端粒酶抑制剂对肿瘤细胞及其端粒酶活性的影响
作者：陈雯 张桥 魏青 吴大伟 邓丽霞 万德森
单位：陈雯 张桥 魏青 吴大伟 邓丽霞(中山医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室 广州 510089)；万德森(中山医科大学肿瘤医院腹外科 广州510089)
关键词：端粒酶；肿瘤细胞，培养；寡核苷酸类，反义；3′-叠氮-3′-脱氧胸腺核苷(AZT)/药物作用
肿瘤000608
摘要：目的 探讨端粒酶抑制剂作为肿瘤治疗药物的可行性。方法 选择人结肠癌细胞株HC8693、人肺癌细胞株A549以及人肝癌细胞株L7402作为靶细胞，观察3′-叠氮-3′-脱氧胸腺核苷(AZT)和人端粒酶模板区的硫代反义寡核苷酸(S-Oligos)对上述几种肿瘤细胞株的作用，用MTT试验测定细胞毒作用；3H-TdR掺入试验测定细胞增殖速度；用端粒重复序列扩增法(TRAP)半定量方法测定细胞染毒前后端粒酶活性的变化。结果 反义核苷酸片段和AZT在一定剂量范围内有抑制肿瘤细胞株繁殖的作用，在抑制细胞生长的同时，端粒酶活性降低，去除抑制剂24 h后，端粒酶活性仍然维持在较低水平。三种细胞中，HC8693和L7402对两种抑制剂较A549细胞株更加敏感，两种抑制剂联合应用比单独应用的效果好。结论 AZT和S-Oligos单独或联合应用在体外有抗肿瘤细胞的作用，进一步深入的研究有助于新的抗癌药物的开发。
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中图分类号：R73-361 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0415-04
STUDY ON TUMOR CELL LINES AND THEIR TELOMERASE ACTIVITY BY TELOMERASE INHIBITORS
CHEN Wen ZHANG Qiao WAN De-sen
Department of Health Toxicology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China
Abstract：Objective To study the potential anti-tumor effect of telomerase inhibitors. Methods Human colon cancer cell line HC8693, human lung cancer cell line A549, and human liver cancer cell line L7402 were used as target cells. The effects of 3′-azido-3′-deoxythymidine (AZT) and human antisense phosphorothioate deoxynucleotides (S-Oligos) aganist telomerase template on these cell lines were investigated. The cytotoxic effect of AZT and S-Oligos on tumor cells was quantified by using MTT colorimetric assay. Assay of 3H-TdR incorporation was undertaken to measure the cell replication. The changes of telomerase activity after treatment was detected and quantified by telomeric repeat amplification protocol (TRAP) semi-quantitative analysis.Results Both AZT and S-Oligos inhibited the growth of three tumor cell lines in a certain range of concentrations, meanwhile the telomerase activity was reduced after treatment. Moreover, 24 hours after removing AZT and S-Oligos from the media, the telomerase activity still maintain at the low level compared to control group. Among these three cell lines, HC8693 and L7402 were more sensitive to AZT and S-Oligos. Combined effect of AZT and S-Oligos was much stronger than either of the two reagents alone. Conclusion The results indicated that AZT and S-Oligos could be potentially used, alone or in combination, as anti-colon cancer,anti-liver cancer and anti-lung cancer agents or as an auxiliary in cancer treatment.
