单个胎儿有核红细胞的DNA分析
作者：邹丽 朱剑文 张会军 李旻 李敏
单位：邹丽(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)；朱剑文(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)；张会军(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)；李旻(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)；李敏(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)
关键词：孕妇外周血；单个胎儿有核红细胞；引物延伸预扩增；产前诊断
临床血液学杂志000411 摘要 目的：获取孕妇外周血中的极少量胎儿有核红细胞(NRBC)，并进行单个NRBC的基因分析，探讨其在产前基因诊断中的价值。方法：将孕妇外周血进行不连续密度梯度离心，将分离后的细胞进行制片，光学显微镜下识别NRBC，然后用显微操作仪获取单个NRBC进行引物延伸预扩增(PEP)及Y染色体特异性DYZ1基因的聚合酶链反应(PCR)，以确定其来源于胎儿。结果：单个NRBC的PEP-PCR法检测结果，60%检出DYZ1的特异性条带，而单用PCR法则均未检出特异性DYZ1条带。结论：用母血中单个胎儿NRBC进行产前基因诊断是可行的。
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Genetic analysis of single fetal nucleated
red blood cell from maternal blood
ZOU Li ZHU Jian-wen ZHANG Hui-jun LI-Min LI-Min
(Department of Obstetrics and Gynaecology,Xiehe Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022)
Abstract Objective:To study the feasibility of usintg single fetal nucleated red blood cell(NRBC) for prenatal genetic analysis.Method:Fetal cells were isolated from maternal blood with discontinuous density gradient centrifugation.Single NRBC was found and retrieved using a micromanipulator under a microscope.To determine whether the origin of the NRBC was maternal of fetal,the single NRBC was analysed by primer extension preamplification(PEP)and polymerase chain reaction(PCR)to determine the presence of a Y-chromosome-specific repeat sequence.Result:We have determined the presence of DYZ1 specific repeat sequence by single NRBC. The male pregnancy was correctly predicted in 60%.Conclusion:Using single fetal NRBC for prenatal genetic analysis is feasible.
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Key words Maternal peripheral blood Single fetal nucleated red blood cell Primer extension preamplification Prenatal diagnosis
目前认为孕妇外周血中的单个胎儿有核红细胞(NRBC)作为胎儿遗传物质的来源可用于无创性产前基因诊断〔1、2〕。本实验为尝试在单个细胞水平对胎儿基因进行产前分析，采用显微操作法从孕妇外周血纯化胎儿遗传物质，并期望用一个微量样本来完成多个位点的基因分析，所得结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
采自无贫血等并发症的孕妇外周血7 ml(共44例)，置于盛有EDTA抗凝剂的无菌试管中，生理盐水等倍稀释后备用；另外各选3名正常男性及无生育史的正常女性作为阳性及阴性对照。
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1.2 方法
1.2.1 显微操作法获取单个NRBC：不连续密度梯度离心富集胎儿NRBC，所用分离介质为Pharmaci公司生产的Percoll细胞分离液，依Takabayashi法〔3〕进行。将分离后的细胞制成涂片，May-Giemsa复合染色法染色，光学显微镜下识别NRBC，然后用微操作仪(日本Narishige产品)吸取之，置于装有10 μl蒸馏水的离心管中，-20 ℃保存备用。
