成骨性肿瘤中p27基因mRNA与蛋白的表达及其意义
作者：文彬 丘钜世 李扬
单位：文彬(中山医科大学国内访问学者，现在四川省川北医学院病理教研室)；丘钜世(中山医科大学病理教研室 广州市 510080)；李扬(中山医科大学病理教研室 广州市 510080)
关键词：成骨性肿瘤p27mRNA蛋白表达
摘要
摘要：目的：探讨p27mRNA与蛋白在成骨性肿瘤中的表达状况，了解其与肿瘤组织学类型、分化程度及生物学行为的关系。方法：采用免疫组化和非放射性核酸原位杂交技术检测成骨性肿瘤中p27蛋白和mRNA的表达状况。结果：骨瘤、骨母细胞瘤中p27蛋白高表达，主要定位于胞核(85.7%、75%)，骨肉瘤中低表达，胞核表达极低(4.7%)，两者间差异显著(P<0.01)。p27蛋白在骨肉瘤中的表达与肿瘤的浸润、复发和转移有关。原位杂交显示良、恶性成骨性肿瘤的p27mRNA表达阳性率及表达强度无显著性差异(P>0.05)。且与骨肉瘤的组织学类型、分级及生物学行为无关。结论：p27蛋白表达在成骨性肿瘤中的改变具有特异性，可作为骨肉瘤的诊断和评估预后的指标。骨肉瘤中p27蛋白表达低下可能是由于转录后特异性的蛋白酶介导的降解所致。
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Significance of p27mRNA and Protein Expression in Osteoplastic Tumors
Wen Bin Qin Jushi Li Yang
(Department of Pathology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou)
Abstract Objective:To evaluate the significance of p27mRNA and protein expression in various kinds of osteoplastic tumors.Methods:Immunohistochemistry and nonradioactive in situ hybridization methods were used to detect the expression of p27mRNA and protein in 58 cases of osteoplastic tumors.Results:The positive rate of p27 protein was 100% in osteoma,87.5% in osteoblastoma,62.8% in osteosarcoma.In addition,the nuclear staining of p27 was noted 85.7% (6/7) in osteoma,75% (6/8) in osteoblastoma,but only 4.7% (2/43) in osteosarcoma.The results showed a statistical significance between benign tumors and osteosarcoma (P<0.01).The expression of p27 protein in osteosarcoma was significantly correlated with the invasivenes,relapse and metastasis of tumor.In situ hybridization,it revealed that there was no difference of expression levels of p27 mRNA between benign tumors and osteosarcoma and there was no statistical significance between p27 mRNA expression and its histological types,differentiation,degree and biological behavior of osteosarcoma.Conclusion:p27 protein has practical value in diagnosis of osteosarcoma,and it mayserves as a new biological indicator to predict the prognosis of the patient with osteosarcoma.Loss of p27 protein of osteosarcoma may be resulted from a posttranscriptional specific proteosorne-mediated degradation.