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Key words： Telomerase; Tumor cell,cultured; Oligonucleotides antisense； 3′-azido-3′-deoxythymidine/drug effects
正常人体细胞经过一定数目的分裂后，端粒逐渐缩短，最后进入一种不分裂状态，也称衰老(senescence)状态。端粒酶是一种反转录酶，它用自身模板合成端粒重复序列(TTAGGG)n，使端粒维持一定的长度，细胞可以继续分裂下去。大量的研究发现肿瘤细胞株及肿瘤组织中端粒酶阳性的比率高达70%～100%[1]。端粒酶作为恶性肿瘤的标记物的观点已被人们普遍接受，目前人们最感兴趣的是端粒酶抑制剂是否可作为抗肿瘤的药物。反义基因片段在临床上已作为肿瘤基因治疗的方法之一[2]，AZT是一种反转录酶抑制剂，国外有关AZT对爱滋病的治疗作用的研究已有许多的报道[3]，但对肿瘤细胞的作用少有报道。本实验用两种端粒酶抑制剂：端粒酶模板区硫代型反义寡核苷酸片段和AZT作用于三种肿瘤细胞株，观察它们对肿瘤细胞生长的作用及端粒酶活性的变化，为端粒酶抑制剂的临床应用提供实验依据。
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材料与方法
一、材料
1.试剂 3′-叠氮-3′-脱氧胸腺核苷(3′-Azido-3′-deoxythymidine,AZT)和四甲基偶氮唑盐(3-[4，5-dimethylthiazol-2yl]-2，5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)从Sigma公司购得；Taq DNA聚合酶从基因公司购得；[5，5′-3H]-dCTP(92.5 GBq/L，比活性2.0 TBq/mmol)是NENTM Life Science Products公司的产品；3H-TdR(37GBq/L，比活性13.3 GBq/mmol)是中国原子能科学研究所的产品；人端粒酶模板区的反义寡核苷酸序列为5′-GTTAGGGTTAG-3′，硫代修饰，由上海中科院细胞生物学研究所合成。
2.细胞来源 人肺癌肿瘤细胞株A549和人肝癌肿瘤细胞株L7402由广州医学院化学致癌研究所赠给，人结肠癌细胞株HC8693由中山医科大学肿瘤医院腹外科赠给。所有的细胞株都培养在含青链霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，传代后48 h开始给试验样品。
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二、方法
1.3H-TdR掺入试验 三种肿瘤细胞分别接种在24孔培养板中，细胞接种密度为1×105/ml，每组设三个平行孔，实验重复三次。细胞染毒后，在收集细胞的前3 h，向各组细胞的培养液中加入3H-TdR(37kBq/ml)，温育3 h后，用常规方法将细胞消化下来，离心收集细胞，再用100 μl蒸馏水溶解，取20 μl滴在玻璃滤纸上，分别用蒸馏水、5%三氯醋酸及无水乙醇洗玻璃滤纸数次，50 ℃烘干2 h后放入闪烁液中测定同位素标记量。
2.细胞毒性试验(MTT法) 细胞接种密度及分组同上。细胞加试品后，在各时间点吸去培养液，加入含0.5 mg MTT/ml的培养液，置37 ℃作用4 h后，去掉培养液，加入少量溶剂DMSO，在摇床上缓慢显色至出现蓝紫色，把适量的DMSO转入标准的96孔比色板，用MB-Ⅲ型酶标检测仪(北京市新技术应用研究所)，波长为570 nm测定OD值。
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3.蛋白提取和蛋白浓度测定 细胞蛋白的提取按Kim等[4]的方法进行。蛋白质浓度测定用考马斯亮蓝G-250染色法。
4.端粒酶活性半定量测定 用Kim等[5]改进了的TRAP法进行端粒酶活性的测定，在PCR反应中每个样本加入148 kBq的3H-dCTP，引物序列为TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′及ACX：5′-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3′，不同于Kim在1994年建立的TRAP法，这对引物可以在反应前同时加入。PCR的扩增产物用12.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用硝酸银染色后，把各样本对应的条带剪下，放入液闪瓶中，50℃烘干2 h后加入闪烁液并测定同位素标记量，每次PCR反应均设阳性对照(鼻咽癌细胞株CNE2蛋白提取液)和空白阴性对照(裂解液)，为了平衡不同批次之间样本值的差异，每个样本的cpm值都乘以一个校正系数，校正系数=所有批次阳性细胞cpm值的平均数/(样本所在批次阳性细胞cpm值-空白阴性对照cpm值)。
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5.统计学分析：统计学上用SSPS软件中的T-test检验来分析。
结 果
