X-射线诱导大肠癌细胞PCD与p53转录表达改变
作者：季代金 曹燕
单位：季代金(解放军第452医院消化科 成都610061)；曹燕(成都市第十人民医院内科)
关键词：基因，p53；放射生物学；PCD；肿瘤细胞，培养的
肿瘤000616
摘要：目的 探讨大肠癌HT-29、Lovo细胞在X-射线诱导PCD过程中不同类型p53基因转录表达改变，为肿瘤的放射治疗方案提供新的理论线索。方法 选择几种临床常用X-射线放射治疗剂量诱导大肠癌细胞呈现PCD特征，应用免疫细胞化学和细胞原位杂交技术对含有不同类型p53基因的HT-29、Lovo两种大肠癌细胞p53蛋白表达和p53 mRNA转录进行对比分析。结果 两种细胞经X-射线照射后均表现出较为典型的细胞凋亡改变，两种细胞p53 mRNA转录均有所增强。HT-29细胞p53蛋白表达增强，Lovo细胞p53蛋白却始终不能检出。结论 p53基因确实参与了X-射线诱导大肠癌细胞的PCD过程。但是，突变型和野生型p53基因的转录表达改变不尽相同，提示不同类型p53基因发挥的作用不同。
, 百拇医药
中图分类号：R73-36 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-440-03
VARIATION OF p53 GENE TRANSCRIPTION AND EXPRESSION IN COLO-RECTAL CARCINOMA CELL PCD INDUCED BY X-RAY
JI Dai-jin CAO Yan
Department of Gastroenterology, No.452 Hospital of PLA, Chengdu 610061,China
Abstract：Objective To investigate the variations of p53 gene transcription and expression in colo-rectal carcinoma HT-29 and Lovo cells lines during the programmed cell death (PCD) induced by X-ray and to search for the new clues for radiation treatment of carcinoma. Methods Several conventional doses of X-ray (5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy) were chosen in this study. After the PCD was induced by the doses, the comparative analysis were conducted in HT-29, Lovo cell lines that have different types of p53 genes by immunohistochemical and in situ hybridization. Results After X-ray irradiation the cells showed typical characteristics of PCD. Both the cells increased p53 mRNA transcriptions. p53 protein expression was increased in HT-29 but no p53 protein was found in Lovo. Conclusion The results show that p53 protein actually participated in the PCD induced by X-ray. In this process, however, the changes are different between the wild and mutant p53 genes. It suggests that different p53 genes play different roles in the process.
, 百拇医药
Key words： Gene,p53； Radiobiology; PCD； Tumor cells,cultured
许多研究发现，治疗肿瘤的多种措施可能诱导肿瘤细胞产生程序化死亡(Programmed Cell Death, PCD)。各种DNA损伤因子对细胞的损伤作用亦可通过诱导细胞PCD而发挥作用。在此过程中，p53基因可与多种细胞生长因子、癌基因等相互调节参与诱导细胞PCD。文献报告[1，2]，X-射线介导的细胞毒作用可能与依赖p53基因的PCD有关。但该过程中p53基因mRNA和蛋白发生怎样的改变却知之甚少。为此，作者用X-射线诱导大肠癌细胞呈现PCD，应用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)和原位杂交(In situ Hybridization,ISH)技术对含有不同类型p53基因的HT-29、Lovo细胞中p53 mRNA和蛋白表达改变进行了比较研究，现报告如下。
