缺氧诱导人肺癌细胞株表达血管内皮生长因子
作者：江晓丰 董强刚 冯久贤 包国良 沙慧芳 王恩忠
单位：江晓丰 董强刚 冯久贤 包国良 沙慧芳 王恩忠(上海胸部肿瘤研究所，上海市胸科医院 上海 200030)
关键词：血管内皮生长因子；缺氧；肿瘤细胞，培养的；RT-PCR；免疫组化
肿瘤000610
摘要：目的 检测缺氧对人肺癌细胞株表达VEGF的影响及其机制。方法 4株人肺癌细胞在低氧环境下处理18 h后，运用半定量RT-CPR及免疫组化技术分别检测VEGF mRNA及蛋白的表达。结果 低氧处理后人肺癌细胞VEGF mRNA明显高于未处理之肺癌细胞并在免疫组化上得到了进一步证实。结论 低氧可上调人肺癌细胞表达VEGF。
中图分类号：R73-35 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0423-02
, 百拇医药
HYPOXIA AND THE REGULATION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR IN HUMAN LUNG CANCER CELL LINES
JIANG Xiao-feng DONG Qiang-gang FENG Jiu-xian
Shanghai Thoracic Tumor Institute, Shanghai Chest Hosptial 200030, China
Abstract：Objective To investigate the influence hypoxia on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and its mechanism.Methods The expression of VEGF mRNA and protein in four hypoxia-treated human lung cancer cell lines (A549,A1,A7,A8) were tested determined by using semiquantitative reverse transcription PCR (RT-PCR) and immunohistochemcal staining. Results Semiquantitative RT-PCR demonstrated that the amount of VEGF mRNA in cells treated by hypoxia increased markedly when compared with that of control lines and the above results was confirmed by immunohistochemical staining. Besides, 3 VEGF isoforms(VEGF 121,165 and 189) could also be detected by semiquantitative RT-PCR.Conclusion These data that VEGF expression may be up-regulated by hypoxia.
, 百拇医药
Key words： VEGF； Hypoxia； Tumou cells,cultured; RT-PCR； Immunohistochemistry
在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞增生迅速，造成肿瘤微环境始终处于相对缺氧状态。研究表明，缺氧可触发机体产生一系列应激性保护反应，使得肿瘤细胞在缺氧状态下免受损伤或死亡。其中肿瘤细胞通过分泌一系列细胞因子来调节微血管生成，使肿瘤在缺氧状态下免受损伤或死亡，并得以进一步增殖。已经发现当肿瘤组织到达2 mm时，就必需从周围血获得营养和气体交换才能进一步增长[1]。
血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管生成的主要调节因子，其通过作用于血管内皮细胞上的氨酸激酶受体kdr或flt-1而使血管内皮细胞增殖，迁移最后形成新生血管[2]。
应用免疫组化及原位PCR等技术，人们发现在许多实体肿瘤包括脑胶质，肺癌等肿瘤坏死周围的缺氧区域，高水平地表达VEGF并伴随着高水平的微血管密度，提示缺氧可诱导VEGF表达从而刺激血管生成[3，4]。本实验将4株人肺癌细胞株细胞置于缺氧环境中模拟体内缺氧条件，观察缺氧对人肺癌细胞表达VEGF的影响。
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材料与方法
一、细胞株及底氧处理 人肺癌细胞株A549，A1，A7，A8细胞(A549购于上海细胞生物学研究所，A1，A7，A8由本室建立[5])，复苏后以10% FCS-RPMI1640培养，待细胞长满瓶底后，按以下步骤进行底氧处理：以橡皮塞密封培养瓶口，插入7#针头作为排气孔，然后充N2(0.5 kg/cm2)持续5 min，使培养瓶内达到相对缺氧状态，置培养箱内18 h，收获细胞，制作细胞涂片作免疫组化检测，并留取细胞作半定量RT-PCR分析。
二、免疫组化 细胞涂片以3 %多聚甲醛固定后，加抗VEGF抗体(1∶50稀释，购于Santa Cruz公司)。4℃过夜采用ABC方法染色，实验同时设未作底氧处理的细胞对照。