一、细胞毒性试验(MTT法) AZT及S-Oligos对三种肿瘤细胞株A549、L7402及HC8693都有不同程度的毒性作用，把对照组细胞的OD570值作为100%，其它剂量组的OD570值与之相比，得到各剂量组细胞相对存活率，AZT对L7402、HC8693和A549三种细胞的半数致死浓度(IC50)分别为2.55 mmol/L、2.03 mmol/L及3.78 mmol/L。S-Oligos浓度为30 μmol/L时，上述三种细胞的死亡率分别为16.8 %、10.33 %和12.9 %，说明在本实验条件下，S-Oligos对细胞的毒性作用较弱。AZT(1.0 mmol/L)及S-Oligos(10 μmol/L)联合作用时，上述三种细胞的死亡率分别为33.2%、38.9%和22.4%。
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二、影响细胞生长增殖的作用(3H-TdR掺入试验) 结果见图1a和图1b，从图1a可看出染毒两天后，不同浓度的AZT对三种细胞的生长增殖都有很强的抑制作用，且存在剂量-反应关系。在最低浓度组(0.5 mmol/L)，L7402、HC8693及A549细胞株的细胞增殖率分别是对照组的55.8%，53.9%及50.8%，随着浓度的增加，抑制作用也增加，三株细胞中，AZT对L7402和HC8693的抑制作用比A549强。同样地，S-Oligos对细胞增殖也有抑制作用，S-Oligos在浓度为20 μmol/L时，对L7402、HC8693和A549细胞的增殖抑制率分别为58.8%、52.2%及32.0%，说明S-Oligos抑制L7402和HC8693细胞增殖作用较A549强。
图1a 叠氮脱氧胸腺核苷对L7402、HC8693和A549细胞生长的抑制作用
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三、端粒酶活性的改变(TRAP半定量法) 表1显示了AZT和S-Oligos处理三株肿瘤细胞两天后及去除AZT和S-Oligos，继续培养1天后，端粒酶活性的变化。图1a和1b中的%是以对照组的端粒酶活性(cpm)为100%，处理组的cpm与对照组cpm相比得到的端粒酶活性的相对百分比。可见AZT在浓度为2.0 mmol/L时，可使三种肿瘤细胞株的端粒酶活性降低50%左右；S-Oligos在浓度为20 μmol/L时，L7402、HC8693和A549细胞株端粒酶活性分别降低66%、41%和46%。把AZT和S-Oligos从培养液中移去，继续培养24 h，发现端粒酶活性变化不大，仍然维持在低水平。AZT和S-Oligos联合作用比单独作用更强，成相加作用。
图1b 硫代反义寡核苷酸对L7402、HC8693和A549细胞生长的抑制作用
表1 叠氮脱氧胸腺核苷和硫代反义寡核苷酸抑制端粒酶活性的作用
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端粒酶活性(cpm/μg蛋白)
L7402
%
HC8693
%
A549
%
AZT(mmol/L)
0
5397±497
100.0
6072±572
100.0
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5026±475
100.0
1.0
3226±374*
59.8
3945±640*
65.0
3872±436
77.0
2.0
2667±509*
49.4
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2891±339*
47.6
3270±581*
65.1
除去AZT后
3223±392*
58.0
3135±1090*
51.6
2956±656*
58.8
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S-Oligos(μmol/L)
0
6213±604
100.0
6698±439
100.0
5604±537
100.0
10
2903±666*
46.7
3819±699*
, 百拇医药
57.0
3729±763*
66.5
20
2096±453**
33.7
3949±403*
59.0
3046±599*
54.4
除去S-Oligos
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2498±730*
40.2
4973±453*
74.2
3902±461*
69.6
AZT1.0+S-Oligos 10
1420±249**
22.9
2268±801*
33.9
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3014±680*
53.8
除去AZT+S-Oligos
1658±447**
26.7
2282±1002*
34.1
3551±625*
63.4
表中的数据是三次实验的结果，表示为均值±标准差(
±s)；*P<0.05，**P<0.001。 注：其中除去组是高剂量组处理48 h后，换成不含AZT和/或S-Oligos的培养液继续培养24 h。AZT：叠氮脱氧胸腺核苷；S-Oligos：端粒酶模板区硫代反义寡核苷酸片段