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Key Words Osteoplastic tumor p27 mRNA Protein expression
近年来研究发现，p27基因及其表达水平在肿瘤增殖和分化的调控中起着重要作用，如p27基因敲除的小鼠垂体肿瘤的发生率明显增高[1]，在某些类型的肿瘤中存在着p27的基因突变[2]。p27蛋白水平下降或缺乏与上皮和淋巴组织起源的许多肿瘤的侵袭行为及不良预后有关。但p27基因mRNA及蛋白产物在人成骨性肿瘤中的表达国内外尚未见报道。我们采用免疫组织化学及原位杂交方法检测p27蛋白及mRNA在成骨性肿瘤中的表达状况，以了解其与肿瘤组织学类型、分化程度及生物学行为的关系，以期找出判断骨肉瘤分化程度及患者预后有价值的指标。
1 材料与方法
收集中山医科大学病理教研室1993～1998年间存档的成骨性肿瘤石蜡包埋标本，其中骨瘤7例，骨母细胞瘤8例，骨肉瘤43例：其中男性25例，女性18例，患者年龄7～43岁，肿瘤确诊并治疗后9个月～4+年，8例出现肿瘤复发，3例有远处转移。肿瘤的组织学类型：骨母细胞型14例，纤维母细胞型8例，软骨母细胞型9例，血管扩张型8例，混合型3例，皮质旁骨肉瘤1例。肿瘤分化程度：Ⅰ级17例，Ⅱ级22例，Ⅲ级4例。
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1.1 免疫组化染色
1.1.1试剂鼠抗人p27蛋白单克隆抗体(Neo-marker公司产品)及Elivision二步法免疫组化染色试剂盒购自迈新公司。
1.1.2染色流程5μm切片脱蜡水化→微波处理15分钟→试剂A酶阻断10分钟→试剂B血清封闭10分钟→一抗(1:80)4℃孵育过夜→试剂C孵育30分钟→DAB显色、水洗→苏木素复染、封片。用已知的p27表达阳性的乳腺浸润性导管作阳性对照，用PBS液替代一抗作阴性对照。
1.1.3染色结果判断观察染色切片中10个具有代表性的高倍视野，瘤细胞染色阳性为胞核或胞浆呈棕黄色。无阳性瘤细胞为(-)。
1.2 原位杂交
1.2.1探针制备参照Long等[3]报道由中科院上海生物工程研究中心合成寡核苷酸探针，探针序列为：GGCGGCTCCCGCTGACATCCTGGCTCTCCT共30bp，解链温度72℃。
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1.2.2试剂蛋白酶K购自Merck公司，DEPC购自Serva公司，去离子甲酰胺和tRNA购自Sigma公司，地高辛加尾试剂盒和地高辛标记检测试剂盒均购自BoehringerManheim公司。其他常规试剂均为国产分析纯产品。
1.2.3探针的标记、检测和原位杂交反应采用DIG标记寡核苷酸探针—3′端加尾法标记探针，标记探针的滴度检测及原位杂交步骤按试剂盒所附说明进行。地高辛标记探针滴度为5ng/μl。
1.2.4原位杂交结果判断标准每次试验均设有杂交液内不加探针和杂交前切片用500μg/mlRNA酶37℃消化2小时，作阴性对照，RNA酶消化后仍有阳性信号，说明是非特异性结合。原位杂交结果判定参照文献[4]进行。
1.3图像分析仪处理实验结果
采用德国Kontron公司的IBS2.5真彩图像分析仪对免疫组化和原位杂交结果进行定量测定。测定阳性产物的灰度来反应免疫组化表达强度(仪器的灰度分为0～255级，0级黑，最大灰度级Gamx为白，故灰度数值与阳性产物染色强度呈反比关系)。以原位杂交阳性单位(PositiveUnit，PU)作为量化指标。
, 百拇医药
Gα为阳性产物的灰度，GA为监视视野A区域的灰度，AAα为阳性产物在A区域中的面积密度。PU值越大，阳性产物染色强度越强，呈正比关系。
1.4 统计学处理
计数资料两组间比较用Fisher直接机率法和χ2检验，计量资料两组间比较用t检验或矫正t检验，多组间比较用方差分析。
2 结果
2.1 免疫组化检测结果
p27蛋白在骨瘤、骨母细胞瘤及骨肉瘤中的表达状况见表1及图1～3。
表1 p27蛋白在良、恶性成骨性肿瘤中的表达
, 百拇医药 类型
例数
阳性数(%)
表达强度(灰度)
骨瘤
7
7(100)
64.68±7.97
骨母细胞瘤
8
7(87.5)
84.34±2.32
骨肉瘤
, 百拇医药
43
27(62.8)
122.42±3.87
良性肿瘤与骨肉瘤间Fisher直接机率法比较P=0.022
各组间蛋白表达强度(灰度)的t检验P均<0.01
图1 骨母细胞瘤，增生的骨母细胞核、浆p27蛋白阳性×200
, 百拇医药
图2 骨母细胞型骨肉瘤，瘤细胞胞浆p27蛋白阳性，核阴性×400
图3 骨肉瘤侵犯软组织，横纹肌细胞p27蛋白阳性，瘤细胞阴性×400
p27蛋白表达可见于细胞核，亦可见于胞浆，在15例良性成骨性肿瘤中，核阳性者13例(86.7%)，而骨肉瘤核阳性率极低(仅2例，4.7%)，两者间差异显著(P<0.01)，从表达强度看，良性明显高于骨肉瘤(P<0.01)。
