采用改进方法检测肺癌组织端粒酶活性
作者：马刚 高劲松 陈佩毅 仝明 王传华 李影 何蕴韶 戎铁华
单位：马刚(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)；高劲松(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；陈佩毅(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；仝明(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)；王传华(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；李影(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；何蕴韶(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)； 戎铁华(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)
关键词：肺部肿瘤/诊断；端粒酶/诊断应用
癌症000311
摘 要：目的：用改进的TRAP法检测肺癌的端粒酶活性,探讨端粒酶活性与肺癌的关系。方法：用培养瓶替代液氮瓶收集标本，采用TRAP改进方法，内含36bp质控模板预防假阴性，增加引物长度避免二聚体形成，且使反应一步完成，并用银染法显示检测结果，对45例病理确诊的肺癌手术标本及一株肺癌细胞株的端粒酶活性进行检测。结果：38例肺癌标本端粒酶活性呈阳性，阳性率为84%(38/45),一株肺癌A549细胞株也呈阳性。结论：经改进后的TRAP法检测端粒酶活性，更加准确方便;标本采集处理方法简单有效，易于推广应用;端粒酶活性检测将有助于肺癌的诊断。
, 百拇医药
分类号：R734.2R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0233-03
Detection of telomerase activity in lung cancer by modified method
MA Gang et al.
(Cancer center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,P.R. China)
GAO Jing-song CHEN Pei-yi
( Daan Gene Diagnosis Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,P.R. China)
, 百拇医药
Abstract：Objective： To determine telomerase activity in lung cancer utilizing modified TRAP method and to reveal the relationship between telomerase activity and lung cancer. Methods： Forty five tumor samples pathologically confirmed lung cancer were collected in culture flasks.The telomerase activity was detected with modified TRAP(telomeric repeat amplification protocol) ,which added a 36bp quality control to prevent false negative , extended the primers length to avoid producing primer diamer and applied silver staine to show the result. Results： Telomerase activity was positive in 38 cases of lung cancer,the positive rate of telomerase activity was 84% . Telomerase activity in a lung cancer cell line A549 was also positive. Conclusion： Modified TRAP for determination of telomerase activity in tumor specimen was easier and more accurate.The preparation of sample was more simple and efficiency,and easy to apply. Thus,detection of telomerase activity by modified TRAP may be useful for the diagnosis of lung cancer.
, http://www.100md.com
Key words：Lung cancer/Diagnosis; Telomerase/Diagnosis application▲
自1994年发现端粒酶活性与肿瘤的相关关系以来，端粒酶一直是肿瘤生物学的研究热点，研究发现，进行端粒酶活性检测有助于肿瘤的临床诊断、疗效考核和预后判断。目前，端粒酶活性检测常采用Kim(1994)建立的TRAP法[1]，但该法存在一些不足，且临床标本的收集和处理因需液氮而带来不便。我们采用经改进的试剂盒，并针对标本收集处理方法进行了探索，用银染方法对45例肺癌手术标本端粒酶活性进行检测。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
肺癌细胞株A549，在常规下培养，用RPMI-1640培养基加10%小牛血清和含终浓度为100U/ml的双抗，5%CO2，饱和湿度，37℃培养箱中培养。
, 百拇医药
1.2 组织标本
45例肺癌系我院1998年5月至9月手术后的肿瘤标本，在无菌条件下去除坏死组织，用生理盐水洗掉血污后，切取约0.1g大小组织块，放入已消毒灭菌的RPMI-1640培养基内(5ml，含青、链霉素各500U/ml)，在4℃保存，并于1～2d内完成对标本的处理。同时送一份标本作病理检查。
1.3 端粒酶检测
1.3.1 模板制备、培养细胞:常规方法收集培养细胞于1.5mlEppendorf管中，加入清洗液1ml，振荡混匀离心1000r/m5min,去上清，加入100μl裂解缓冲液混匀，冰浴30min,4℃12000rpm离心20min取上清，用Bio-Rad蛋白测定液(考马斯亮兰法)测定蛋白含量后，-80℃保存或作检测;组织标本:用灭菌后的眼科剪剪碎组织，在培养基内洗涤数次，去掉大块组织，离心收集脱落细胞，将这些细胞放入1.5mlEppendorf管内，若内含大量红细胞，则用1mlDEPC水水洗一次，离心去上清后再加入清洗液1ml洗涤，以后步骤同前述。
, 百拇医药
1.3.2 TRAP反应:采用我校达安基因诊断中心研制的端粒酶检测试剂盒，操作按说明进行。在每一单管反应液中加入提取的样本2μl(蛋白质含量约1～6μg)，自身阴性对照为相同样本经0.5μgRNA酶37℃处理1h后加2μl于反应管内，离心数秒后在PE2400型PCR仪上按30℃保温20min，93℃30sec,60℃30sec32个循环，最后72℃延伸7min进行扩增.