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讨 论
以端粒酶作为靶子，筛选新的抗肿瘤药物是近年来抗肿瘤研究的一个新的方向。AZT是核苷酸衍生物，在DNA复制时可以掺入链中而使复制终止；另外，AZT对DNA多聚酶有弱的亲合力，而对HIV-1反转录酶有很强的亲合力[6]。端粒酶是一种特殊的反转录酶，AZT是否可以通过抑制端粒酶活性来杀灭肿瘤细胞是本实验的目的之一。结果表明AZT在体外确实有抑制肿瘤细胞增殖的作用，对体外培养的肝癌细胞、大肠癌细胞及肺癌细胞都有作用，但存在敏感性差异，同时AZT降低端粒酶活性达50%左右。国外的实验报道AZT在体外有抑制乳腺癌细胞株增殖及降低端粒酶的活性的作用[6]，并可使HeLa细胞的端粒发生不可逆变的缩短[7]，说明AZT很可能是一种有效的抗癌药物。
由于端粒酶在正常的人体组织中不表达，因此抑制端粒酶活性对正常组织细胞影响不大，本实验应用的人端粒酶模板区的反义寡核苷酸片段在理论上应具有特异性强，副作用小的特点，这些特点在本次实验中得到证实，首先，反义寡核苷酸片段对L7402、HC8693及A549细胞株的毒性作用较小；其次，它对上述三种细胞具有很强的增殖抑制作用；再者，它也抑制端粒酶的活性，尤其是对肝癌细胞株，抑制率高达66%。本实验室的另外一项实验发现(未发表)，端粒酶模板区的反义寡核苷酸能有效地降低由二甲肼诱导的大肠癌的发生率，在动物实验中证实了反义寡核苷酸的抗肿瘤作用，而且发现未产生任何的副作用。至于反义核苷酸抑制端粒酶后，通过什么机理来达到抗肿瘤细胞生长的效应还未清楚。有学者认为是通过诱导细胞凋亡的和细胞分化的途径[8]。以上结果提示端粒酶模板区的反义核苷酸可能是一种较为理想的抗癌药物，值得进一步深入研究。
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本研究还发现去除AZT和S-Oligos后24 h，细胞的端粒酶活性仍然能维持在较低的水平，说明端粒酶受到抑制后，酶活性的恢复需要一定的时间。
基金项目：本课题受国家自然科学基金(39670644)与中山医科大学校基金资助
陈雯，女，硕士，讲师。
参考文献
[1]Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer〔J〕. Eur J Cancer,1997,33:787
[2]Reynolds T. First antisense drug trial planned in leukemia〔J〕. J Natl Cancer Inst,1992,84:288
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[3]Villahermosa ML,Martinez-Irujo JJ, Cabodevilla F, et al. Synergistic inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by combinations of chain-terminating nucleotides〔J〕. Biochemistry, 1997,36:13223
[4]Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer〔J〕. Science, 1994,266:2011
[5]Kim NW, Wu F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol(TRAP)〔J〕.Nucleic Acid Res,1997,25:2595
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[6]Stella MM, Holland JF, Pogo BGT. Inhibition of cell growth and telomerase activity of breast cancer cells in vitro by 3′-azido-3′-deoxythymidine〔J〕.Clin Cancer Res,1998,4:693
[7]Daniel EG,Tejera AM, Olive OA. Irreversible telomere shortening by 3′-azido-2′，3′-dideoxythmidine(AZT) treatment〔J〕. Biochem Biophy Res Commun,1998,246:107
[8]Seiji K, Yoshikazu T, Yasuko K, et al. Antisense telomerase treatment:induction of two distinct pathways, apoptosis and differentiation. FASEB J, 1998,12:801
(收稿日期：1999-06-01；修回日期：1999-07-26), 百拇医药
单位：陈雯 张桥 魏青 吴大伟 邓丽霞(中山医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室 广州 510089)；万德森(中山医科大学肿瘤医院腹外科 广州510089)