三、半定量RT-PCR 肺癌细胞株(包括低氧及低氧处理)5×106细胞异硫氢胍一步法提取总RNA。1 μg总RNA进20 μl逆转录体系，各取4 μl逆转录产物DNA分别进入25 μl VEGF PRC和β-actin PCR反应体系中，所用序列为：VEGF sense 5-CACATAGGAAAGATGAGCTTC，anti-sense 5′-GGCTTGTCACAT；β-actin sense 5′-CTCGCGCTACTCTCTCTCTTTTCTGG；Anti-sense 5′-GCTTACATGTCTCGATCCCACTTTAA。反应产物经2.5 %凝胶电泳以VDS图像处理系统进行IOD值分析。
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结 果
一、人肺癌细胞株低氧处理后VEGF mRNA的表达 运用半定量RT-PCR技术，观察了人肺癌细胞株经低氧处理18 h后，其VEGF mRNA的表达，结果如附表所示，在本实验条件下，以VEGF mRNA IOD/β-actin mRNA IOD比值作为衡量VEGF mRNA的表达水平，人肺癌细胞株A1，A549，A7，A8的VEGF mRNA表达明显高于正常条件下相应细胞VEGF的mRNA表达，最高达13倍之多。同时，半定量RT-PCR电泳显示低氧处理后，上述4个细胞株分别有100 bp，230 bp和300 bp VEGF 3种异物体的表达(见附图)。
附图 半定量RT-PCR分析人肺癌细胞株低氧处理前后VEGF mRNA的表达
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1，3，5，7分别为对照细胞A8，A7，A549，A1；2，4，6，8分别为低氧处理细胞A8，A7，A549，A1。
附表 肺癌细胞株低氧处理前后VEGF mRNA表达水平比较
VEGF mRNA(IOD)/β-actin mRNA(IOD)%
A549
A1
A7
A8
低氧处理
42.6/85.9(0.49)
36.3/62.8(0.58)
, 百拇医药
31.1/73.2(0.42)
38.8/74.4(0.52)
未低氧处理
12.2/77.9(0.16)
14.2/82.2(0.17)
8.7/67.4(0.13)
3.0/71.1(0.04)
二、人肺癌细胞株低氧处理后VEGF蛋白的表达 以免疫组化染色观察人肺癌细胞株经低氧处理前后VEGF的表达，结果如(附图)所示低氧处理后细胞呈强阳性染色(定位胞浆棕色)，而未经低氧处理的细胞大部分呈阴性染色(见封三，图3，4)。
讨 论
, 百拇医药
正常生理条件下大部分组织细胞并不表达VEGF，但几乎所有癌变的细胞都获得了表达VEGF的潜能。缺氧(hypoxia)是肿瘤微环境的一种病理生理特征。在实体肿瘤中，由于肿瘤细胞增生迅速，往往造成肿瘤局部的缺氧坏死，同时，缺氧作为一种应激反应还可诱导肿瘤细胞表达血管内皮生长因子，运用原位RT-PCR和免疫组化等技术，可观察到许多实体肿瘤包括肺癌的肿瘤坏死周围缺氧区域高水平地表达VEGFmRNA及VEGF蛋白。Hlatky等[6]研究发现在缺氧6 h后，培养中的人乳腺癌成纤维母细胞VEGF mRNA表达增强10倍，并发现当氧供应正常时其水平亦恢复正常。我们将4株人肺癌细胞置于缺氧环境下观察人肺癌细胞表达VEGF mRNA的情况，发现经低氧处理18 h以后的细胞其VEGF mRNA明显增高，并在蛋白水平证实了VEGF的表达，本实验结果进一步证实了缺氧对VEGF表达的诱导和促进效应。
VEGF能强烈地刺激血管内皮细胞增殖，迁移并形成新生血管。同时VEGF也具有增加血管通透性的能力，因而又将其称为血管通透因子。人类VEGF基因由8个外显子组成，在mRNA水平上进一步剪辑组合形成4个不同分子量的VEGF异构体，分别为VEGF121，VEGF165，VEGF189和VEGF206[7]。研究认为不同组织类型的肿瘤细胞可表达不同的异构体，但它们均能通过其功能性受体kdr或flt-1发挥其生物学效应。作者运用一组能同时扩增4种不同分子量VEGF异构体的PCR引物，经扩增发现低氧处理后的A1和A549肺癌细胞可同时表达3条阳性条带，分别为100 bp，230 bp和300 bp，对应于VEGF 121，165和189。提示缺氧可诱导VEGF的3种异构体的同时表达。
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已有研究发现位于基因组5′端的开放序列存在一段编码所谓的缺氧诱导性因子(HIF-1)的47 bp序列是低氧诱导肿瘤细胞表达VEGF的根本原因，并发现其机制类似于EPO及血小板衍生因子表达时受O2浓度调节的机制[8，9]。缺氧作为实体肿瘤始终存在的病理特征，必然会诱导机体产生一系列渐成性应激反应。其作为机体对缺氧应激产生的应签反应最终将能满足肿瘤加速生长的需要。
男，硕士，助理研究员。
参考文献
[1]Hrris LA, Lewis CE. Cytokine networks in solid human tumor:regulation of angiogenesis〔J〕. J Leuk Bio,1994,56:423
[2]Klagsburn M, Soker S. VEGF/VPF:the angiogenesis is factor found?〔J〕 Cur Bio,1993,3:699
, 百拇医药
[3]Shweiki D, Itin A, Soffer D, et al. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated antiogenesis〔J〕. Nature,1992,359:843