材料和方法
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一、细胞、主要试剂和仪器 HT-29、Lovo细胞为本实验室自存；X-射线直线加速器(Varian 2100C型)由本院放疗中心提供；MAb1801购自Santa Cruz公司；ABC试剂盒为Vector公司产品；p53质粒(pUC18-p53)为本实验室自存；光敏生物素标记试剂盒和标记灯由军事医学科学院提供；透射电镜(JEM-1200-EX)由本院中心实验室提供。
二、实验步骤和方法
1.常规培养的HT-29、Lovo细胞经胰酶消化后，用PBS洗涤细胞，将细胞转移至无菌聚丙烯离心管中，分别给予5 Gy，10 Gy，15 Gy， 20 Gy，25 Gy剂量进行照射。对照组也以PBS洗涤细胞后，同时置于聚丙烯管中，但不经射线照射。经比色测定确定10 Gy为最适研究剂量。
2.按上述方法照射细胞后，取10 Gy照射组将细胞悬液离心，去除PBS，以1640完全培养液重悬细胞，将细胞按105/ml分别接种于3个50 cm2培养瓶内培养。于48 h常规用胰酶消化，第1瓶用于制作细胞涂片，进行p53MAb1801的IHC和p53 mRNA的ISH分析[3]。分别在×100和×800光镜下取标本四角及中间共5个视野，计数阳性和阴性细胞数，统计采用χ2检验。第2瓶用于制作超薄切片标本，透射电镜观察(×6000)。第3瓶细胞培养至HT-29细胞大部分脱落，Lovo细胞由梭形变为圆形，收集细胞提取DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察。阴性对照：未经照射的细胞，经培养48 h后收集细胞提取DNA进行电泳。阳性对照：取2只昆明小鼠(4周龄，本院动物中心提供)，无菌取下胸腺制成细胞悬液，1640培养液中加入终浓度为10-5mol/L的地塞米松培养6 h后收集细胞提取DNA进行电泳观察。
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结 果
一、X-射线诱导HT-29、Lovo细胞PCD HT-29、Lovo两种细胞经X-射线照射后48 h，电镜下两种细胞出现PCD早期改变：细胞染色质浓积于细胞核内某些部位，如核膜周围，形成前期凋亡小体。并可见少数形成核碎片，为质膜系统所包裹。有些细胞核出现空泡现象，胞浆肿胀，质膜系统增生肿胀，线粒体等细胞器增生(见图1)。X-射线处理48 h后，两种细胞皆出现不同程度的梯状电泳带，与阳性对照稍显弥散，不如阳性对照典型。而阴性对照则无此现象，电泳时仅发现高分子基因组DNA。
二、p53蛋白表达改变 阳性细胞为细胞核染成棕黄色。HT-29细胞经X-射线照射48 h后，其p53蛋白表达较对照组明显增强(P<0.05)。Lovo细胞则始终不能检出p53蛋白表达。
表1 X-射线照射后48 h HT-29细胞p53蛋白表达改变
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对照组
照射组
阳性数
126
155
阴性数
26
14
阳性率(%)
82.89
91.72
χ2=5.71，(P<0.05) 三、p53 mRNA转录改变 阳性细胞为胞质内致密的细小黑色以颗粒沉积(见图2)。两种细胞经X-射线处理后，p53 mRNA的表达水平有不同程度的较对照组增强(见表2)。
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图1 透射电镜下HT-29、Lovo细胞PCD改变(×6000)
A：HT-29细胞； B：Lovo细胞
图2 p53 mRNA表达：A：HT-29强阳性；B：Lovo阳性(ISH×800)
表2 X-射线照射后48h HT-29、Lovo细胞p53 mRNA转录
HT-29
Lovo
对照组
实验组
对照组
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实验组
阳性数
82
126
117
159
阴性数
15
8
31
23
阳性率(%)
84.54
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94.03
79.05
87.40
χ2
5.20
4.12
P值
<0.05
<0.05
讨 论