关键词：端粒酶；肿瘤细胞，培养；寡核苷酸类，反义；3′-叠氮-3′-脱氧胸腺核苷(AZT)/药物作用
肿瘤000608
摘要：目的 探讨端粒酶抑制剂作为肿瘤治疗药物的可行性。方法 选择人结肠癌细胞株HC8693、人肺癌细胞株A549以及人肝癌细胞株L7402作为靶细胞，观察3′-叠氮-3′-脱氧胸腺核苷(AZT)和人端粒酶模板区的硫代反义寡核苷酸(S-Oligos)对上述几种肿瘤细胞株的作用，用MTT试验测定细胞毒作用；3H-TdR掺入试验测定细胞增殖速度；用端粒重复序列扩增法(TRAP)半定量方法测定细胞染毒前后端粒酶活性的变化。结果 反义核苷酸片段和AZT在一定剂量范围内有抑制肿瘤细胞株繁殖的作用，在抑制细胞生长的同时，端粒酶活性降低，去除抑制剂24 h后，端粒酶活性仍然维持在较低水平。三种细胞中，HC8693和L7402对两种抑制剂较A549细胞株更加敏感，两种抑制剂联合应用比单独应用的效果好。结论 AZT和S-Oligos单独或联合应用在体外有抗肿瘤细胞的作用，进一步深入的研究有助于新的抗癌药物的开发。
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中图分类号：R73-361 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0415-04
STUDY ON TUMOR CELL LINES AND THEIR TELOMERASE ACTIVITY BY TELOMERASE INHIBITORS
CHEN Wen ZHANG Qiao WAN De-sen
Department of Health Toxicology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China
Abstract：Objective To study the potential anti-tumor effect of telomerase inhibitors. Methods Human colon cancer cell line HC8693, human lung cancer cell line A549, and human liver cancer cell line L7402 were used as target cells. The effects of 3′-azido-3′-deoxythymidine (AZT) and human antisense phosphorothioate deoxynucleotides (S-Oligos) aganist telomerase template on these cell lines were investigated. The cytotoxic effect of AZT and S-Oligos on tumor cells was quantified by using MTT colorimetric assay. Assay of 3H-TdR incorporation was undertaken to measure the cell replication. The changes of telomerase activity after treatment was detected and quantified by telomeric repeat amplification protocol (TRAP) semi-quantitative analysis.Results Both AZT and S-Oligos inhibited the growth of three tumor cell lines in a certain range of concentrations, meanwhile the telomerase activity was reduced after treatment. Moreover, 24 hours after removing AZT and S-Oligos from the media, the telomerase activity still maintain at the low level compared to control group. Among these three cell lines, HC8693 and L7402 were more sensitive to AZT and S-Oligos. Combined effect of AZT and S-Oligos was much stronger than either of the two reagents alone. Conclusion The results indicated that AZT and S-Oligos could be potentially used, alone or in combination, as anti-colon cancer,anti-liver cancer and anti-lung cancer agents or as an auxiliary in cancer treatment.
