端粒酶抑制剂与肿瘤治疗
作者：薛晓畅 张英起
单位：第四军医大学，陕西 西安 710032
关键词：
医学与哲学001209中图分类号：R730.5 文献标识码：A
文章编号：1002-0772(2000)12-0027-02
端粒和端粒酶的发现比较早，但是只是在近几年对它们的研究才相对重视了起来，尤其是发现了端粒酶在肿瘤中的相对特异而广泛的表达。以后，人们更是致力于发现新的特异的端粒酶抑制剂，以期能为肿瘤的治疗打开一条通路。
1 端粒酶与肿瘤发生
1.1 端粒长度的调节
, 百拇医药 研究发现在端粒上结合有两种蛋白质。第一种端粒结合蛋白(telomere binding protein，TBP)是一种特异结合在端粒DNA上的蛋白质。其中四膜虫的TBP的晶体结构已比较清楚，它由α、β两个亚单位组成，两者构成一沟槽容纳并结合端粒3’的G4T4G4序列。第二种端粒结合蛋白(Telomere associate proteins)是一类与telomere DNA-binding protein结合的蛋白质，发挥蛋白与蛋白间的相互作用，组成一个染色体功能区域(telosome)。已证明这两类蛋白质对端粒长度具有负调控作用，并且可能抑制端粒酶活性。由此可见，端粒长度的调节是一个多因素协同作用的结果。
1.2 端粒酶与肿瘤发生
端粒酶在维持肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用。迄今发现人体绝大多数肿瘤近90%有端粒酶的活化表达，医学界认为端粒酶很可能是一种广泛的肿瘤标志。据此人们提出了一种M1/M2假说，认为细胞只有越过M1(mortality stage 1)和M2(mortality stage 2)期，才能永生化，进而发生肿瘤。
, 百拇医药
端粒酶通过延长端粒而维持肿瘤细胞的持续增殖能力。许多细胞通过端粒酶的表达下调或酶裂解而退出细胞周期。在正常生长条件下，抑制端粒酶活性，肿瘤来源的细胞将继续分裂并伴随着端粒的缩短，最终处于静息状态或死亡。虽然关于端粒酶在肿瘤发生前还是发生后激活，人们意见不一，但肯定的是端粒酶活化对于许多肿瘤的发生及恶化是必须的。
2 端粒酶活性与肿瘤诊断
近几年的研究表明，端粒酶几乎在所有进展期肿瘤中都有表达，它是乳腺癌等发生的早期指标，而且端粒酶活性在某些组织中可作为鉴别良恶性肿瘤的“标准”。在对胰腺肿瘤、卵巢上皮肿瘤、滤泡性甲状腺肿瘤等的良恶性鉴别上已取得了比较理想的效果。最近，Sawant等发现端粒酶的活性是放疗效果较理想的监测物。
由于端粒酶活性与肿瘤有较密切的关系，因此对其活性进行检测以监测肿瘤的发展状况在临床诊断上是有意义的。但是由于对于端粒酶的激活究竟是在肿瘤发生的哪个阶段，尚有争议。对于端粒酶与肿瘤大小、恶性程度、淋巴结转移及预后的关系，各家意见也不一致。Wullich等的研究表明，在前列腺癌中，由于端粒酶活性的异质化，在诊断中容易产生假阴性，所以，应用于临床尚有一段时间。
, 百拇医药
3 端粒酶抑制剂与肿瘤治疗
3.1反义技术
反义技术是一种根据碱基互补配对原则，用生物合成或人工合成的特定互补的DNA或RNA片段(及其衍生物)封闭或抑制目的基因表达的技术。实施反义技术的主体是反义核酸片段，包括反义DNA、Ribozyme、反义RNA等。反义核酸应具备序列专一性、区域有效性、稳定性、细胞通透性和药物学特性。
1995年Feng等将针对端粒酶RNA的反义质粒转染到Hela细胞，观察到Hela细胞的端粒酶活性明显受抑，经过20余次分裂后，细胞生长受抑，最后死亡。随后，研究发现一些反义核酸的衍生物(如PS-ODN)也对端粒酶活性具有抑制性。
核酶(ribozyme,RZ)是一类具有酶活性的RNA分子，可特异性地与靶RNA结合并对其进行切割。Kanazawa等设计了一种直接作用于人端粒酶RNA(hTR)的锤头状核酶在teloRZ，发现其对人工合成的端粒酶RNA具有专一的切割活性，当把teloRZ加入人肝癌细胞端粒酶提取物中，可有效地抑制端粒酶活性，把该酶用作新的抗肿瘤制剂具有潜在的应用前景。