[4]Michenko A, Bauer T, Salcede S, et al. Hypoxic stimulation of vascular endothelial growth factor expression in vascular endothelial growth factor expression in vitro and in vivo〔J〕. Lab Invest,1994,71:370
[5]吴善芳，苏建中，王恩中，等.人体肺癌细胞系SPC-A1的建立及其生物学特性〔J〕.中国科学(B辑)1982，10：913
, 百拇医药
[6]Hlatky L, Tsionoa C, Hahnfeldt P, et al. Mammary fibroblasts may influnence breast tumor angiogenesis via hypoxia-induced vascular endothelial growth factor up-regulation and protein expression〔J〕. Cancer Res,1994,54:6083
[7]Tischer E, Mitchel R, Hartman Y, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor〔J〕. J Biol Chem,1991,66:11947
[8]Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcirption by hypoxia-inducible factor〔J〕. Mol Cell Biol,1996,4604
[9]Glodberg MA, Schneider TJ. Similartities between the oxygensensing mechanisms regulating the expression of vascular endothelial growth factor and erythropoietin〔J〕. Biol Chem,1994,269:4355
(收稿日期：1999-02-23；修回日期：2000-06-08), 百拇医药
单位：江晓丰 董强刚 冯久贤 包国良 沙慧芳 王恩忠(上海胸部肿瘤研究所，上海市胸科医院 上海 200030)
关键词：血管内皮生长因子；缺氧；肿瘤细胞，培养的；RT-PCR；免疫组化
肿瘤000610
摘要：目的 检测缺氧对人肺癌细胞株表达VEGF的影响及其机制。方法 4株人肺癌细胞在低氧环境下处理18 h后，运用半定量RT-CPR及免疫组化技术分别检测VEGF mRNA及蛋白的表达。结果 低氧处理后人肺癌细胞VEGF mRNA明显高于未处理之肺癌细胞并在免疫组化上得到了进一步证实。结论 低氧可上调人肺癌细胞表达VEGF。
中图分类号：R73-35 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0423-02
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HYPOXIA AND THE REGULATION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR IN HUMAN LUNG CANCER CELL LINES
JIANG Xiao-feng DONG Qiang-gang FENG Jiu-xian
Shanghai Thoracic Tumor Institute, Shanghai Chest Hosptial 200030, China
Abstract：Objective To investigate the influence hypoxia on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and its mechanism.Methods The expression of VEGF mRNA and protein in four hypoxia-treated human lung cancer cell lines (A549,A1,A7,A8) were tested determined by using semiquantitative reverse transcription PCR (RT-PCR) and immunohistochemcal staining. Results Semiquantitative RT-PCR demonstrated that the amount of VEGF mRNA in cells treated by hypoxia increased markedly when compared with that of control lines and the above results was confirmed by immunohistochemical staining. Besides, 3 VEGF isoforms(VEGF 121,165 and 189) could also be detected by semiquantitative RT-PCR.Conclusion These data that VEGF expression may be up-regulated by hypoxia.