不同组织学类型及病理分级的骨肉瘤p27蛋白表达无显著性差异(P均>0.05),且瘤体大、小及病程长、短与p27蛋白表达无关(P均>0.05),但11例有肿瘤复发、转移者p27蛋白表达明显低于无肿瘤复发及转移者(P=0.038)，Ⅲ级骨肉瘤p27阳性率仅25%(1/4)，明显低于Ⅰ、Ⅱ级者，此外，软组织有浸润的3例骨肉瘤均无p27蛋白表达。
, 百拇医药
2.2 原位杂交检测结果
原位杂交信号呈蓝色或紫蓝色,定位于细胞核，少量位于胞浆，其结果见表2及图4～6。
表2 p27mRNA在良、恶性成骨性肿瘤中的表达
类型
例数
阳性数(%)
表达强度(PU值)
骨瘤
5
4(80.0)
30.93±1.85
, 百拇医药
骨母细胞瘤
6
4(66.7)
32.49±1.36
骨肉瘤
33
22(66.7)
31.64±4.54
各组间阳性数Fisher直接机率法P>0.05,各组间PU值检验P>0.05
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图4 骨母细胞瘤，瘤细胞核内p27mRNA阳性ISH×200
图5 骨母细胞型骨肉瘤，大部分瘤细胞核内p27mRNA阳性，箭头所示为瘤细胞浆p27mRNA阳性ISH×200
图6 低分化骨肉瘤，瘤细胞核p27mRNA阳性ISH×200
从表2可知良性成骨性肿瘤与骨肉瘤之间p27mRNA表达率及表达强度均无显著差异(P>0.05)。
, 百拇医药
不同组织学类型、病理分级的骨肉瘤以及肿瘤有无复发、转移之间p27mRNA的表达均无显著差异(P值均>0.05)。
此外，对33例骨肉瘤p27mRNA与蛋白表达结果行Sprearman等级相关分析，求正后r′s=0.668,P<0.01,说明p27mRNA与p27蛋白表达之间存在正相关关系。但其中3例表达mRNA而蛋白无表达,2例mRNA高表达者蛋白低表达，另有2例有p27蛋白表达而无mRNA表达。
3 讨论
p27是新近发现的CDKIs(Cyclin-dependent Kinase Inhibitors)家族成员之一[5],在正常细胞和肿瘤细胞从G1期到S期的转化调节中起重要作用。近年来研究表明p27基因突变在大多数肿瘤中是少见的[6],p27mRNA表达仅在40%的胃癌中有下降[7]。越来越多的研究表明p27在肿瘤细胞中的改变主要表现为瘤细胞的p27蛋白量远远低于正常细胞水平，且与肿瘤分化程度、生物学行为、分期及预后密切相关[7～10]。本研究结果表明，骨肉瘤中p27蛋白表达率及表达强度明显低于良性成骨性肿瘤，两者有显著差异，Ⅲ级骨肉瘤p27蛋白阳性率明显低于Ⅰ、Ⅱ级骨肉瘤。骨肉瘤的生物学行为与p27蛋白表达关系密切，11例有肿瘤复发和转移者(P=0.038)，另3例有软组织浸润者无p27蛋白表达。尤其值得注意的是，p27蛋白在良、恶性成骨性肿瘤中的定位明显不同，15例良性者p27蛋白核阳性13例(86.7%)，而43例骨肉瘤中p27蛋白核阳性者仅2例(4.7%)，两组间差异非常显著(P<0.01)。有学者报道，食管腺癌中50%的浸润性癌p27蛋白只定位于胞浆，其患者预后不良[8]。George等[10]对同时性转移的结肠腺癌的研究发现7例原发癌和转移癌的p27蛋白只是位于胞浆中。上述结果表明，p27蛋白胞核定位对其在细胞周期中生长抑制功能是必须的，这可能是因为在胞核内p27蛋白才能与CyclinE-CDK2、CyclinD-CDK4及CyclinA-CDK2等复合物结合，从而抑制他们的活性，使细胞周期停止于G1期而停止细胞增殖。p27蛋白缺乏还可导致细胞间粘附力下降，使肿瘤容易转移[11]。在骨肉瘤中p27蛋白低表达尤其是胞核p27蛋白缺乏可能与其分化差、细胞增殖迅速、浸润生长、易于发生肿瘤复发、转移有关。p27蛋白的检测可作为判断骨肉瘤患者预后的一项新指标。本组原位杂交结果表明，良、恶性成骨性肿瘤细胞中p27mRNA水平无显著差异(P>0.05),且其表达率及表达强度与肿瘤的组织学类型、病理分级及生物学行为无关。由于mRNA的前体是在胞核内合成，经进一步加工合成完整的mRNA再转运到胞浆进行蛋白质合成，因此原位杂交信号可位于胞核与胞浆内[12]，本组显示p27mRNA杂交信号主要位于胞核，胞浆很少，本组结果mRNA主要位于胞核，可能是由于石蜡切片中胞浆内的mRNA较细胞核内者更易降解的缘故。
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本组结果还表明，骨肉瘤中p27mRNA与p27蛋白表达之间不完全吻合，3例p27mRNA表达者无p27蛋白表达，2例mRNA高表达者p27蛋白低表达，进一步证实细胞内p27蛋白水平主要是转录后调节，肿瘤中p27蛋白低表达可能是由于转录后特异性蛋白酶介导的降解所致。
(李梦兰 校对)
本文课题受美国中华医学基金会(CMB)资助(编号：93～594)
参考文献
1，Nakayama K,Ishida N,Shirane M,et al.Mice lacking p27kip1 display increased body size,multiple organ hyperplasia,and pituitary tumors.Cell,1996;85:707