1.3.3 电泳:将20μlPCR产物与2μl上样缓冲液混合后，在12.5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(BiRad电泳仪)，电泳缓冲液为0.5×TBE,电压120V约2h或电泳至二甲苯氰距凝胶底部约1cm为止。
1.3.4 银染:电泳结束后，将凝胶置10%乙醇内固定5min;1%硝酸脱色3min，去离子水漂洗2次；0.012mol硝酸银染色20min，去离子水漂洗2次；28mol碳酸钠和0.019%甲醛显影液显影约10min，直到条带显色满意时用蒸馏水终止显色;10%乙酸固定5min，去离子水漂洗后，拍照或制成薄膜保存。
, http://www.100md.com
1.3.5 结果分析:出现以6bp为间隔的梯形条带为阳性，仅出现36bp的质控条带为阴性，36bp条带消失也无梯形条带出现为假阴性，36bp条带消失有梯形条带出现为强阳性。
2 结果
采用改进的1640培养基替代传统液氮法收集标本，简单可行，标本在培养基内室温保存2d，4℃保存1w，端粒酶活性仍可保持。提取的肺癌组织端粒酶上清液，经Bio-Rad蛋白测定试剂测定，其蛋白含量大多在1～6μg间，个别大于6μg的标本，用提取液稀释至1～6μg范围内再行检测，蛋白含量过高可致假阴性，或使扩增条带不规则，如图1第2泳道为蛋白含量10μg，扩增条带不理想。36bp为特意加入的质控条带，它与端粒酶活性无关，仅反映PCR成功与否，可有效判定假阴性。端粒酶活性出现的第一个条带为50bp，在36～50bp间偶尔会有引物二聚体出现。肺癌细胞株和阳性肺癌组织可见自50bp起间隔6bp的梯形条带，自身阴性对照仅有36bp条带出现(见图1)，45例肺癌组织中检出38例有端粒酶活性，阳性率为84%。不同病理情况的肺癌组织与端粒酶活性的关系见表1。
, 百拇医药
表1 45例肺癌端粒酶活性检测情况 病人情况
端粒酶阳性
端粒酶阴性
年龄(岁)
39～71(55.6)
43～67(53.2)
性别(男∶女)
23∶15
5：2
鳞癌
15
4
, 百拇医药
腺癌
12
3
腺鳞癌
4
0
细支气管肺泡上皮细胞癌
4
0
肺部转移癌
3
0
, http://www.100md.com
图1 肺癌标本及A549细胞株端粒酶活性检测结果
M、pBR322DNA/HaeⅢ分子量标准；1、蛋白含量10μg；
2、自身阴性对照；3、肺腺癌标本；4、自身阴性对照；
5、肺磷癌标本；6、自身阴性对照；7、肺癌A549细胞株；8、自身阴性对照
3 讨论
自1994年发现端粒酶活性与肿瘤有密切关系以来，已证实绝大多数恶性肿瘤(肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌及卵巢癌等)端粒酶活性平均85%以上阳性，而良性肿瘤和体细胞(除生殖细胞、造血干细胞等少数细胞外)没有端粒酶活性[1]。并发现端粒酶活性可因疗效的增加而下降，端粒酶活性与预后有一定相关，端粒酶活性越强预示病情越重，预后越差[2]。我们检测到的肺癌组织端粒酶阳性率为84%，与Hiyama等报道原发性肺癌80%有端粒酶活性[3]，Yashima等报道肺癌标本中检出94%的端粒酶活性相近[4]。本次实验发现肺癌组织端粒酶阳性情况与病理类型和细胞分化无明显相关，这与多数报道相符[4～5]。我们在检测时也发现不同患者端粒酶活性强弱不一，定量检测端粒酶活性将显得必要，对这些患者的预后判断正在随访观察中。
, 百拇医药
我们对肿瘤组织标本的采集和处理进行了改进，使之更适用于临床检测的实际。采用培养瓶收集手术后标本，简单方便，可行性强，它避免了使用液氮所带来的不便，标本在培养瓶内室温保存2d，4℃保存在1w仍能查出端粒酶活性，这是因为细胞培养基能维持组织细胞一定时间的活性。为了预防污染，在取材时要求严格无菌，同时在培养基内加入适量双抗。肿瘤细胞间的连结较为松散，处理标本时用眼科剪剪碎组织，再在培养基内振荡数次，可洗脱大量癌细胞，足够检测之用，因TRAP法通过PCR放大效应，非常敏感，可检测到标本中100个以上的肿瘤细胞[1]。剩下的癌组织可用于其他用途，也避免了大块组织需匀浆器研磨的不便，本次实验采用的方法有极强的的可行性，易于推广应用。
本实验采用在TRAP法基础上改进后的试剂盒，它有明显的优点。克服了以往TRAP法需两次添加引物的不便，使反应一步完成，并且减少了引物二聚体的形成，肿瘤组织中有大量杂蛋白，它们对PCR反应中的Taq酶有较强的抑制作用，若标本上样时蛋白含量过高，常会出现假阴性的情况。为判断和克服这一问题，反应管内含一同端粒酶无关的36bp质控条带，它的出现与否只同PCR成功与否相关，36bp的条带与第一条被扩增的端粒酶产物50bp条带相差14bp,图象上易于区别，故能准确识别假阴性，假阴性标本可进一步稀释后再作一次反应，这样提高了方法的可靠性。本次实验检出的端粒酶阳性率较高，可能与此有一定关系。应用非放射性的银染方法对端粒酶活性进行检测，更加简便、省时、安全，敏感性一样能达到很高水平，图像清晰，足已满足临床标本的检测要求。
, http://www.100md.com
通讯作者：高劲松：Tel：86-20-87331456 Fax：86-20-87616440 E-mail：gjs216@163.net
参考文献：
[1]Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer [J]. Science , 1994,266:2011～ 2015.
[2]Hiyama E,Hiyama K,Yokoyama T,et al.Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes [J]. Nat Med,1995,1:249～ 255.
, 百拇医药
