0.05)，见表1。
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表1 急性白血病患者DNA倍体与疗效关系 [例(%)] 分组
例数
CR
NR
二倍体组
28
14(50.0)
14(50.0)
非整倍体组
16
3(18.7)
13(81.3)
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2.3 对照组及治疗前白血病患者骨髓细胞周期对照 各型白血病与正常对照组比较，G1/0%增高，S+G2M%明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。表2 正常及治疗前白血病患者骨髓细胞周期时相 (
±s，%) 组别
例数
G1/0
S
G2M
S+G2M
对照
10
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77.31±6.93
16.13±5.10
6.67±2.67
22.17±6.54
ANLL
28
85.29±10.18
10.84±6.73
3.88±2.72
14.73±8.19
ALL
16
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87.83±10.56
9.21±7.18
2.75±2.12
12.09±8.56
CML
12
92.13±5.55
5.02±4.57
2.37±2.19
7.38±5.12
3 讨论
FCM是根据细胞DNA双链能与某些荧光物质(如碘化丙啶)结合，结合荧光的强度与细胞DNA含量相关这一原理，对单个细胞进行DNA含量测定，从而可以对DNA非整倍体进行研究，DNA非整倍体是DNA异常的标志，是恶性克隆增生的特征。Barlogie等复习了793例AL病例，DNA非整倍体检出率平均23%(6%～40%)。有报道急性白血病非整倍体检出率多在30%～40%[3]。本文的结果与国内文献报道基本相似。我们观察AL二倍体患者治疗CR1率为50.0%，而非整倍体治疗CR1率仅为18.7%，两者差异有显著性。二倍体患者治疗CR1率较非整倍体为高，说明非整倍体测定可以作为判定疗效的一个客观标准。应用FCM分析方法和形态学指标及临床表现综合判断化疗疗效，将会作出更加准确可靠的预后评估标准。
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S期+G2M期反映了细胞增殖状态。白血病细胞周期测定结果仍存在着争论。但多数学者报道治疗前急性白血病患者骨髓细胞在S期和G2M期比例减少[1，3]。我们的资料显示各组白血病G1/0比对照组高，而S+G2M期皆低于对照组。表明白血病细胞增殖活力低于正常。在增殖周期过程中G1期运行至S期之间存在阻滞，这符合急性白血病细胞增殖动力学改变及慢粒细胞动力学改变，由于白血病细胞增殖与分化过程失衡，白血病细胞异常增殖，不能同步分化为成熟细胞致使白血病细胞在骨髓中大量聚积。因此，了解白血病DNA含量、细胞增殖特性，对指导治疗和判断预后有重要意义。
参考文献
1 Raza A, Bokhari J, Yousuf N, et al. Cell cycle kinetic studies in human cancers: development of three DNA-specific labels in three decades. Arch Pathol Lab Med,1991,115(9):873
2 方智雯，张芳源，韩洁英，等.流式细胞仪测定成人白血病细胞动力学的临床意义.上海第二医科大学学报，1992，12(3)：207
3 梁英民，张盈华，林 榕，等.流式细胞仪测定急性白血病患者DNA含量的临床意义.第四军医大学学报，1996，17(3)：206
4 张之南，主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.天津：天津科技出版社，1998.171～173, http://www.100md.com
单位：袁宇宁 刘国勋 杨 勤(广东医学院附属医院血液内科(524001))；蔡康荣(广东医学院中心实验室(524023))
关键词：流式细胞仪；白血病；DNA含量；细胞周期
广东医学991215 【摘要】 目的 探讨成人白血病患者骨髓细胞的周期分布、非整倍体及其与临床疗效的关系。方法 应用流式细胞仪测定了56例不同类型初诊白血病患者及10例正常对照者骨髓细胞DNA指数、细胞周期。结果 急性白血病患者骨髓非整倍体检出率为36.3%，慢粒组为33.4%；急性白血病非整倍体患者治疗首次完全缓解率(CR1)明显低于二倍体患者(P<0.05)；各型初诊白血病病例S+G2M%均低于对照组(P<0.05)。结论 白血病患者骨髓DNA含量和细胞周期测定可为预后提供参考依据。
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研究白血病细胞的生物学特性，对指导白血病治疗，判断预后有重要意义。流式细胞仪(FCM)用于白血病细胞DNA含量和细胞周期分布的分析已有不少文献报告[1～3]，但结果仍存在着争论。我们用FCM测定56例不同类型白血病患者骨髓细胞的DNA含量和细胞周期分布，并探讨其临床意义。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 56例白血病患者中，男38例，女18例，年龄16～68岁。诊断按天津1986年白血病会议标准进行[4]。急性非淋巴细胞白血病(ANLL)28例，其中M2型6例，M3型3例，M4型5例，M5型11例，M7型1例，浆细胞白血病2例，急性淋巴细胞白血病(ALL)16例，均为L2型。慢性粒细胞白血病(CML)慢性期12例。均为初治患者。对照组10例系无血液系统异常人之骨髓。
, 百拇医药