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2，Sheer CJ.Cancer cell cycles.Science,1996;274:1672
3，Long Jin,Xiang Qian,Elzbieta K,et al.Transforming growth factor-β,Transforming growth factor-β receptor Ⅱ,and p27kip1 expreesion in nontumorous and neoplastic human pituitaries.American J Pathol,1997;151:509
4，苏长青,乐美兆,Klein-Szanto AT,等.胃癌细胞角蛋白mRNA和Ⅰ型胶原mRNA的原位杂交及杂交电镜观察.临床与实验病理学杂志，1995；11：181
5，Polyak K,Lee MH,Erdjument-Bromange H,et al.Clining of p27kip1,a cyclin-dependentKinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals.Cell,1994;78:59
, 百拇医药
6，Kawamata N,Morosetti R,Miller CW,et al.Molecular analysis of the cyclin-dependent kinase inhibitor gene p27kip1 in human maligancies.Cancer Res,1995;55:2266
7，Wataru Y,Tasusei K,Shuho S,et al.Reduced expression of cyclin-dependent kinase inhibitor p27kip1 is associated with advanced stage and invasiveness of gastric carcinoma.Jpn J Cancer Res,1997;88:625
8，Singh SP,Lipman J,Goldman H,et al.Losss or altered subcellular localization of p27 in Barret's associated adenocarcinoma.Cancer Res,1998;58:1730
, 百拇医药
9，Ronald MY,John N,Michael M,et al.Low p27 expression predicts poor disease-free survival in patients with prostate cancer.J Urol,1998;159:941
10，George VT,Kinga S,Michael M,et al.Down-regulation of p27 is associated with development of colorectal adenocarcinoma metastasis.American J Pathol,1998;153:681
11，Fero M,Rivkin M,Tasch M,et al.A syndrome of multi-organ hyperplasia with features of gigantism tumorigenesis and female sterility in p27kip1 deficient mice.Cell,1996;85:733
12，Pringle JH,Promose L,Kincl CL,et al.In situ hybridization adenonstration of poly-adenylated RNA sequences in formalin-fixed paraffin sections using a biotinylated oligonucleotide poly d(T) probe.J Pathol,1989;158:276
1999-08-06收稿
2000-03-10修回, http://www.100md.com
单位：文彬(中山医科大学国内访问学者，现在四川省川北医学院病理教研室)；丘钜世(中山医科大学病理教研室 广州市 510080)；李扬(中山医科大学病理教研室 广州市 510080)
关键词：成骨性肿瘤p27mRNA蛋白表达
摘要