[3]Hiyama K,Hiyama E,Ishioka S, et al.Telomerase activity in small-cell and nonsmall-cell lung cancers [J]. J Natl cancer Inst, 1995,87:895～ 902.
[4]Yashima K,Litzky LA,Kaiser L,et al.Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas [J]. Cancer Res ,1997,57:2373～ 2377.
[5]Brien TP,Kallakury BV,Lowry CV,et al.Telomerase activity in benign endometrium and endometrial carcinoma [J]. Cancer Res,1997,57:2760～ 2764.
收稿日期:1999-05-11
修稿日期:1999-06-29, 百拇医药
单位：马刚(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)；高劲松(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；陈佩毅(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；仝明(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)；王传华(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；李影(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；何蕴韶(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)； 戎铁华(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)
关键词：肺部肿瘤/诊断；端粒酶/诊断应用
癌症000311
摘 要：目的：用改进的TRAP法检测肺癌的端粒酶活性,探讨端粒酶活性与肺癌的关系。方法：用培养瓶替代液氮瓶收集标本，采用TRAP改进方法，内含36bp质控模板预防假阴性，增加引物长度避免二聚体形成，且使反应一步完成，并用银染法显示检测结果，对45例病理确诊的肺癌手术标本及一株肺癌细胞株的端粒酶活性进行检测。结果：38例肺癌标本端粒酶活性呈阳性，阳性率为84%(38/45),一株肺癌A549细胞株也呈阳性。结论：经改进后的TRAP法检测端粒酶活性，更加准确方便;标本采集处理方法简单有效，易于推广应用;端粒酶活性检测将有助于肺癌的诊断。
, 百拇医药
分类号：R734.2R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0233-03
Detection of telomerase activity in lung cancer by modified method
MA Gang et al.
(Cancer center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,P.R. China)
GAO Jing-song CHEN Pei-yi
( Daan Gene Diagnosis Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,P.R. China)
, 百拇医药
Abstract：Objective： To determine telomerase activity in lung cancer utilizing modified TRAP method and to reveal the relationship between telomerase activity and lung cancer. Methods： Forty five tumor samples pathologically confirmed lung cancer were collected in culture flasks.The telomerase activity was detected with modified TRAP(telomeric repeat amplification protocol) ,which added a 36bp quality control to prevent false negative , extended the primers length to avoid producing primer diamer and applied silver staine to show the result. Results： Telomerase activity was positive in 38 cases of lung cancer,the positive rate of telomerase activity was 84% . Telomerase activity in a lung cancer cell line A549 was also positive. Conclusion： Modified TRAP for determination of telomerase activity in tumor specimen was easier and more accurate.The preparation of sample was more simple and efficiency,and easy to apply. Thus,detection of telomerase activity by modified TRAP may be useful for the diagnosis of lung cancer.
