鼻咽癌组织端粒酶活性的检测及临床意义*
作者：陈锦生 章金灿 曹锡标 郑佳坤 石钦胜 苏小雪
单位：潮州市中心医院(521021)
关键词：鼻咽癌；端粒酶
广东医学990209 【摘要】 目的 应用聚合酶链反应-酶免法(PCR-ELISA)检测鼻咽癌组织的端粒酶活性的临床意义。方法 PCR-ELISA以地高辛标记端粒重复片段特异的探针与PCR变性产物杂交，通过ELISA检测端粒酶活性。结果 30例鼻咽癌组织中有22例检出端粒酶活性，阳性率73.3%；18例对照组中3例检出端粒酶活性，阳性率16.6%。结论 检测端粒酶活性对阐明鼻咽癌的发病机制、癌变危险性的估测可能有重要意义。
The clinical meaning and determination of the telemerase activity from nasopharyngeal carcinoma tissues Chen Jinsheng, Zhang Jincan, Chao Xibiao, et al. The Department of Otolaryngology, Chaozhou Central Hospital, Chaozhou 521021
, 百拇医药
【Abstract】 Objective The clinical meaning of detecting telomerase activity in nasopharyngeal carcinoma by PCR-ELISA. Methods We used telomerase PCR-ELISA an assay in which a digoxigenin labeled telomerase repeat-specific probe is hybridized to the PCR product detecting with ELISA. Results The positive vate of the telomerase activity was 73.3% (22 out of 30) in the patient's group; The positive vate was 16.67% (3 out of 18) in the control group.Conclusion
The expression of telomerase may play a crucial vole in nasopharyngeal carcinoma and detection of telomerase activity may be helpful in predicting malignant change of NPC
, 百拇医药
【Key words】 Nasopharyngeal carcinoma Telomerase
鼻咽癌是我国高发肿瘤之一，尤其是以广东为主的南部地区。EB病毒在鼻咽癌的发生和发展中的作用已趋肯定。近年来，端粒酶与肿瘤的关系日益受到关注，以端粒酶做为肿瘤治疗的攻击目标已成为研究的热门话题。我们通过检测30例鼻咽癌组织的端粒酶活性，初步证明端粒酶与鼻咽癌的发生和发展有关。
1 资料和方法
1.1 检测对象 收集48例鼻咽部活检组织，每份组织切取一半送病理室检查，另一半进行双盲法端粒酶活性检测。48例组织中病理确诊为鼻咽癌30例，分为患者组，其中低分化鳞状细胞癌23例、未分化癌4例、泡状核细胞癌2例、恶性淋巴瘤1例。48例中经病理确诊为慢性炎症有18例，分为对照组。患者组中按临床分期为：一期4例、二期7例、三期16例、四期3例。
, 百拇医药
1.2 试剂来源 端粒酶PCR-ELISA试盒购自德国宝灵曼公司；无菌DEPC水由本室自备。
1.3 端粒酶活性检测方法
1.3.1 PCR-ELISA测定原理 端粒酶添加端粒重复序列(TTAGGG)到生物素标记、人工合成的P1-TS引物的3′端，经PCR反复扩增P1-TS和P2引物间的特异产物，产生含端粒酶特异6-核苷酸的PCR产物。将PCR产物变性后，与地高辛标记的端粒特异性重复序列检测探针杂交，杂交产物通过生物素标记探针固定到生物素亲和蛋白包被的微孔板上。固定的PCR产物被过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体(Anti-DIG-POD)检测。最后，过氧化物酶使反应底物TMB产生有色反应，使探针得以显示。