摘要：目的：探讨p27mRNA与蛋白在成骨性肿瘤中的表达状况，了解其与肿瘤组织学类型、分化程度及生物学行为的关系。方法：采用免疫组化和非放射性核酸原位杂交技术检测成骨性肿瘤中p27蛋白和mRNA的表达状况。结果：骨瘤、骨母细胞瘤中p27蛋白高表达，主要定位于胞核(85.7%、75%)，骨肉瘤中低表达，胞核表达极低(4.7%)，两者间差异显著(P<0.01)。p27蛋白在骨肉瘤中的表达与肿瘤的浸润、复发和转移有关。原位杂交显示良、恶性成骨性肿瘤的p27mRNA表达阳性率及表达强度无显著性差异(P>0.05)。且与骨肉瘤的组织学类型、分级及生物学行为无关。结论：p27蛋白表达在成骨性肿瘤中的改变具有特异性，可作为骨肉瘤的诊断和评估预后的指标。骨肉瘤中p27蛋白表达低下可能是由于转录后特异性的蛋白酶介导的降解所致。
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Significance of p27mRNA and Protein Expression in Osteoplastic Tumors
Wen Bin Qin Jushi Li Yang
(Department of Pathology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou)
Abstract Objective:To evaluate the significance of p27mRNA and protein expression in various kinds of osteoplastic tumors.Methods:Immunohistochemistry and nonradioactive in situ hybridization methods were used to detect the expression of p27mRNA and protein in 58 cases of osteoplastic tumors.Results:The positive rate of p27 protein was 100% in osteoma,87.5% in osteoblastoma,62.8% in osteosarcoma.In addition,the nuclear staining of p27 was noted 85.7% (6/7) in osteoma,75% (6/8) in osteoblastoma,but only 4.7% (2/43) in osteosarcoma.The results showed a statistical significance between benign tumors and osteosarcoma (P<0.01).The expression of p27 protein in osteosarcoma was significantly correlated with the invasivenes,relapse and metastasis of tumor.In situ hybridization,it revealed that there was no difference of expression levels of p27 mRNA between benign tumors and osteosarcoma and there was no statistical significance between p27 mRNA expression and its histological types,differentiation,degree and biological behavior of osteosarcoma.Conclusion:p27 protein has practical value in diagnosis of osteosarcoma,and it mayserves as a new biological indicator to predict the prognosis of the patient with osteosarcoma.Loss of p27 protein of osteosarcoma may be resulted from a posttranscriptional specific proteosorne-mediated degradation.
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Key Words Osteoplastic tumor p27 mRNA Protein expression
近年来研究发现，p27基因及其表达水平在肿瘤增殖和分化的调控中起着重要作用，如p27基因敲除的小鼠垂体肿瘤的发生率明显增高[1]，在某些类型的肿瘤中存在着p27的基因突变[2]。p27蛋白水平下降或缺乏与上皮和淋巴组织起源的许多肿瘤的侵袭行为及不良预后有关。但p27基因mRNA及蛋白产物在人成骨性肿瘤中的表达国内外尚未见报道。我们采用免疫组织化学及原位杂交方法检测p27蛋白及mRNA在成骨性肿瘤中的表达状况，以了解其与肿瘤组织学类型、分化程度及生物学行为的关系，以期找出判断骨肉瘤分化程度及患者预后有价值的指标。