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Key words： VEGF； Hypoxia； Tumou cells,cultured; RT-PCR； Immunohistochemistry
在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞增生迅速，造成肿瘤微环境始终处于相对缺氧状态。研究表明，缺氧可触发机体产生一系列应激性保护反应，使得肿瘤细胞在缺氧状态下免受损伤或死亡。其中肿瘤细胞通过分泌一系列细胞因子来调节微血管生成，使肿瘤在缺氧状态下免受损伤或死亡，并得以进一步增殖。已经发现当肿瘤组织到达2 mm时，就必需从周围血获得营养和气体交换才能进一步增长[1]。
血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管生成的主要调节因子，其通过作用于血管内皮细胞上的氨酸激酶受体kdr或flt-1而使血管内皮细胞增殖，迁移最后形成新生血管[2]。
应用免疫组化及原位PCR等技术，人们发现在许多实体肿瘤包括脑胶质，肺癌等肿瘤坏死周围的缺氧区域，高水平地表达VEGF并伴随着高水平的微血管密度，提示缺氧可诱导VEGF表达从而刺激血管生成[3，4]。本实验将4株人肺癌细胞株细胞置于缺氧环境中模拟体内缺氧条件，观察缺氧对人肺癌细胞表达VEGF的影响。
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材料与方法
一、细胞株及底氧处理 人肺癌细胞株A549，A1，A7，A8细胞(A549购于上海细胞生物学研究所，A1，A7，A8由本室建立[5])，复苏后以10% FCS-RPMI1640培养，待细胞长满瓶底后，按以下步骤进行底氧处理：以橡皮塞密封培养瓶口，插入7#针头作为排气孔，然后充N2(0.5 kg/cm2)持续5 min，使培养瓶内达到相对缺氧状态，置培养箱内18 h，收获细胞，制作细胞涂片作免疫组化检测，并留取细胞作半定量RT-PCR分析。
二、免疫组化 细胞涂片以3 %多聚甲醛固定后，加抗VEGF抗体(1∶50稀释，购于Santa Cruz公司)。4℃过夜采用ABC方法染色，实验同时设未作底氧处理的细胞对照。
三、半定量RT-PCR 肺癌细胞株(包括低氧及低氧处理)5×106细胞异硫氢胍一步法提取总RNA。1 μg总RNA进20 μl逆转录体系，各取4 μl逆转录产物DNA分别进入25 μl VEGF PRC和β-actin PCR反应体系中，所用序列为：VEGF sense 5-CACATAGGAAAGATGAGCTTC，anti-sense 5′-GGCTTGTCACAT；β-actin sense 5′-CTCGCGCTACTCTCTCTCTTTTCTGG；Anti-sense 5′-GCTTACATGTCTCGATCCCACTTTAA。反应产物经2.5 %凝胶电泳以VDS图像处理系统进行IOD值分析。
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结 果
一、人肺癌细胞株低氧处理后VEGF mRNA的表达 运用半定量RT-PCR技术，观察了人肺癌细胞株经低氧处理18 h后，其VEGF mRNA的表达，结果如附表所示，在本实验条件下，以VEGF mRNA IOD/β-actin mRNA IOD比值作为衡量VEGF mRNA的表达水平，人肺癌细胞株A1，A549，A7，A8的VEGF mRNA表达明显高于正常条件下相应细胞VEGF的mRNA表达，最高达13倍之多。同时，半定量RT-PCR电泳显示低氧处理后，上述4个细胞株分别有100 bp，230 bp和300 bp VEGF 3种异物体的表达(见附图)。
附图 半定量RT-PCR分析人肺癌细胞株低氧处理前后VEGF mRNA的表达
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1，3，5，7分别为对照细胞A8，A7，A549，A1；2，4，6，8分别为低氧处理细胞A8，A7，A549，A1。
附表 肺癌细胞株低氧处理前后VEGF mRNA表达水平比较
VEGF mRNA(IOD)/β-actin mRNA(IOD)%
A549
A1
A7
A8
低氧处理
42.6/85.9(0.49)
36.3/62.8(0.58)
, 百拇医药
31.1/73.2(0.42)
38.8/74.4(0.52)
未低氧处理
12.2/77.9(0.16)
14.2/82.2(0.17)
8.7/67.4(0.13)
3.0/71.1(0.04)
二、人肺癌细胞株低氧处理后VEGF蛋白的表达 以免疫组化染色观察人肺癌细胞株经低氧处理前后VEGF的表达，结果如(附图)所示低氧处理后细胞呈强阳性染色(定位胞浆棕色)，而未经低氧处理的细胞大部分呈阴性染色(见封三，图3，4)。
讨 论
, 百拇医药