1.3.2 端粒酶提取 病变部位活检组织经切片机切取10～15 μm厚的小片约50片放入加有200 μL预冷的裂解液的灭菌反应管中。置冰上30 min后在4℃、16 000 g离心20 min，小心取出上清于DEPC处理过的离心管，用经典方法检测抽提液中的蛋白质含量，-80℃冻存提取液备用。
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1.3.3 端粒重复扩增 50 μL反应体系中包括dNTP、Taq酶、生物素标记的引物Ⅰ、引物Ⅱ、抽取液2 μL进行引物延伸：置25℃ 30 min，循环1次；端粒酶失活：94℃ 5 min、循环1次；PCR扩增：置94℃30 s、50℃30 s、72℃ 90 s，循环30次；最后置72℃10 min。
1.3.4 扩增产物进行杂交和ELISA过程 5 μL PCR扩增产物、20 μL变性试剂在室温上保温10 min，加入225 μL杂交液(含地高辛标记的检测探针DIG-labeled probe),充分混匀后，取其中的100 μL混合液于抗生物素蛋白包被好的微孔板上，置于37℃、速度为300 r/min的摇床上保温2 h。经洗涤后，加入抗DIG-POD 100 μL，18～22℃、30 mim。最后加入100 μL POD的底物TMB显色10 min，加终止液终止反应，用酶标仪测450 nm的吸光度(参考波长为690 nm)，根据A=A450-A690计算，如吸光度差值ΔΑ高于0.232，则判为阳性，低于0.232判为阴性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 患者组检测结果 检出端粒酶活性者有22例，阳性率为73.3%(22/30)。其中，23例低分化鳞癌中阳性者17例，阳性率73.9%；2例泡状核细胞癌中阳性者1例；4例未分化癌中阳性者3例；另有1例恶性淋巴瘤阳性。4例一期患者中阳性者4例，7例二期患者中阳性者6例，16例三期患者中阳性者11例，3例四期患者阳性者1例。
2.2 对照组检测结果 检出端粒酶活性者有3例，阳性率16.67%(3/18)。
2.3 统计学分析 患者组与对照组阳性率经χ2检验，P<0.01，差异非常明显；患者组中低分化鳞癌组与其他类型癌肿阳性率比较，P>0.05，差异无显著意义。但一、二期患者阳性率90.97%(10/11)，三、四期患者阳性率63.18%(12/19)。经χ2检验，P<0.05，差异有显著性意义。
, 百拇医药
3 讨论
端粒酶又称端粒末端转移酶(telomera teminal transferase)，是一种由RNA和蛋白质组成的逆转录酶，其化学性质是一种核糖核蛋白复合物(RNP)。端粒酶是正常细胞向恶性肿瘤细胞转化的关键性因子。端粒酶的激活是细胞走向不死性的关键，不死性是肿瘤恶性增殖的必要步骤[1] 。端粒酶广泛存在于各种癌组织、癌旁组织、癌前病变组织细胞中，不同分化程度的癌组织其端粒长度不同，端粒酶活性表达程度也有所不同。
鼻咽部是呼吸道的门户，暴露于致癌物及各种致癌因素的机率较高，故其肿瘤的发病危险系数也较高。因而有人称之为癌化区。目前对鼻咽癌的病因研究已相当深入，但至今未能较有力地解释鼻咽癌的发病机制。EB病毒在鼻咽癌中的致癌作用已较为肯定，人乳头瘤病毒在鼻咽癌的发生和发展中的作用也不容忽视[2]，还有其他多种致癌因素等等，但所有这些致癌因素是通过什么途径、在哪个环节起作用，很多问题尚存在比较大的争议。
, 百拇医药
本文通过对30例鼻咽癌活检组织检测其端粒酶活性，阳性率73.3%(22/30)，与18例对照组比较，阳性率16.6%(3/18)，经统计学处理，差异有非常显著的意义(P<0.01)；初步证明细胞端粒酶活性增高在鼻咽癌的发生和发展中有非常重要的意义。这一分子事件在鼻咽癌的无限增殖中是一个重要环节，根据本文检测结果可能出现这样的模式，即人类乳头瘤病毒中的E6蛋白与EB病毒的C3d受体都可以与细胞中的抑癌基因P53结合形成P53/E6蛋白复合物而使其失活或变异[2]；或者激活抑凋亡基因Bcl-2，而Bcl-2是调节端粒酶活性的重要基因之一，这就可解释人类肿瘤细胞广泛存在端粒酶活性和Bcl-2的表达。端粒酶的激活可导致端粒的延长，使染色体恢复稳定性，从而使细胞获得永久性转化，最终发展成为具有无限增殖力的肿瘤细胞。也就是说，肿瘤的发生和发展需要端粒酶的介入和维持。