1 材料与方法
收集中山医科大学病理教研室1993～1998年间存档的成骨性肿瘤石蜡包埋标本，其中骨瘤7例，骨母细胞瘤8例，骨肉瘤43例：其中男性25例，女性18例，患者年龄7～43岁，肿瘤确诊并治疗后9个月～4+年，8例出现肿瘤复发，3例有远处转移。肿瘤的组织学类型：骨母细胞型14例，纤维母细胞型8例，软骨母细胞型9例，血管扩张型8例，混合型3例，皮质旁骨肉瘤1例。肿瘤分化程度：Ⅰ级17例，Ⅱ级22例，Ⅲ级4例。
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1.1 免疫组化染色
1.1.1试剂鼠抗人p27蛋白单克隆抗体(Neo-marker公司产品)及Elivision二步法免疫组化染色试剂盒购自迈新公司。
1.1.2染色流程5μm切片脱蜡水化→微波处理15分钟→试剂A酶阻断10分钟→试剂B血清封闭10分钟→一抗(1:80)4℃孵育过夜→试剂C孵育30分钟→DAB显色、水洗→苏木素复染、封片。用已知的p27表达阳性的乳腺浸润性导管作阳性对照，用PBS液替代一抗作阴性对照。
1.1.3染色结果判断观察染色切片中10个具有代表性的高倍视野，瘤细胞染色阳性为胞核或胞浆呈棕黄色。无阳性瘤细胞为(-)。
1.2 原位杂交
1.2.1探针制备参照Long等[3]报道由中科院上海生物工程研究中心合成寡核苷酸探针，探针序列为：GGCGGCTCCCGCTGACATCCTGGCTCTCCT共30bp，解链温度72℃。
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1.2.2试剂蛋白酶K购自Merck公司，DEPC购自Serva公司，去离子甲酰胺和tRNA购自Sigma公司，地高辛加尾试剂盒和地高辛标记检测试剂盒均购自BoehringerManheim公司。其他常规试剂均为国产分析纯产品。
1.2.3探针的标记、检测和原位杂交反应采用DIG标记寡核苷酸探针—3′端加尾法标记探针，标记探针的滴度检测及原位杂交步骤按试剂盒所附说明进行。地高辛标记探针滴度为5ng/μl。
1.2.4原位杂交结果判断标准每次试验均设有杂交液内不加探针和杂交前切片用500μg/mlRNA酶37℃消化2小时，作阴性对照，RNA酶消化后仍有阳性信号，说明是非特异性结合。原位杂交结果判定参照文献[4]进行。
1.3图像分析仪处理实验结果
采用德国Kontron公司的IBS2.5真彩图像分析仪对免疫组化和原位杂交结果进行定量测定。测定阳性产物的灰度来反应免疫组化表达强度(仪器的灰度分为0～255级，0级黑，最大灰度级Gamx为白，故灰度数值与阳性产物染色强度呈反比关系)。以原位杂交阳性单位(PositiveUnit，PU)作为量化指标。
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Gα为阳性产物的灰度，GA为监视视野A区域的灰度，AAα为阳性产物在A区域中的面积密度。PU值越大，阳性产物染色强度越强，呈正比关系。
1.4 统计学处理
计数资料两组间比较用Fisher直接机率法和χ2检验，计量资料两组间比较用t检验或矫正t检验，多组间比较用方差分析。
2 结果
2.1 免疫组化检测结果
p27蛋白在骨瘤、骨母细胞瘤及骨肉瘤中的表达状况见表1及图1～3。
表1 p27蛋白在良、恶性成骨性肿瘤中的表达
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例数
阳性数(%)
表达强度(灰度)
骨瘤
7
7(100)
64.68±7.97
骨母细胞瘤
8
7(87.5)
84.34±2.32
骨肉瘤
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43
27(62.8)
122.42±3.87
良性肿瘤与骨肉瘤间Fisher直接机率法比较P=0.022
各组间蛋白表达强度(灰度)的t检验P均<0.01
图1 骨母细胞瘤，增生的骨母细胞核、浆p27蛋白阳性×200
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图2 骨母细胞型骨肉瘤，瘤细胞胞浆p27蛋白阳性，核阴性×400
图3 骨肉瘤侵犯软组织，横纹肌细胞p27蛋白阳性，瘤细胞阴性×400
p27蛋白表达可见于细胞核，亦可见于胞浆，在15例良性成骨性肿瘤中，核阳性者13例(86.7%)，而骨肉瘤核阳性率极低(仅2例，4.7%)，两者间差异显著(P<0.01)，从表达强度看，良性明显高于骨肉瘤(P<0.01)。
不同组织学类型及病理分级的骨肉瘤p27蛋白表达无显著性差异(P均>0.05),且瘤体大、小及病程长、短与p27蛋白表达无关(P均>0.05),但11例有肿瘤复发、转移者p27蛋白表达明显低于无肿瘤复发及转移者(P=0.038)，Ⅲ级骨肉瘤p27阳性率仅25%(1/4)，明显低于Ⅰ、Ⅱ级者，此外，软组织有浸润的3例骨肉瘤均无p27蛋白表达。