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Key words： Telomerase; Tumor cell,cultured; Oligonucleotides antisense； 3′-azido-3′-deoxythymidine/drug effects
正常人体细胞经过一定数目的分裂后，端粒逐渐缩短，最后进入一种不分裂状态，也称衰老(senescence)状态。端粒酶是一种反转录酶，它用自身模板合成端粒重复序列(TTAGGG)n，使端粒维持一定的长度，细胞可以继续分裂下去。大量的研究发现肿瘤细胞株及肿瘤组织中端粒酶阳性的比率高达70%～100%[1]。端粒酶作为恶性肿瘤的标记物的观点已被人们普遍接受，目前人们最感兴趣的是端粒酶抑制剂是否可作为抗肿瘤的药物。反义基因片段在临床上已作为肿瘤基因治疗的方法之一[2]，AZT是一种反转录酶抑制剂，国外有关AZT对爱滋病的治疗作用的研究已有许多的报道[3]，但对肿瘤细胞的作用少有报道。本实验用两种端粒酶抑制剂：端粒酶模板区硫代型反义寡核苷酸片段和AZT作用于三种肿瘤细胞株，观察它们对肿瘤细胞生长的作用及端粒酶活性的变化，为端粒酶抑制剂的临床应用提供实验依据。
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材料与方法
一、材料
1.试剂 3′-叠氮-3′-脱氧胸腺核苷(3′-Azido-3′-deoxythymidine,AZT)和四甲基偶氮唑盐(3-[4，5-dimethylthiazol-2yl]-2，5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)从Sigma公司购得；Taq DNA聚合酶从基因公司购得；[5，5′-3H]-dCTP(92.5 GBq/L，比活性2.0 TBq/mmol)是NENTM Life Science Products公司的产品；3H-TdR(37GBq/L，比活性13.3 GBq/mmol)是中国原子能科学研究所的产品；人端粒酶模板区的反义寡核苷酸序列为5′-GTTAGGGTTAG-3′，硫代修饰，由上海中科院细胞生物学研究所合成。
2.细胞来源 人肺癌肿瘤细胞株A549和人肝癌肿瘤细胞株L7402由广州医学院化学致癌研究所赠给，人结肠癌细胞株HC8693由中山医科大学肿瘤医院腹外科赠给。所有的细胞株都培养在含青链霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，传代后48 h开始给试验样品。
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二、方法
1.3H-TdR掺入试验 三种肿瘤细胞分别接种在24孔培养板中，细胞接种密度为1×105/ml，每组设三个平行孔，实验重复三次。细胞染毒后，在收集细胞的前3 h，向各组细胞的培养液中加入3H-TdR(37kBq/ml)，温育3 h后，用常规方法将细胞消化下来，离心收集细胞，再用100 μl蒸馏水溶解，取20 μl滴在玻璃滤纸上，分别用蒸馏水、5%三氯醋酸及无水乙醇洗玻璃滤纸数次，50 ℃烘干2 h后放入闪烁液中测定同位素标记量。
2.细胞毒性试验(MTT法) 细胞接种密度及分组同上。细胞加试品后，在各时间点吸去培养液，加入含0.5 mg MTT/ml的培养液，置37 ℃作用4 h后，去掉培养液，加入少量溶剂DMSO，在摇床上缓慢显色至出现蓝紫色，把适量的DMSO转入标准的96孔比色板，用MB-Ⅲ型酶标检测仪(北京市新技术应用研究所)，波长为570 nm测定OD值。
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3.蛋白提取和蛋白浓度测定 细胞蛋白的提取按Kim等[4]的方法进行。蛋白质浓度测定用考马斯亮蓝G-250染色法。
4.端粒酶活性半定量测定 用Kim等[5]改进了的TRAP法进行端粒酶活性的测定，在PCR反应中每个样本加入148 kBq的3H-dCTP，引物序列为TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′及ACX：5′-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3′，不同于Kim在1994年建立的TRAP法，这对引物可以在反应前同时加入。PCR的扩增产物用12.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用硝酸银染色后，把各样本对应的条带剪下，放入液闪瓶中，50℃烘干2 h后加入闪烁液并测定同位素标记量，每次PCR反应均设阳性对照(鼻咽癌细胞株CNE2蛋白提取液)和空白阴性对照(裂解液)，为了平衡不同批次之间样本值的差异，每个样本的cpm值都乘以一个校正系数，校正系数=所有批次阳性细胞cpm值的平均数/(样本所在批次阳性细胞cpm值-空白阴性对照cpm值)。