, http://www.100md.com
肽核酸(Peptide nucleic acids，PNAs)是近年来人工合成的一类DNA或RNA分子类似物。它以多肽骨架替换了反义寡核昔酸核糖磷酸骨架，具有与单链DNA分子相似的结构特征。PNA仍通过Wason-Crick原则与DNA或RNA配对结合，由于其中性骨架与靶序列排斥力小，故亲和力更高；又因其既非多肽又非核酸，不易被蛋白酶和核酸酶降解，所以稳定性大大提高。上述优越性使PNA已成为新一代反义分子被用于肿瘤的治疗研究。
3. 2 核苷类似物
核苷类似物是一种逆转录酶抑制剂，它可以通过逆转录过程的“链终止反应”发挥抑制端粒酶活性的作用。其中的Ara-GTP和ddGTP活性较强，Fletcher等报道核苷类似物7-脱氮-2'-脱氧腺嘌呤核苷酸(7-deaza-dATP)和7-脱氮-2'-脱氧鸟嘌呤核苷酸(7-deaza-dGTP)在端粒合成时掺入端粒重复序列中，从而导致端粒结构不稳，长度缩短，因此，在端粒酶强阳性表达的肿瘤细胞端粒结构中掺入核苷类似物有可能为端粒酶抑制剂设计提供新的思路。
, 百拇医药
3.3 分化诱导剂
研究表明，分化不良的肿瘤细胞中端粒酶活性高，而终末分化或静止期己退出细胞周期的其端粒酶活性明显下调。Albanell等认为端粒酶活性与细胞分化程度呈反比关系。分化诱导剂全反式维甲酸(RA)、二甲亚砜(DMSO)、l，25-二羟维生素D3均可明显下调早幼粒细胞白血病细胞株HL-60、NB4及人胚胎癌细胞NTERA-2的端粒酶活性。但也有人认为诱导分化剂本身并不具有端粒酶活性抑制作用。
3.4 端粒酶蛋白抗体
端粒酶蛋白组分的克隆成功使得运用抗体抑制端粒酶活性成为可能。抗四膜虫蛋白组分p80 的抗体可以特异性的免疫沉淀端粒酶，抑制其活性。人端粒酶相关蛋白TP1与p80具有很高的同源性，抗p80抗体同样也能抑制人端粒酶活性。
3.5 蛋白激酶C抑制剂
, http://www.100md.com
蛋白激酶C抑制剂bisindolymaleimide Ⅰ和H-7对鼻咽癌细胞NPC-076端粒酶活性具有很强的抑制作用，staurosporine产生中等强度的抑制作用，sphingosine的抑制作用较弱。
4 问题与展望
当人们刚发现端粒酶与肿瘤治疗的极大相关性时，许多学者都认为消灭肿瘤的日子为期不远了，但实际情况却远非如此。端粒酶抑制剂用于肿瘤治疗还有许多问题有待解决。
虽然大多数肿瘤细胞都有端粒酶活性，但也有一些为阴性。所以端粒酶抑制剂并不是真正的广谱抗癌物。而且，除癌细胞以外，人体的许多正常组织如睾丸、卵巢、胚胎细胞、生血细胞、肾细胞、前列腺细胞、成人肝细胞和外周血细胞中都有端粒酶的表达，虽然活性很低，但端粒酶抑制剂也可能对其造成影响。人体的生殖细胞为端粒酶强阳性，其端粒长度长期维持在一个恒定的高水平，以维持种属的延续性。如果针对肿瘤细胞的端粒酶抑制剂同样可以进入生殖细胞，使其端粒酶失活，其后果将是严重的。因此在把端粒酶应用于临床治疗肿瘤前要对上述情况进行评估和防范。
, http://www.100md.com
一方面，端粒酶活性与肿瘤的恶性程度呈正相关，对机体有害；但另一方面端粒酶对机体的许多组织细胞又具有积极的作用，可以使其保持一定的增殖能力，有延缓机体衰老的效用。所以，人们在通过灭活端粒酶以达到治疗肿瘤目的的同时，又想通过活化端粒酶来延长某些易衰老组织器官的工作年限，从而达到延长人类寿命的目的。两者之间的协调是一个值得考虑和研究的问题。
此外，端粒长度的调节还受端粒结合蛋白的调控，因此，只单纯的考虑端粒酶抑制剂，其在人体内的效果还有待探讨。
总之，端粒酶抑制剂用于肿瘤治疗虽然前景比较乐观，但还有一段很长的路要走。只有在弄清楚了端粒酶的全酶结构和端粒酶表达的基因调节，并在端粒酶活性表达定量测定技术的改进等问题解决之后，端粒酶抑制剂才有望应用于临床肿瘤诊断和治疗。
收稿日期：2000-01-13, http://www.100md.com