本文检测结果还提示肿瘤的分化程度、病理类型与端粒酶活性表达无明显关系。但早期患者的端粒酶活性高于中晚期患者，是否提示端粒酶是做为肿瘤发生的启动因子，随着肿瘤增殖形成无限制的惯性，端粒酶活性也逐渐减退，这一论点有待进一步论证。
, http://www.100md.com
端粒酶PCR-ELISA与端粒重复扩增分析同位素掺入标记(放射自显影)法比较有诸多令人满意的优点：①安全而经济：即避免了放射性污染且价格便宜。②通用而简单：即可采用不同的产物分析方法，避免了费时的溶液准备工作。③灵敏而可靠：即结果准确，避免了假阳性和假阴性，可重复性好。④灵活而方便：即可同时对近百个标本进行检测，可检测肿瘤标本和细胞培养物等多种标本的端粒酶活性。
端粒酶活性检测有助于肿瘤的诊断和预后的估测，更重要的是提供了肿瘤基因治疗的新思路，以端粒酶基因作为今后肿瘤基因治疗的攻击对象，开发抑制端粒酶活性或基因表达的抑制剂，使肿瘤细胞的端粒不能有效合成及延长，不能获得永生性转化而进入程序化死亡[3]。这将为肿瘤基因治疗带来革命性的影响，也许不久的一天会从实验走向临床，为肿瘤的有效治愈做出重要贡献。
*广东省重点科技攻关项目及广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”资助项目
4 参考文献
1 Greider CW. Telomerase activity, cell proliferation, and cancer. PNAS, 1998, 95(1):90
2 陈锦生，章金灿，曹锡标，等.聚合酶链反应检测对鼻咽癌的病因学探讨.临床耳鼻咽喉科杂志，1996，10(2)：95
3 董为人，李 进，李福山，等.以端粒酶为靶点的药物设计和基因治疗策略.生理科学进展，1997，28：274, 百拇医药
单位：潮州市中心医院(521021)
关键词：鼻咽癌；端粒酶
广东医学990209 【摘要】 目的 应用聚合酶链反应-酶免法(PCR-ELISA)检测鼻咽癌组织的端粒酶活性的临床意义。方法 PCR-ELISA以地高辛标记端粒重复片段特异的探针与PCR变性产物杂交，通过ELISA检测端粒酶活性。结果 30例鼻咽癌组织中有22例检出端粒酶活性，阳性率73.3%；18例对照组中3例检出端粒酶活性，阳性率16.6%。结论 检测端粒酶活性对阐明鼻咽癌的发病机制、癌变危险性的估测可能有重要意义。
The clinical meaning and determination of the telemerase activity from nasopharyngeal carcinoma tissues Chen Jinsheng, Zhang Jincan, Chao Xibiao, et al. The Department of Otolaryngology, Chaozhou Central Hospital, Chaozhou 521021
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【Abstract】 Objective The clinical meaning of detecting telomerase activity in nasopharyngeal carcinoma by PCR-ELISA. Methods We used telomerase PCR-ELISA an assay in which a digoxigenin labeled telomerase repeat-specific probe is hybridized to the PCR product detecting with ELISA. Results The positive vate of the telomerase activity was 73.3% (22 out of 30) in the patient's group; The positive vate was 16.67% (3 out of 18) in the control group.Conclusion