研究证明，p53基因的功能一方面主要是对MDM-2发挥调控作用，如果p53基因对MDM-2失控，则MDM-2表达过度，导致细胞发生癌变。另一方面，p53可刺激p21的合成，抑制细胞的分裂周期。亦即p53刺激p21，p21再抑制cdk4，进而抑制细胞生长[4～6]。近年来的研究发现，许多肿瘤治疗方式都可以诱导肿瘤细胞PCD，在此过程中p53基因起着十分重要的作用[7]。研究认为[1，2]，缺乏p53基因的胸腺细胞对射线不敏感，但却保留了对用糖皮质激素处理可致凋亡的正常反应。Stephens等[8]用不同剂量的γ射线照射小鼠卵巢癌细胞，凋亡的数量是未照射组的5～6倍，此时p53表达增强。Clarke和Lowe等[1，2，9]还证明，只含一个p53基因的杂合子小鼠胸腺细胞对辐射诱导的PCD的抵抗力大于含两个p53基因的纯合子小鼠细胞，而剔除了p53基因的小鼠对PCD的抵抗性最强。作者以X-射线照射HT-29、Lovo两种大肠肿瘤细胞，发现5 Gy剂量即可引起细胞一定程度的损伤，但给予10 Gy以上剂量时细胞生长抑制更明显(与对照组及5 Gy组相比，P<0.05)。并表现出PCD的特征，而15 Gy、20 Gy、25 Gy剂量之间没有明显的差别(存活细胞OD值之比P>0.05)。
, 百拇医药
作者进一步应用IHC和ISH检测了两种细胞经X-射线照射后(10 Gy) p53蛋白和mRNA表达情况。结果两种细胞中p53 mRNA表达的水平 较对照组增高(P<0.05),说明两种细胞在X-射线诱导的大肠肿瘤细胞PCD中伴有p53基因的转录改变。与此同时，HT-29细胞中p53蛋白表达明显增强(与对照组相比P<0.05)，而在Lovo细胞中则同样不能检测到p53蛋白的表达。由此说明，p53基因在两种细胞中参与作用的方式不尽相同。推测可能与两种细胞中含有不同类型p53基因有关。HT-29细胞含突变型p53(mt p53)，Lovo细胞中含野生型p53(wt p53)[4]。当细胞受到X-射线的刺激后，由于损伤或相应的多种刺激信号经过某种途径传向调节p53基因转录的系统，使其mRNA转录增强。由于HT-29中为mt p53，增强的mRNA包含mt p53 mRAN成分，进而表达出增强的p53蛋白，所以用IHC法可以检出。而在Lovo细胞，由于其中仅存在wt p53，经上述因素作用后，损伤信号传入调节p53基因的系统，使其转录增强。此增强的mRNA中也仅含wt p53，它们的表达可能导致wt p53蛋白的高表达，但由于wt p53蛋白半衰期短，作者应用IHC不能检出。p53高表达，使细胞阻滞后G1向S期的转化过程中，保证细胞有足够的时间进行自我修复。修复成功后细胞就向正常转化。如果修复失败，细胞就表现出PCD现象，最后致细胞死亡。可见，p53基因在X-射线诱导的大肠癌细胞PCD中起着十分重要的作用。
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季代金，男，硕士，主治医师。
参考文献
[1]Lowe SW, Schmitt EM, Smith SW, et al. p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes〔J〕. Nature, 1993,362:847
[2]Clarke AR, Purdie CA, Harrson DJ, et al. Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways〔J〕. Nature，1993,362:849
[3]季代金.原位杂交技术〔M〕.见：姜泊，张亚历，周殿元，主编.分子生物学常用实验方法.北京.人民军医出版社，1996：128
, 百拇医药
[4]Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis〔J〕. Cell,1990,61:759
[5]Kopnin B. Genetic events responsible for colorectal tumor genesis achievements and charllenges〔J〕. Tumor,1993,79:235
[6]Hamilton SR. The molecular genetics of colorectal neoplasia〔J〕.Gastroenterology,1993,105:3
[7]季代金，张亚历，姜泊，等.p53基因诱导程序化死亡与肿瘤治疗新战略〔J〕.癌症，1997，16：389
, 百拇医药 [8]Stephens LC, Aug KK, Schultherss TE, et al. Apoptosis in irradiated murine tumors〔J〕.Radiat Res,1991,127:308
[9]Clarke AR, Gledhill S, Hooper ML, et al. p53 dependence of early apoptotic and proliferative responses within the mouse intestinal epithelium gamma-irradiation〔J〕. Oncogen,1994,9:1767
(收稿日期：1999-07-29；修回日期：1999-10-11), http://www.100md.com
单位：季代金(解放军第452医院消化科 成都610061)；曹燕(成都市第十人民医院内科)