1.2 样品制备 每份标本取骨髓0.5 mL加肝素(1 mg/mL)抗凝，并加入磷酸缓冲液(pH 7.4)稀释1倍，然后将标本轻轻加入盛有3 mL淋巴细胞分离液的试管内(淋巴细胞液比重1.077±0.002，上海试剂二厂)，离心2 000 r/min 20 min，将红细胞界面上的有核白细胞吸出，以磷酸缓冲液漂洗2次，离心1 500 r/min 5 min去上清液后即得单细胞样品，每份样品的细胞数为1×105/mL。
1.3 细胞DNA荧光染色 采用碘化丙啶荧光染色方法，每份样品加入染料1.0 mL，同时取正常人外周血淋巴细胞作为外标。在4℃冰箱内染色30 min，350目尼龙网过滤1次，即可在FCM上检测，每份样品检测2×104细胞。
1.4 定量细胞DNA方法 流式细胞仪(FCM)为美国Coulter生产(EPICS，XL)，每次测定样品前均用Coulter标准荧光微球校准仪器，使HPCV<2.0，再用Multicycle-DNAcycle analysis Software进行细胞周期分析。
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1.5 DNA倍体判断 根据DNA指数(DI)判断。DI指白血病细胞G1/O与正常二倍体G1/O细胞DNA荧光强度之比。DI正常范围为0.9～1.1，大于或小于本范围且与倍数无关称非整倍体。
1.6 统计学方法 χ2检验，t检验。
2 结果
2.1 对照组和白血病患者骨髓非整倍体检出率比较
对照组10例骨髓非整体检出率为0(0/10)，急性白血病组骨髓非整倍体检出率为36.3%(16/44)，其中ANLL为35.7%(10/28)，ALL为37.5%(6/16)，CML组为33.4%(4/12)，三组间比较差异无显著性(P>0.05)。
2.2 急性白血病患者DNA倍体与疗效关系 急性白血病二倍体组的CR1率为50.0%，而非整倍体组的CR1率为18.7%，两组比较差异有显著性(P<0.05)，见表1。
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表1 急性白血病患者DNA倍体与疗效关系 [例(%)] 分组
例数
CR
NR
二倍体组
28
14(50.0)
14(50.0)
非整倍体组
16
3(18.7)
13(81.3)
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2.3 对照组及治疗前白血病患者骨髓细胞周期对照 各型白血病与正常对照组比较，G1/0%增高，S+G2M%明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。表2 正常及治疗前白血病患者骨髓细胞周期时相 (
±s，%) 组别例数
G1/0
S
G2M
S+G2M
对照
10
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77.31±6.93
16.13±5.10
6.67±2.67
22.17±6.54
ANLL
28
85.29±10.18
10.84±6.73
3.88±2.72
14.73±8.19
ALL
16
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87.83±10.56
9.21±7.18
2.75±2.12
12.09±8.56
CML
12
92.13±5.55
5.02±4.57
2.37±2.19
7.38±5.12
3 讨论
FCM是根据细胞DNA双链能与某些荧光物质(如碘化丙啶)结合，结合荧光的强度与细胞DNA含量相关这一原理，对单个细胞进行DNA含量测定，从而可以对DNA非整倍体进行研究，DNA非整倍体是DNA异常的标志，是恶性克隆增生的特征。Barlogie等复习了793例AL病例，DNA非整倍体检出率平均23%(6%～40%)。有报道急性白血病非整倍体检出率多在30%～40%[3]。本文的结果与国内文献报道基本相似。我们观察AL二倍体患者治疗CR1率为50.0%，而非整倍体治疗CR1率仅为18.7%，两者差异有显著性。二倍体患者治疗CR1率较非整倍体为高，说明非整倍体测定可以作为判定疗效的一个客观标准。应用FCM分析方法和形态学指标及临床表现综合判断化疗疗效，将会作出更加准确可靠的预后评估标准。
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S期+G2M期反映了细胞增殖状态。白血病细胞周期测定结果仍存在着争论。但多数学者报道治疗前急性白血病患者骨髓细胞在S期和G2M期比例减少[1，3]。我们的资料显示各组白血病G1/0比对照组高，而S+G2M期皆低于对照组。表明白血病细胞增殖活力低于正常。在增殖周期过程中G1期运行至S期之间存在阻滞，这符合急性白血病细胞增殖动力学改变及慢粒细胞动力学改变，由于白血病细胞增殖与分化过程失衡，白血病细胞异常增殖，不能同步分化为成熟细胞致使白血病细胞在骨髓中大量聚积。因此，了解白血病DNA含量、细胞增殖特性，对指导治疗和判断预后有重要意义。
参考文献
1 Raza A, Bokhari J, Yousuf N, et al. Cell cycle kinetic studies in human cancers: development of three DNA-specific labels in three decades. Arch Pathol Lab Med,1991,115(9):873
2 方智雯，张芳源，韩洁英，等.流式细胞仪测定成人白血病细胞动力学的临床意义.上海第二医科大学学报，1992，12(3)：207
3 梁英民，张盈华，林 榕，等.流式细胞仪测定急性白血病患者DNA含量的临床意义.第四军医大学学报，1996，17(3)：206
4 张之南，主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.天津：天津科技出版社，1998.171～173, http://www.100md.com