单位：第四军医大学，陕西 西安 710032
关键词：
医学与哲学001209中图分类号：R730.5 文献标识码：A
文章编号：1002-0772(2000)12-0027-02
端粒和端粒酶的发现比较早，但是只是在近几年对它们的研究才相对重视了起来，尤其是发现了端粒酶在肿瘤中的相对特异而广泛的表达。以后，人们更是致力于发现新的特异的端粒酶抑制剂，以期能为肿瘤的治疗打开一条通路。
1 端粒酶与肿瘤发生
1.1 端粒长度的调节
, 百拇医药 研究发现在端粒上结合有两种蛋白质。第一种端粒结合蛋白(telomere binding protein，TBP)是一种特异结合在端粒DNA上的蛋白质。其中四膜虫的TBP的晶体结构已比较清楚，它由α、β两个亚单位组成，两者构成一沟槽容纳并结合端粒3’的G4T4G4序列。第二种端粒结合蛋白(Telomere associate proteins)是一类与telomere DNA-binding protein结合的蛋白质，发挥蛋白与蛋白间的相互作用，组成一个染色体功能区域(telosome)。已证明这两类蛋白质对端粒长度具有负调控作用，并且可能抑制端粒酶活性。由此可见，端粒长度的调节是一个多因素协同作用的结果。
1.2 端粒酶与肿瘤发生
端粒酶在维持肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用。迄今发现人体绝大多数肿瘤近90%有端粒酶的活化表达，医学界认为端粒酶很可能是一种广泛的肿瘤标志。据此人们提出了一种M1/M2假说，认为细胞只有越过M1(mortality stage 1)和M2(mortality stage 2)期，才能永生化，进而发生肿瘤。
, 百拇医药
端粒酶通过延长端粒而维持肿瘤细胞的持续增殖能力。许多细胞通过端粒酶的表达下调或酶裂解而退出细胞周期。在正常生长条件下，抑制端粒酶活性，肿瘤来源的细胞将继续分裂并伴随着端粒的缩短，最终处于静息状态或死亡。虽然关于端粒酶在肿瘤发生前还是发生后激活，人们意见不一，但肯定的是端粒酶活化对于许多肿瘤的发生及恶化是必须的。
2 端粒酶活性与肿瘤诊断
近几年的研究表明，端粒酶几乎在所有进展期肿瘤中都有表达，它是乳腺癌等发生的早期指标，而且端粒酶活性在某些组织中可作为鉴别良恶性肿瘤的“标准”。在对胰腺肿瘤、卵巢上皮肿瘤、滤泡性甲状腺肿瘤等的良恶性鉴别上已取得了比较理想的效果。最近，Sawant等发现端粒酶的活性是放疗效果较理想的监测物。
由于端粒酶活性与肿瘤有较密切的关系，因此对其活性进行检测以监测肿瘤的发展状况在临床诊断上是有意义的。但是由于对于端粒酶的激活究竟是在肿瘤发生的哪个阶段，尚有争议。对于端粒酶与肿瘤大小、恶性程度、淋巴结转移及预后的关系，各家意见也不一致。Wullich等的研究表明，在前列腺癌中，由于端粒酶活性的异质化，在诊断中容易产生假阴性，所以，应用于临床尚有一段时间。
, 百拇医药
3 端粒酶抑制剂与肿瘤治疗
3.1反义技术
反义技术是一种根据碱基互补配对原则，用生物合成或人工合成的特定互补的DNA或RNA片段(及其衍生物)封闭或抑制目的基因表达的技术。实施反义技术的主体是反义核酸片段，包括反义DNA、Ribozyme、反义RNA等。反义核酸应具备序列专一性、区域有效性、稳定性、细胞通透性和药物学特性。
1995年Feng等将针对端粒酶RNA的反义质粒转染到Hela细胞，观察到Hela细胞的端粒酶活性明显受抑，经过20余次分裂后，细胞生长受抑，最后死亡。随后，研究发现一些反义核酸的衍生物(如PS-ODN)也对端粒酶活性具有抑制性。
核酶(ribozyme,RZ)是一类具有酶活性的RNA分子，可特异性地与靶RNA结合并对其进行切割。Kanazawa等设计了一种直接作用于人端粒酶RNA(hTR)的锤头状核酶在teloRZ，发现其对人工合成的端粒酶RNA具有专一的切割活性，当把teloRZ加入人肝癌细胞端粒酶提取物中，可有效地抑制端粒酶活性，把该酶用作新的抗肿瘤制剂具有潜在的应用前景。