关键词：基因，p53；放射生物学；PCD；肿瘤细胞，培养的
肿瘤000616
摘要：目的 探讨大肠癌HT-29、Lovo细胞在X-射线诱导PCD过程中不同类型p53基因转录表达改变，为肿瘤的放射治疗方案提供新的理论线索。方法 选择几种临床常用X-射线放射治疗剂量诱导大肠癌细胞呈现PCD特征，应用免疫细胞化学和细胞原位杂交技术对含有不同类型p53基因的HT-29、Lovo两种大肠癌细胞p53蛋白表达和p53 mRNA转录进行对比分析。结果 两种细胞经X-射线照射后均表现出较为典型的细胞凋亡改变，两种细胞p53 mRNA转录均有所增强。HT-29细胞p53蛋白表达增强，Lovo细胞p53蛋白却始终不能检出。结论 p53基因确实参与了X-射线诱导大肠癌细胞的PCD过程。但是，突变型和野生型p53基因的转录表达改变不尽相同，提示不同类型p53基因发挥的作用不同。
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中图分类号：R73-36 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-440-03
VARIATION OF p53 GENE TRANSCRIPTION AND EXPRESSION IN COLO-RECTAL CARCINOMA CELL PCD INDUCED BY X-RAY
JI Dai-jin CAO Yan
Department of Gastroenterology, No.452 Hospital of PLA, Chengdu 610061,China
Abstract：Objective To investigate the variations of p53 gene transcription and expression in colo-rectal carcinoma HT-29 and Lovo cells lines during the programmed cell death (PCD) induced by X-ray and to search for the new clues for radiation treatment of carcinoma. Methods Several conventional doses of X-ray (5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy) were chosen in this study. After the PCD was induced by the doses, the comparative analysis were conducted in HT-29, Lovo cell lines that have different types of p53 genes by immunohistochemical and in situ hybridization. Results After X-ray irradiation the cells showed typical characteristics of PCD. Both the cells increased p53 mRNA transcriptions. p53 protein expression was increased in HT-29 but no p53 protein was found in Lovo. Conclusion The results show that p53 protein actually participated in the PCD induced by X-ray. In this process, however, the changes are different between the wild and mutant p53 genes. It suggests that different p53 genes play different roles in the process.
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Key words： Gene,p53； Radiobiology; PCD； Tumor cells,cultured
许多研究发现，治疗肿瘤的多种措施可能诱导肿瘤细胞产生程序化死亡(Programmed Cell Death, PCD)。各种DNA损伤因子对细胞的损伤作用亦可通过诱导细胞PCD而发挥作用。在此过程中，p53基因可与多种细胞生长因子、癌基因等相互调节参与诱导细胞PCD。文献报告[1，2]，X-射线介导的细胞毒作用可能与依赖p53基因的PCD有关。但该过程中p53基因mRNA和蛋白发生怎样的改变却知之甚少。为此，作者用X-射线诱导大肠癌细胞呈现PCD，应用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)和原位杂交(In situ Hybridization,ISH)技术对含有不同类型p53基因的HT-29、Lovo细胞中p53 mRNA和蛋白表达改变进行了比较研究，现报告如下。