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5.统计学分析：统计学上用SSPS软件中的T-test检验来分析。
结 果
一、细胞毒性试验(MTT法) AZT及S-Oligos对三种肿瘤细胞株A549、L7402及HC8693都有不同程度的毒性作用，把对照组细胞的OD570值作为100%，其它剂量组的OD570值与之相比，得到各剂量组细胞相对存活率，AZT对L7402、HC8693和A549三种细胞的半数致死浓度(IC50)分别为2.55 mmol/L、2.03 mmol/L及3.78 mmol/L。S-Oligos浓度为30 μmol/L时，上述三种细胞的死亡率分别为16.8 %、10.33 %和12.9 %，说明在本实验条件下，S-Oligos对细胞的毒性作用较弱。AZT(1.0 mmol/L)及S-Oligos(10 μmol/L)联合作用时，上述三种细胞的死亡率分别为33.2%、38.9%和22.4%。
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二、影响细胞生长增殖的作用(3H-TdR掺入试验) 结果见图1a和图1b，从图1a可看出染毒两天后，不同浓度的AZT对三种细胞的生长增殖都有很强的抑制作用，且存在剂量-反应关系。在最低浓度组(0.5 mmol/L)，L7402、HC8693及A549细胞株的细胞增殖率分别是对照组的55.8%，53.9%及50.8%，随着浓度的增加，抑制作用也增加，三株细胞中，AZT对L7402和HC8693的抑制作用比A549强。同样地，S-Oligos对细胞增殖也有抑制作用，S-Oligos在浓度为20 μmol/L时，对L7402、HC8693和A549细胞的增殖抑制率分别为58.8%、52.2%及32.0%，说明S-Oligos抑制L7402和HC8693细胞增殖作用较A549强。
图1a 叠氮脱氧胸腺核苷对L7402、HC8693和A549细胞生长的抑制作用
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三、端粒酶活性的改变(TRAP半定量法) 表1显示了AZT和S-Oligos处理三株肿瘤细胞两天后及去除AZT和S-Oligos，继续培养1天后，端粒酶活性的变化。图1a和1b中的%是以对照组的端粒酶活性(cpm)为100%，处理组的cpm与对照组cpm相比得到的端粒酶活性的相对百分比。可见AZT在浓度为2.0 mmol/L时，可使三种肿瘤细胞株的端粒酶活性降低50%左右；S-Oligos在浓度为20 μmol/L时，L7402、HC8693和A549细胞株端粒酶活性分别降低66%、41%和46%。把AZT和S-Oligos从培养液中移去，继续培养24 h，发现端粒酶活性变化不大，仍然维持在低水平。AZT和S-Oligos联合作用比单独作用更强，成相加作用。
图1b 硫代反义寡核苷酸对L7402、HC8693和A549细胞生长的抑制作用
表1 叠氮脱氧胸腺核苷和硫代反义寡核苷酸抑制端粒酶活性的作用
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端粒酶活性(cpm/μg蛋白)
L7402
%
HC8693
%
A549
%
AZT(mmol/L)
0
5397±497
100.0
6072±572
100.0
, 百拇医药
5026±475
100.0
1.0
3226±374*
59.8
3945±640*
65.0
3872±436
77.0
2.0
2667±509*
49.4
, 百拇医药
2891±339*
47.6
3270±581*
65.1
除去AZT后
3223±392*
58.0
3135±1090*
51.6
2956±656*
58.8
, 百拇医药
S-Oligos(μmol/L)
0
6213±604
100.0
6698±439
100.0
5604±537
100.0
10
2903±666*
46.7
3819±699*
, 百拇医药
57.0
3729±763*
66.5
20
2096±453**
33.7
3949±403*
59.0
3046±599*
54.4
除去S-Oligos
, http://www.100md.com
2498±730*
40.2
4973±453*
74.2
3902±461*
69.6
AZT1.0+S-Oligos 10
1420±249**
22.9
2268±801*
33.9
, http://www.100md.com
3014±680*