The expression of telomerase may play a crucial vole in nasopharyngeal carcinoma and detection of telomerase activity may be helpful in predicting malignant change of NPC
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【Key words】 Nasopharyngeal carcinoma Telomerase
鼻咽癌是我国高发肿瘤之一，尤其是以广东为主的南部地区。EB病毒在鼻咽癌的发生和发展中的作用已趋肯定。近年来，端粒酶与肿瘤的关系日益受到关注，以端粒酶做为肿瘤治疗的攻击目标已成为研究的热门话题。我们通过检测30例鼻咽癌组织的端粒酶活性，初步证明端粒酶与鼻咽癌的发生和发展有关。
1 资料和方法
1.1 检测对象 收集48例鼻咽部活检组织，每份组织切取一半送病理室检查，另一半进行双盲法端粒酶活性检测。48例组织中病理确诊为鼻咽癌30例，分为患者组，其中低分化鳞状细胞癌23例、未分化癌4例、泡状核细胞癌2例、恶性淋巴瘤1例。48例中经病理确诊为慢性炎症有18例，分为对照组。患者组中按临床分期为：一期4例、二期7例、三期16例、四期3例。
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1.2 试剂来源 端粒酶PCR-ELISA试盒购自德国宝灵曼公司；无菌DEPC水由本室自备。
1.3 端粒酶活性检测方法
1.3.1 PCR-ELISA测定原理 端粒酶添加端粒重复序列(TTAGGG)到生物素标记、人工合成的P1-TS引物的3′端，经PCR反复扩增P1-TS和P2引物间的特异产物，产生含端粒酶特异6-核苷酸的PCR产物。将PCR产物变性后，与地高辛标记的端粒特异性重复序列检测探针杂交，杂交产物通过生物素标记探针固定到生物素亲和蛋白包被的微孔板上。固定的PCR产物被过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体(Anti-DIG-POD)检测。最后，过氧化物酶使反应底物TMB产生有色反应，使探针得以显示。
1.3.2 端粒酶提取 病变部位活检组织经切片机切取10～15 μm厚的小片约50片放入加有200 μL预冷的裂解液的灭菌反应管中。置冰上30 min后在4℃、16 000 g离心20 min，小心取出上清于DEPC处理过的离心管，用经典方法检测抽提液中的蛋白质含量，-80℃冻存提取液备用。
, 百拇医药
1.3.3 端粒重复扩增 50 μL反应体系中包括dNTP、Taq酶、生物素标记的引物Ⅰ、引物Ⅱ、抽取液2 μL进行引物延伸：置25℃ 30 min，循环1次；端粒酶失活：94℃ 5 min、循环1次；PCR扩增：置94℃30 s、50℃30 s、72℃ 90 s，循环30次；最后置72℃10 min。
1.3.4 扩增产物进行杂交和ELISA过程 5 μL PCR扩增产物、20 μL变性试剂在室温上保温10 min，加入225 μL杂交液(含地高辛标记的检测探针DIG-labeled probe),充分混匀后，取其中的100 μL混合液于抗生物素蛋白包被好的微孔板上，置于37℃、速度为300 r/min的摇床上保温2 h。经洗涤后，加入抗DIG-POD 100 μL，18～22℃、30 mim。最后加入100 μL POD的底物TMB显色10 min，加终止液终止反应，用酶标仪测450 nm的吸光度(参考波长为690 nm)，根据A=A450-A690计算，如吸光度差值ΔΑ高于0.232，则判为阳性，低于0.232判为阴性。
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2 结果
2.1 患者组检测结果 检出端粒酶活性者有22例，阳性率为73.3%(22/30)。其中，23例低分化鳞癌中阳性者17例，阳性率73.9%；2例泡状核细胞癌中阳性者1例；4例未分化癌中阳性者3例；另有1例恶性淋巴瘤阳性。4例一期患者中阳性者4例，7例二期患者中阳性者6例，16例三期患者中阳性者11例，3例四期患者阳性者1例。