材料和方法
, http://www.100md.com
一、细胞、主要试剂和仪器 HT-29、Lovo细胞为本实验室自存；X-射线直线加速器(Varian 2100C型)由本院放疗中心提供；MAb1801购自Santa Cruz公司；ABC试剂盒为Vector公司产品；p53质粒(pUC18-p53)为本实验室自存；光敏生物素标记试剂盒和标记灯由军事医学科学院提供；透射电镜(JEM-1200-EX)由本院中心实验室提供。
二、实验步骤和方法
1.常规培养的HT-29、Lovo细胞经胰酶消化后，用PBS洗涤细胞，将细胞转移至无菌聚丙烯离心管中，分别给予5 Gy，10 Gy，15 Gy， 20 Gy，25 Gy剂量进行照射。对照组也以PBS洗涤细胞后，同时置于聚丙烯管中，但不经射线照射。经比色测定确定10 Gy为最适研究剂量。
2.按上述方法照射细胞后，取10 Gy照射组将细胞悬液离心，去除PBS，以1640完全培养液重悬细胞，将细胞按105/ml分别接种于3个50 cm2培养瓶内培养。于48 h常规用胰酶消化，第1瓶用于制作细胞涂片，进行p53MAb1801的IHC和p53 mRNA的ISH分析[3]。分别在×100和×800光镜下取标本四角及中间共5个视野，计数阳性和阴性细胞数，统计采用χ2检验。第2瓶用于制作超薄切片标本，透射电镜观察(×6000)。第3瓶细胞培养至HT-29细胞大部分脱落，Lovo细胞由梭形变为圆形，收集细胞提取DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察。阴性对照：未经照射的细胞，经培养48 h后收集细胞提取DNA进行电泳。阳性对照：取2只昆明小鼠(4周龄，本院动物中心提供)，无菌取下胸腺制成细胞悬液，1640培养液中加入终浓度为10-5mol/L的地塞米松培养6 h后收集细胞提取DNA进行电泳观察。
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结 果
一、X-射线诱导HT-29、Lovo细胞PCD HT-29、Lovo两种细胞经X-射线照射后48 h，电镜下两种细胞出现PCD早期改变：细胞染色质浓积于细胞核内某些部位，如核膜周围，形成前期凋亡小体。并可见少数形成核碎片，为质膜系统所包裹。有些细胞核出现空泡现象，胞浆肿胀，质膜系统增生肿胀，线粒体等细胞器增生(见图1)。X-射线处理48 h后，两种细胞皆出现不同程度的梯状电泳带，与阳性对照稍显弥散，不如阳性对照典型。而阴性对照则无此现象，电泳时仅发现高分子基因组DNA。
二、p53蛋白表达改变 阳性细胞为细胞核染成棕黄色。HT-29细胞经X-射线照射48 h后，其p53蛋白表达较对照组明显增强(P<0.05)。Lovo细胞则始终不能检出p53蛋白表达。
表1 X-射线照射后48 h HT-29细胞p53蛋白表达改变
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对照组
照射组
阳性数
126
155
阴性数
26
14
阳性率(%)
82.89
91.72
χ2=5.71，(P<0.05) 三、p53 mRNA转录改变 阳性细胞为胞质内致密的细小黑色以颗粒沉积(见图2)。两种细胞经X-射线处理后，p53 mRNA的表达水平有不同程度的较对照组增强(见表2)。
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图1 透射电镜下HT-29、Lovo细胞PCD改变(×6000)
A：HT-29细胞； B：Lovo细胞
图2 p53 mRNA表达：A：HT-29强阳性；B：Lovo阳性(ISH×800)
表2 X-射线照射后48h HT-29、Lovo细胞p53 mRNA转录
HT-29
Lovo
对照组
实验组
对照组
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实验组
阳性数
82
126
117
159
阴性数
15
8
31
23
阳性率(%)
84.54
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94.03
79.05
87.40
χ2
5.20
4.12
P值
<0.05
<0.05
讨 论