, http://www.100md.com
Key words：Lung cancer/Diagnosis; Telomerase/Diagnosis application▲
自1994年发现端粒酶活性与肿瘤的相关关系以来，端粒酶一直是肿瘤生物学的研究热点，研究发现，进行端粒酶活性检测有助于肿瘤的临床诊断、疗效考核和预后判断。目前，端粒酶活性检测常采用Kim(1994)建立的TRAP法[1]，但该法存在一些不足，且临床标本的收集和处理因需液氮而带来不便。我们采用经改进的试剂盒，并针对标本收集处理方法进行了探索，用银染方法对45例肺癌手术标本端粒酶活性进行检测。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
肺癌细胞株A549，在常规下培养，用RPMI-1640培养基加10%小牛血清和含终浓度为100U/ml的双抗，5%CO2，饱和湿度，37℃培养箱中培养。
, 百拇医药
1.2 组织标本
45例肺癌系我院1998年5月至9月手术后的肿瘤标本，在无菌条件下去除坏死组织，用生理盐水洗掉血污后，切取约0.1g大小组织块，放入已消毒灭菌的RPMI-1640培养基内(5ml，含青、链霉素各500U/ml)，在4℃保存，并于1～2d内完成对标本的处理。同时送一份标本作病理检查。
1.3 端粒酶检测
1.3.1 模板制备、培养细胞:常规方法收集培养细胞于1.5mlEppendorf管中，加入清洗液1ml，振荡混匀离心1000r/m5min,去上清，加入100μl裂解缓冲液混匀，冰浴30min,4℃12000rpm离心20min取上清，用Bio-Rad蛋白测定液(考马斯亮兰法)测定蛋白含量后，-80℃保存或作检测;组织标本:用灭菌后的眼科剪剪碎组织，在培养基内洗涤数次，去掉大块组织，离心收集脱落细胞，将这些细胞放入1.5mlEppendorf管内，若内含大量红细胞，则用1mlDEPC水水洗一次，离心去上清后再加入清洗液1ml洗涤，以后步骤同前述。
, 百拇医药
1.3.2 TRAP反应:采用我校达安基因诊断中心研制的端粒酶检测试剂盒，操作按说明进行。在每一单管反应液中加入提取的样本2μl(蛋白质含量约1～6μg)，自身阴性对照为相同样本经0.5μgRNA酶37℃处理1h后加2μl于反应管内，离心数秒后在PE2400型PCR仪上按30℃保温20min，93℃30sec,60℃30sec32个循环，最后72℃延伸7min进行扩增.
1.3.3 电泳:将20μlPCR产物与2μl上样缓冲液混合后，在12.5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(BiRad电泳仪)，电泳缓冲液为0.5×TBE,电压120V约2h或电泳至二甲苯氰距凝胶底部约1cm为止。
1.3.4 银染:电泳结束后，将凝胶置10%乙醇内固定5min;1%硝酸脱色3min，去离子水漂洗2次；0.012mol硝酸银染色20min，去离子水漂洗2次；28mol碳酸钠和0.019%甲醛显影液显影约10min，直到条带显色满意时用蒸馏水终止显色;10%乙酸固定5min，去离子水漂洗后，拍照或制成薄膜保存。
, http://www.100md.com
1.3.5 结果分析:出现以6bp为间隔的梯形条带为阳性，仅出现36bp的质控条带为阴性，36bp条带消失也无梯形条带出现为假阴性，36bp条带消失有梯形条带出现为强阳性。
2 结果
采用改进的1640培养基替代传统液氮法收集标本，简单可行，标本在培养基内室温保存2d，4℃保存1w，端粒酶活性仍可保持。提取的肺癌组织端粒酶上清液，经Bio-Rad蛋白测定试剂测定，其蛋白含量大多在1～6μg间，个别大于6μg的标本，用提取液稀释至1～6μg范围内再行检测，蛋白含量过高可致假阴性，或使扩增条带不规则，如图1第2泳道为蛋白含量10μg，扩增条带不理想。36bp为特意加入的质控条带，它与端粒酶活性无关，仅反映PCR成功与否，可有效判定假阴性。端粒酶活性出现的第一个条带为50bp，在36～50bp间偶尔会有引物二聚体出现。肺癌细胞株和阳性肺癌组织可见自50bp起间隔6bp的梯形条带，自身阴性对照仅有36bp条带出现(见图1)，45例肺癌组织中检出38例有端粒酶活性，阳性率为84%。不同病理情况的肺癌组织与端粒酶活性的关系见表1。
, 百拇医药
表1 45例肺癌端粒酶活性检测情况 病人情况
端粒酶阳性
端粒酶阴性
年龄(岁)
39～71(55.6)
43～67(53.2)
性别(男∶女)
23∶15
5：2
鳞癌
15
4
, 百拇医药
腺癌
12
3
腺鳞癌
4
0
细支气管肺泡上皮细胞癌
4
0
肺部转移癌
3
0