2.2 对照组检测结果 检出端粒酶活性者有3例，阳性率16.67%(3/18)。
2.3 统计学分析 患者组与对照组阳性率经χ2检验，P<0.01，差异非常明显；患者组中低分化鳞癌组与其他类型癌肿阳性率比较，P>0.05，差异无显著意义。但一、二期患者阳性率90.97%(10/11)，三、四期患者阳性率63.18%(12/19)。经χ2检验，P<0.05，差异有显著性意义。
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3 讨论
端粒酶又称端粒末端转移酶(telomera teminal transferase)，是一种由RNA和蛋白质组成的逆转录酶，其化学性质是一种核糖核蛋白复合物(RNP)。端粒酶是正常细胞向恶性肿瘤细胞转化的关键性因子。端粒酶的激活是细胞走向不死性的关键，不死性是肿瘤恶性增殖的必要步骤[1] 。端粒酶广泛存在于各种癌组织、癌旁组织、癌前病变组织细胞中，不同分化程度的癌组织其端粒长度不同，端粒酶活性表达程度也有所不同。
鼻咽部是呼吸道的门户，暴露于致癌物及各种致癌因素的机率较高，故其肿瘤的发病危险系数也较高。因而有人称之为癌化区。目前对鼻咽癌的病因研究已相当深入，但至今未能较有力地解释鼻咽癌的发病机制。EB病毒在鼻咽癌中的致癌作用已较为肯定，人乳头瘤病毒在鼻咽癌的发生和发展中的作用也不容忽视[2]，还有其他多种致癌因素等等，但所有这些致癌因素是通过什么途径、在哪个环节起作用，很多问题尚存在比较大的争议。
, 百拇医药
本文通过对30例鼻咽癌活检组织检测其端粒酶活性，阳性率73.3%(22/30)，与18例对照组比较，阳性率16.6%(3/18)，经统计学处理，差异有非常显著的意义(P<0.01)；初步证明细胞端粒酶活性增高在鼻咽癌的发生和发展中有非常重要的意义。这一分子事件在鼻咽癌的无限增殖中是一个重要环节，根据本文检测结果可能出现这样的模式，即人类乳头瘤病毒中的E6蛋白与EB病毒的C3d受体都可以与细胞中的抑癌基因P53结合形成P53/E6蛋白复合物而使其失活或变异[2]；或者激活抑凋亡基因Bcl-2，而Bcl-2是调节端粒酶活性的重要基因之一，这就可解释人类肿瘤细胞广泛存在端粒酶活性和Bcl-2的表达。端粒酶的激活可导致端粒的延长，使染色体恢复稳定性，从而使细胞获得永久性转化，最终发展成为具有无限增殖力的肿瘤细胞。也就是说，肿瘤的发生和发展需要端粒酶的介入和维持。
本文检测结果还提示肿瘤的分化程度、病理类型与端粒酶活性表达无明显关系。但早期患者的端粒酶活性高于中晚期患者，是否提示端粒酶是做为肿瘤发生的启动因子，随着肿瘤增殖形成无限制的惯性，端粒酶活性也逐渐减退，这一论点有待进一步论证。
, http://www.100md.com
端粒酶PCR-ELISA与端粒重复扩增分析同位素掺入标记(放射自显影)法比较有诸多令人满意的优点：①安全而经济：即避免了放射性污染且价格便宜。②通用而简单：即可采用不同的产物分析方法，避免了费时的溶液准备工作。③灵敏而可靠：即结果准确，避免了假阳性和假阴性，可重复性好。④灵活而方便：即可同时对近百个标本进行检测，可检测肿瘤标本和细胞培养物等多种标本的端粒酶活性。
端粒酶活性检测有助于肿瘤的诊断和预后的估测，更重要的是提供了肿瘤基因治疗的新思路，以端粒酶基因作为今后肿瘤基因治疗的攻击对象，开发抑制端粒酶活性或基因表达的抑制剂，使肿瘤细胞的端粒不能有效合成及延长，不能获得永生性转化而进入程序化死亡[3]。这将为肿瘤基因治疗带来革命性的影响，也许不久的一天会从实验走向临床，为肿瘤的有效治愈做出重要贡献。
*广东省重点科技攻关项目及广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”资助项目
4 参考文献
1 Greider CW. Telomerase activity, cell proliferation, and cancer. PNAS, 1998, 95(1):90
2 陈锦生，章金灿，曹锡标，等.聚合酶链反应检测对鼻咽癌的病因学探讨.临床耳鼻咽喉科杂志，1996，10(2)：95
3 董为人，李 进，李福山，等.以端粒酶为靶点的药物设计和基因治疗策略.生理科学进展，1997，28：274, 百拇医药