研究证明，p53基因的功能一方面主要是对MDM-2发挥调控作用，如果p53基因对MDM-2失控，则MDM-2表达过度，导致细胞发生癌变。另一方面，p53可刺激p21的合成，抑制细胞的分裂周期。亦即p53刺激p21，p21再抑制cdk4，进而抑制细胞生长[4～6]。近年来的研究发现，许多肿瘤治疗方式都可以诱导肿瘤细胞PCD，在此过程中p53基因起着十分重要的作用[7]。研究认为[1，2]，缺乏p53基因的胸腺细胞对射线不敏感，但却保留了对用糖皮质激素处理可致凋亡的正常反应。Stephens等[8]用不同剂量的γ射线照射小鼠卵巢癌细胞，凋亡的数量是未照射组的5～6倍，此时p53表达增强。Clarke和Lowe等[1，2，9]还证明，只含一个p53基因的杂合子小鼠胸腺细胞对辐射诱导的PCD的抵抗力大于含两个p53基因的纯合子小鼠细胞，而剔除了p53基因的小鼠对PCD的抵抗性最强。作者以X-射线照射HT-29、Lovo两种大肠肿瘤细胞，发现5 Gy剂量即可引起细胞一定程度的损伤，但给予10 Gy以上剂量时细胞生长抑制更明显(与对照组及5 Gy组相比，P<0.05)。并表现出PCD的特征，而15 Gy、20 Gy、25 Gy剂量之间没有明显的差别(存活细胞OD值之比P>0.05)。
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作者进一步应用IHC和ISH检测了两种细胞经X-射线照射后(10 Gy) p53蛋白和mRNA表达情况。结果两种细胞中p53 mRNA表达的水平 较对照组增高(P<0.05),说明两种细胞在X-射线诱导的大肠肿瘤细胞PCD中伴有p53基因的转录改变。与此同时，HT-29细胞中p53蛋白表达明显增强(与对照组相比P<0.05)，而在Lovo细胞中则同样不能检测到p53蛋白的表达。由此说明，p53基因在两种细胞中参与作用的方式不尽相同。推测可能与两种细胞中含有不同类型p53基因有关。HT-29细胞含突变型p53(mt p53)，Lovo细胞中含野生型p53(wt p53)[4]。当细胞受到X-射线的刺激后，由于损伤或相应的多种刺激信号经过某种途径传向调节p53基因转录的系统，使其mRNA转录增强。由于HT-29中为mt p53，增强的mRNA包含mt p53 mRAN成分，进而表达出增强的p53蛋白，所以用IHC法可以检出。而在Lovo细胞，由于其中仅存在wt p53，经上述因素作用后，损伤信号传入调节p53基因的系统，使其转录增强。此增强的mRNA中也仅含wt p53，它们的表达可能导致wt p53蛋白的高表达，但由于wt p53蛋白半衰期短，作者应用IHC不能检出。p53高表达，使细胞阻滞后G1向S期的转化过程中，保证细胞有足够的时间进行自我修复。修复成功后细胞就向正常转化。如果修复失败，细胞就表现出PCD现象，最后致细胞死亡。可见，p53基因在X-射线诱导的大肠癌细胞PCD中起着十分重要的作用。
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参考文献
[1]Lowe SW, Schmitt EM, Smith SW, et al. p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes〔J〕. Nature, 1993,362:847
[2]Clarke AR, Purdie CA, Harrson DJ, et al. Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways〔J〕. Nature，1993,362:849
[3]季代金.原位杂交技术〔M〕.见：姜泊，张亚历，周殿元，主编.分子生物学常用实验方法.北京.人民军医出版社，1996：128
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[4]Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis〔J〕. Cell,1990,61:759
[5]Kopnin B. Genetic events responsible for colorectal tumor genesis achievements and charllenges〔J〕. Tumor,1993,79:235
[6]Hamilton SR. The molecular genetics of colorectal neoplasia〔J〕.Gastroenterology,1993,105:3
[7]季代金，张亚历，姜泊，等.p53基因诱导程序化死亡与肿瘤治疗新战略〔J〕.癌症，1997，16：389
, 百拇医药 [8]Stephens LC, Aug KK, Schultherss TE, et al. Apoptosis in irradiated murine tumors〔J〕.Radiat Res,1991,127:308
[9]Clarke AR, Gledhill S, Hooper ML, et al. p53 dependence of early apoptotic and proliferative responses within the mouse intestinal epithelium gamma-irradiation〔J〕. Oncogen,1994,9:1767
(收稿日期：1999-07-29；修回日期：1999-10-11), http://www.100md.com