正常生理条件下大部分组织细胞并不表达VEGF，但几乎所有癌变的细胞都获得了表达VEGF的潜能。缺氧(hypoxia)是肿瘤微环境的一种病理生理特征。在实体肿瘤中，由于肿瘤细胞增生迅速，往往造成肿瘤局部的缺氧坏死，同时，缺氧作为一种应激反应还可诱导肿瘤细胞表达血管内皮生长因子，运用原位RT-PCR和免疫组化等技术，可观察到许多实体肿瘤包括肺癌的肿瘤坏死周围缺氧区域高水平地表达VEGFmRNA及VEGF蛋白。Hlatky等[6]研究发现在缺氧6 h后，培养中的人乳腺癌成纤维母细胞VEGF mRNA表达增强10倍，并发现当氧供应正常时其水平亦恢复正常。我们将4株人肺癌细胞置于缺氧环境下观察人肺癌细胞表达VEGF mRNA的情况，发现经低氧处理18 h以后的细胞其VEGF mRNA明显增高，并在蛋白水平证实了VEGF的表达，本实验结果进一步证实了缺氧对VEGF表达的诱导和促进效应。
VEGF能强烈地刺激血管内皮细胞增殖，迁移并形成新生血管。同时VEGF也具有增加血管通透性的能力，因而又将其称为血管通透因子。人类VEGF基因由8个外显子组成，在mRNA水平上进一步剪辑组合形成4个不同分子量的VEGF异构体，分别为VEGF121，VEGF165，VEGF189和VEGF206[7]。研究认为不同组织类型的肿瘤细胞可表达不同的异构体，但它们均能通过其功能性受体kdr或flt-1发挥其生物学效应。作者运用一组能同时扩增4种不同分子量VEGF异构体的PCR引物，经扩增发现低氧处理后的A1和A549肺癌细胞可同时表达3条阳性条带，分别为100 bp，230 bp和300 bp，对应于VEGF 121，165和189。提示缺氧可诱导VEGF的3种异构体的同时表达。
, http://www.100md.com
已有研究发现位于基因组5′端的开放序列存在一段编码所谓的缺氧诱导性因子(HIF-1)的47 bp序列是低氧诱导肿瘤细胞表达VEGF的根本原因，并发现其机制类似于EPO及血小板衍生因子表达时受O2浓度调节的机制[8，9]。缺氧作为实体肿瘤始终存在的病理特征，必然会诱导机体产生一系列渐成性应激反应。其作为机体对缺氧应激产生的应签反应最终将能满足肿瘤加速生长的需要。
男，硕士，助理研究员。
参考文献
[1]Hrris LA, Lewis CE. Cytokine networks in solid human tumor:regulation of angiogenesis〔J〕. J Leuk Bio,1994,56:423
[2]Klagsburn M, Soker S. VEGF/VPF:the angiogenesis is factor found?〔J〕 Cur Bio,1993,3:699
, 百拇医药
[3]Shweiki D, Itin A, Soffer D, et al. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated antiogenesis〔J〕. Nature,1992,359:843
[4]Michenko A, Bauer T, Salcede S, et al. Hypoxic stimulation of vascular endothelial growth factor expression in vascular endothelial growth factor expression in vitro and in vivo〔J〕. Lab Invest,1994,71:370
[5]吴善芳，苏建中，王恩中，等.人体肺癌细胞系SPC-A1的建立及其生物学特性〔J〕.中国科学(B辑)1982，10：913
, 百拇医药
[6]Hlatky L, Tsionoa C, Hahnfeldt P, et al. Mammary fibroblasts may influnence breast tumor angiogenesis via hypoxia-induced vascular endothelial growth factor up-regulation and protein expression〔J〕. Cancer Res,1994,54:6083
[7]Tischer E, Mitchel R, Hartman Y, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor〔J〕. J Biol Chem,1991,66:11947
[8]Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcirption by hypoxia-inducible factor〔J〕. Mol Cell Biol,1996,4604
[9]Glodberg MA, Schneider TJ. Similartities between the oxygensensing mechanisms regulating the expression of vascular endothelial growth factor and erythropoietin〔J〕. Biol Chem,1994,269:4355
(收稿日期：1999-02-23；修回日期：2000-06-08), 百拇医药