, http://www.100md.com
肽核酸(Peptide nucleic acids，PNAs)是近年来人工合成的一类DNA或RNA分子类似物。它以多肽骨架替换了反义寡核昔酸核糖磷酸骨架，具有与单链DNA分子相似的结构特征。PNA仍通过Wason-Crick原则与DNA或RNA配对结合，由于其中性骨架与靶序列排斥力小，故亲和力更高；又因其既非多肽又非核酸，不易被蛋白酶和核酸酶降解，所以稳定性大大提高。上述优越性使PNA已成为新一代反义分子被用于肿瘤的治疗研究。
3. 2 核苷类似物
核苷类似物是一种逆转录酶抑制剂，它可以通过逆转录过程的“链终止反应”发挥抑制端粒酶活性的作用。其中的Ara-GTP和ddGTP活性较强，Fletcher等报道核苷类似物7-脱氮-2'-脱氧腺嘌呤核苷酸(7-deaza-dATP)和7-脱氮-2'-脱氧鸟嘌呤核苷酸(7-deaza-dGTP)在端粒合成时掺入端粒重复序列中，从而导致端粒结构不稳，长度缩短，因此，在端粒酶强阳性表达的肿瘤细胞端粒结构中掺入核苷类似物有可能为端粒酶抑制剂设计提供新的思路。
, 百拇医药
3.3 分化诱导剂
研究表明，分化不良的肿瘤细胞中端粒酶活性高，而终末分化或静止期己退出细胞周期的其端粒酶活性明显下调。Albanell等认为端粒酶活性与细胞分化程度呈反比关系。分化诱导剂全反式维甲酸(RA)、二甲亚砜(DMSO)、l，25-二羟维生素D3均可明显下调早幼粒细胞白血病细胞株HL-60、NB4及人胚胎癌细胞NTERA-2的端粒酶活性。但也有人认为诱导分化剂本身并不具有端粒酶活性抑制作用。
3.4 端粒酶蛋白抗体
端粒酶蛋白组分的克隆成功使得运用抗体抑制端粒酶活性成为可能。抗四膜虫蛋白组分p80 的抗体可以特异性的免疫沉淀端粒酶，抑制其活性。人端粒酶相关蛋白TP1与p80具有很高的同源性，抗p80抗体同样也能抑制人端粒酶活性。
3.5 蛋白激酶C抑制剂
, http://www.100md.com
蛋白激酶C抑制剂bisindolymaleimide Ⅰ和H-7对鼻咽癌细胞NPC-076端粒酶活性具有很强的抑制作用，staurosporine产生中等强度的抑制作用，sphingosine的抑制作用较弱。
4 问题与展望
当人们刚发现端粒酶与肿瘤治疗的极大相关性时，许多学者都认为消灭肿瘤的日子为期不远了，但实际情况却远非如此。端粒酶抑制剂用于肿瘤治疗还有许多问题有待解决。
虽然大多数肿瘤细胞都有端粒酶活性，但也有一些为阴性。所以端粒酶抑制剂并不是真正的广谱抗癌物。而且，除癌细胞以外，人体的许多正常组织如睾丸、卵巢、胚胎细胞、生血细胞、肾细胞、前列腺细胞、成人肝细胞和外周血细胞中都有端粒酶的表达，虽然活性很低，但端粒酶抑制剂也可能对其造成影响。人体的生殖细胞为端粒酶强阳性，其端粒长度长期维持在一个恒定的高水平，以维持种属的延续性。如果针对肿瘤细胞的端粒酶抑制剂同样可以进入生殖细胞，使其端粒酶失活，其后果将是严重的。因此在把端粒酶应用于临床治疗肿瘤前要对上述情况进行评估和防范。
, http://www.100md.com
一方面，端粒酶活性与肿瘤的恶性程度呈正相关，对机体有害；但另一方面端粒酶对机体的许多组织细胞又具有积极的作用，可以使其保持一定的增殖能力，有延缓机体衰老的效用。所以，人们在通过灭活端粒酶以达到治疗肿瘤目的的同时，又想通过活化端粒酶来延长某些易衰老组织器官的工作年限，从而达到延长人类寿命的目的。两者之间的协调是一个值得考虑和研究的问题。
此外，端粒长度的调节还受端粒结合蛋白的调控，因此，只单纯的考虑端粒酶抑制剂，其在人体内的效果还有待探讨。
总之，端粒酶抑制剂用于肿瘤治疗虽然前景比较乐观，但还有一段很长的路要走。只有在弄清楚了端粒酶的全酶结构和端粒酶表达的基因调节，并在端粒酶活性表达定量测定技术的改进等问题解决之后，端粒酶抑制剂才有望应用于临床肿瘤诊断和治疗。
收稿日期：2000-01-13, http://www.100md.com