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2.2 原位杂交检测结果
原位杂交信号呈蓝色或紫蓝色,定位于细胞核，少量位于胞浆，其结果见表2及图4～6。
表2 p27mRNA在良、恶性成骨性肿瘤中的表达
类型
例数
阳性数(%)
表达强度(PU值)
骨瘤
5
4(80.0)
30.93±1.85
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骨母细胞瘤
6
4(66.7)
32.49±1.36
骨肉瘤
33
22(66.7)
31.64±4.54
各组间阳性数Fisher直接机率法P>0.05,各组间PU值检验P>0.05
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图4 骨母细胞瘤，瘤细胞核内p27mRNA阳性ISH×200
图5 骨母细胞型骨肉瘤，大部分瘤细胞核内p27mRNA阳性，箭头所示为瘤细胞浆p27mRNA阳性ISH×200
图6 低分化骨肉瘤，瘤细胞核p27mRNA阳性ISH×200
从表2可知良性成骨性肿瘤与骨肉瘤之间p27mRNA表达率及表达强度均无显著差异(P>0.05)。
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不同组织学类型、病理分级的骨肉瘤以及肿瘤有无复发、转移之间p27mRNA的表达均无显著差异(P值均>0.05)。
此外，对33例骨肉瘤p27mRNA与蛋白表达结果行Sprearman等级相关分析，求正后r′s=0.668,P<0.01,说明p27mRNA与p27蛋白表达之间存在正相关关系。但其中3例表达mRNA而蛋白无表达,2例mRNA高表达者蛋白低表达，另有2例有p27蛋白表达而无mRNA表达。
3 讨论
p27是新近发现的CDKIs(Cyclin-dependent Kinase Inhibitors)家族成员之一[5],在正常细胞和肿瘤细胞从G1期到S期的转化调节中起重要作用。近年来研究表明p27基因突变在大多数肿瘤中是少见的[6],p27mRNA表达仅在40%的胃癌中有下降[7]。越来越多的研究表明p27在肿瘤细胞中的改变主要表现为瘤细胞的p27蛋白量远远低于正常细胞水平，且与肿瘤分化程度、生物学行为、分期及预后密切相关[7～10]。本研究结果表明，骨肉瘤中p27蛋白表达率及表达强度明显低于良性成骨性肿瘤，两者有显著差异，Ⅲ级骨肉瘤p27蛋白阳性率明显低于Ⅰ、Ⅱ级骨肉瘤。骨肉瘤的生物学行为与p27蛋白表达关系密切，11例有肿瘤复发和转移者(P=0.038)，另3例有软组织浸润者无p27蛋白表达。尤其值得注意的是，p27蛋白在良、恶性成骨性肿瘤中的定位明显不同，15例良性者p27蛋白核阳性13例(86.7%)，而43例骨肉瘤中p27蛋白核阳性者仅2例(4.7%)，两组间差异非常显著(P<0.01)。有学者报道，食管腺癌中50%的浸润性癌p27蛋白只定位于胞浆，其患者预后不良[8]。George等[10]对同时性转移的结肠腺癌的研究发现7例原发癌和转移癌的p27蛋白只是位于胞浆中。上述结果表明，p27蛋白胞核定位对其在细胞周期中生长抑制功能是必须的，这可能是因为在胞核内p27蛋白才能与CyclinE-CDK2、CyclinD-CDK4及CyclinA-CDK2等复合物结合，从而抑制他们的活性，使细胞周期停止于G1期而停止细胞增殖。p27蛋白缺乏还可导致细胞间粘附力下降，使肿瘤容易转移[11]。在骨肉瘤中p27蛋白低表达尤其是胞核p27蛋白缺乏可能与其分化差、细胞增殖迅速、浸润生长、易于发生肿瘤复发、转移有关。p27蛋白的检测可作为判断骨肉瘤患者预后的一项新指标。本组原位杂交结果表明，良、恶性成骨性肿瘤细胞中p27mRNA水平无显著差异(P>0.05),且其表达率及表达强度与肿瘤的组织学类型、病理分级及生物学行为无关。由于mRNA的前体是在胞核内合成，经进一步加工合成完整的mRNA再转运到胞浆进行蛋白质合成，因此原位杂交信号可位于胞核与胞浆内[12]，本组显示p27mRNA杂交信号主要位于胞核，胞浆很少，本组结果mRNA主要位于胞核，可能是由于石蜡切片中胞浆内的mRNA较细胞核内者更易降解的缘故。
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本组结果还表明，骨肉瘤中p27mRNA与p27蛋白表达之间不完全吻合，3例p27mRNA表达者无p27蛋白表达，2例mRNA高表达者p27蛋白低表达，进一步证实细胞内p27蛋白水平主要是转录后调节，肿瘤中p27蛋白低表达可能是由于转录后特异性蛋白酶介导的降解所致。
(李梦兰 校对)
本文课题受美国中华医学基金会(CMB)资助(编号：93～594)
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1999-08-06收稿
2000-03-10修回, http://www.100md.com