, http://www.100md.com
图1 肺癌标本及A549细胞株端粒酶活性检测结果
M、pBR322DNA/HaeⅢ分子量标准；1、蛋白含量10μg；
2、自身阴性对照；3、肺腺癌标本；4、自身阴性对照；
5、肺磷癌标本；6、自身阴性对照；7、肺癌A549细胞株；8、自身阴性对照
3 讨论
自1994年发现端粒酶活性与肿瘤有密切关系以来，已证实绝大多数恶性肿瘤(肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌及卵巢癌等)端粒酶活性平均85%以上阳性，而良性肿瘤和体细胞(除生殖细胞、造血干细胞等少数细胞外)没有端粒酶活性[1]。并发现端粒酶活性可因疗效的增加而下降，端粒酶活性与预后有一定相关，端粒酶活性越强预示病情越重，预后越差[2]。我们检测到的肺癌组织端粒酶阳性率为84%，与Hiyama等报道原发性肺癌80%有端粒酶活性[3]，Yashima等报道肺癌标本中检出94%的端粒酶活性相近[4]。本次实验发现肺癌组织端粒酶阳性情况与病理类型和细胞分化无明显相关，这与多数报道相符[4～5]。我们在检测时也发现不同患者端粒酶活性强弱不一，定量检测端粒酶活性将显得必要，对这些患者的预后判断正在随访观察中。
, 百拇医药
我们对肿瘤组织标本的采集和处理进行了改进，使之更适用于临床检测的实际。采用培养瓶收集手术后标本，简单方便，可行性强，它避免了使用液氮所带来的不便，标本在培养瓶内室温保存2d，4℃保存在1w仍能查出端粒酶活性，这是因为细胞培养基能维持组织细胞一定时间的活性。为了预防污染，在取材时要求严格无菌，同时在培养基内加入适量双抗。肿瘤细胞间的连结较为松散，处理标本时用眼科剪剪碎组织，再在培养基内振荡数次，可洗脱大量癌细胞，足够检测之用，因TRAP法通过PCR放大效应，非常敏感，可检测到标本中100个以上的肿瘤细胞[1]。剩下的癌组织可用于其他用途，也避免了大块组织需匀浆器研磨的不便，本次实验采用的方法有极强的的可行性，易于推广应用。
本实验采用在TRAP法基础上改进后的试剂盒，它有明显的优点。克服了以往TRAP法需两次添加引物的不便，使反应一步完成，并且减少了引物二聚体的形成，肿瘤组织中有大量杂蛋白，它们对PCR反应中的Taq酶有较强的抑制作用，若标本上样时蛋白含量过高，常会出现假阴性的情况。为判断和克服这一问题，反应管内含一同端粒酶无关的36bp质控条带，它的出现与否只同PCR成功与否相关，36bp的条带与第一条被扩增的端粒酶产物50bp条带相差14bp,图象上易于区别，故能准确识别假阴性，假阴性标本可进一步稀释后再作一次反应，这样提高了方法的可靠性。本次实验检出的端粒酶阳性率较高，可能与此有一定关系。应用非放射性的银染方法对端粒酶活性进行检测，更加简便、省时、安全，敏感性一样能达到很高水平，图像清晰，足已满足临床标本的检测要求。
, http://www.100md.com
通讯作者：高劲松：Tel：86-20-87331456 Fax：86-20-87616440 E-mail：gjs216@163.net
参考文献：
[1]Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer [J]. Science , 1994,266:2011～ 2015.
[2]Hiyama E,Hiyama K,Yokoyama T,et al.Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes [J]. Nat Med,1995,1:249～ 255.
, 百拇医药
[3]Hiyama K,Hiyama E,Ishioka S, et al.Telomerase activity in small-cell and nonsmall-cell lung cancers [J]. J Natl cancer Inst, 1995,87:895～ 902.
[4]Yashima K,Litzky LA,Kaiser L,et al.Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas [J]. Cancer Res ,1997,57:2373～ 2377.
[5]Brien TP,Kallakury BV,Lowry CV,et al.Telomerase activity in benign endometrium and endometrial carcinoma [J]. Cancer Res,1997,57:2760～ 2764.
收稿日期:1999-05-11
修稿日期:1999-06-29, 百拇医药