53.8
除去AZT+S-Oligos
1658±447**
26.7
2282±1002*
34.1
3551±625*
63.4
表中的数据是三次实验的结果，表示为均值±标准差(
±s)；*P<0.05，**P<0.001。 注：其中除去组是高剂量组处理48 h后，换成不含AZT和/或S-Oligos的培养液继续培养24 h。AZT：叠氮脱氧胸腺核苷；S-Oligos：端粒酶模板区硫代反义寡核苷酸片段, 百拇医药
讨 论
以端粒酶作为靶子，筛选新的抗肿瘤药物是近年来抗肿瘤研究的一个新的方向。AZT是核苷酸衍生物，在DNA复制时可以掺入链中而使复制终止；另外，AZT对DNA多聚酶有弱的亲合力，而对HIV-1反转录酶有很强的亲合力[6]。端粒酶是一种特殊的反转录酶，AZT是否可以通过抑制端粒酶活性来杀灭肿瘤细胞是本实验的目的之一。结果表明AZT在体外确实有抑制肿瘤细胞增殖的作用，对体外培养的肝癌细胞、大肠癌细胞及肺癌细胞都有作用，但存在敏感性差异，同时AZT降低端粒酶活性达50%左右。国外的实验报道AZT在体外有抑制乳腺癌细胞株增殖及降低端粒酶的活性的作用[6]，并可使HeLa细胞的端粒发生不可逆变的缩短[7]，说明AZT很可能是一种有效的抗癌药物。
由于端粒酶在正常的人体组织中不表达，因此抑制端粒酶活性对正常组织细胞影响不大，本实验应用的人端粒酶模板区的反义寡核苷酸片段在理论上应具有特异性强，副作用小的特点，这些特点在本次实验中得到证实，首先，反义寡核苷酸片段对L7402、HC8693及A549细胞株的毒性作用较小；其次，它对上述三种细胞具有很强的增殖抑制作用；再者，它也抑制端粒酶的活性，尤其是对肝癌细胞株，抑制率高达66%。本实验室的另外一项实验发现(未发表)，端粒酶模板区的反义寡核苷酸能有效地降低由二甲肼诱导的大肠癌的发生率，在动物实验中证实了反义寡核苷酸的抗肿瘤作用，而且发现未产生任何的副作用。至于反义核苷酸抑制端粒酶后，通过什么机理来达到抗肿瘤细胞生长的效应还未清楚。有学者认为是通过诱导细胞凋亡的和细胞分化的途径[8]。以上结果提示端粒酶模板区的反义核苷酸可能是一种较为理想的抗癌药物，值得进一步深入研究。
, 百拇医药
本研究还发现去除AZT和S-Oligos后24 h，细胞的端粒酶活性仍然能维持在较低的水平，说明端粒酶受到抑制后，酶活性的恢复需要一定的时间。
基金项目：本课题受国家自然科学基金(39670644)与中山医科大学校基金资助
陈雯，女，硕士，讲师。
参考文献
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, 百拇医药
[3]Villahermosa ML,Martinez-Irujo JJ, Cabodevilla F, et al. Synergistic inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by combinations of chain-terminating nucleotides〔J〕. Biochemistry, 1997,36:13223
[4]Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer〔J〕. Science, 1994,266:2011
[5]Kim NW, Wu F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol(TRAP)〔J〕.Nucleic Acid Res,1997,25:2595
, 百拇医药
[6]Stella MM, Holland JF, Pogo BGT. Inhibition of cell growth and telomerase activity of breast cancer cells in vitro by 3′-azido-3′-deoxythymidine〔J〕.Clin Cancer Res,1998,4:693
[7]Daniel EG,Tejera AM, Olive OA. Irreversible telomere shortening by 3′-azido-2′，3′-dideoxythmidine(AZT) treatment〔J〕. Biochem Biophy Res Commun,1998,246:107
[8]Seiji K, Yoshikazu T, Yasuko K, et al. Antisense telomerase treatment:induction of two distinct pathways, apoptosis and differentiation. FASEB J, 1998,12:801
(收稿日期：1999-06-01；修回日期：1999-07-26), 百拇医药