1.2.2 DNA提取及引物延伸预扩增(PEP)：将上述获得的细胞在95 ℃下热变性30 min，随后进行碱处理(200 mmol/L KOH与50 mmol/L 二硫代苏糖醇〔3〕)65 ℃，2 min，再用中和液进行中和。参照Ferdinand法〔4〕，向反应管中加入PEP反应物。其各物质终浓度如下：400 μmol/L 15碱基对随机引物(加拿大Sangon公司生产)，0.01 g/L Gelatin，10 mmol/L Tris-HCI，pH 8.3，2 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTP，5 IU Taq多聚酶。反应体积为50 μ1。扩增程序为：92 ℃，1 min，37 ℃，2 min，37 ℃升至55 ℃(1 ℃/10 s)，55 ℃，4 min，共50循环。取10 μ1反应产物，进行下一步。
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1.2.3 DYZ1靶序列的扩增：聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)参照Takabaya-
shi法〔5〕，引物选自人Y染色体长臂特异性重复序列DYZ1区的一部分，扩增片段长度为149 bp。引物序列为：Y1.1：5′-TCC ACT TTA TTC CAG GCC TGT CC-3′，Y1.2：5′-TTG AAT GGA ATG GGA ACG AAT GG-3′ 反应总体积50 μ1，条件为：94 ℃，30 s，64 ℃，90 s，共40循环，72 ℃，15 min。取扩增产物10 μ1，加溴酚蓝2 μl，混匀，点样于2%含有EB(溴化乙锭)的琼脂糖凝胶上电泳，100 V，30 min，紫外灯下观察结果，照相记录。每次扩增均以1例无妊娠史的女性及1例男性外周血DNA作阴性和阳性对照。
2 结果
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2.1 母血中NRBC出现频率
44例孕妇中，有26例检出NRBC。检出数量为4～20个不等，平均8个。另外3例正常未孕女性及3例正常男性的外周血中均未检出NRBC。
2.2 PEP及PCR结果
将获取的单个NRBC(18例)行PEP后，有11例出现有非特异性的扩增带，继续行PCR，结果有6例扩增出Y染色体的特异性片段，其余5例则未扩增出。结合临床胎儿性别，男胎符合率为60%(6/10)。见图1。
图1 PEP-PCR扩增产物电泳结果
1.DNA相对分子量标记，2.阳性对照，3.阴性对照，4.孕20周男胎单个NRBC，5.孕15周男胎单个NRBC，6.孕19周女胎单个NRBC，7.孕17周女胎单个NRBC，8.孕20周男胎单个NRBC(示阴性结果)
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2.3 PCR结果
将获取的单个NRBC全部用于PCR，结果均未扩增出Y染色体的特异性片段。
3 讨论
3.1 母血中单个胎儿NRBC的获取
目前，识别母血中胎儿细胞主要应用单克隆抗体识别技术，包括荧光激活细胞分离法(FACS)和磁激活细胞分离法(MACS)，由于此类方法均存在抗体特异性的问题且分离纯度低，无法实用于临床。在本研究中，我们采用了显微操作法获取单个NRBC，并用PEP-PCR扩增法证实了6例男性胎儿。因此我们认为从形态学上对胎儿NRBC进行识别，再用显微操作法获取单个NRBC，是纯化母血中胎儿遗传物质较准确而可行的方法。
3.2 PEP-PCR扩增技术在单个NRBC基因诊断中的应用
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引物延伸预扩增法(primer extension prea-mplification,PEP)〔5〕是一种通过随机引物将细胞克隆或单个细胞进行全基因组扩增，有效地使模板DNA的含量达到足以被检测水平的方法。在此基础上再进行特异序列的扩增，即聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)即可完成对微量靶基因的分析。本研究经PEP-PCR扩增证实NRBC的胎儿来源，其检出率为60%，而单用PCR法无一例被检出。这说明PEP-PCR法用于单个NRBC的基因分析是可行的，它对于用孕妇外周血中极少量的胎儿遗传物质进行产前基因诊断十分重要，使一个样本完成多个位点的基因分析成为可能。
3.3 单个NRBC基因诊断在产前诊断中的意义
单个NRBC基因诊断的最终目的是为了无创性地对产前先天性疾病进行诊断及处理。目前国内外的研究均尚处于起步阶段，但也有个别检出的报道。在染色体异常的预测方面，Price等〔6〕从孕10周孕妇外周血NRBC中用FISH法诊断了18三体及21三体胎儿。在单基因疾病的预测方面，Kimura等〔7〕用PEP-PCR法诊断了8～10孕周胎儿的Duchenne型肌营养不良。在胎儿Rh状态的预测方面，Geifman-Hlotzman等〔8〕报道预测胎儿Rh状态的特异性为100%，敏感性为84%。本次实验中单细胞PEP-PCR法的成功为今后广泛用于产前诊断及进一步的深入研究提供了理论及技术基础。
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国家教委留学回国人员启动基金资助项目(No.96644)和卫生部回国人员启动基金资助项目(No. 9602412)
参考文献
[1]Bianchi D W.Clinical trials and experience:Boston.Ann N Y Acad Sci,1994,731～792
[2]Sekizawa A,Samura O,Zhen D K,et al.Fetal cell recycling:diagnosis of gender and RhD genotype in the same fetal cell retieved from matemal blood.Am J Obstet Gynecol,1999,181:1237～1242
[3]Takabayashi H,Kuwabara S,Ukita T,et al.Development of non-invasive fetal DNA diagnosis from matemal blood.Prenatal Diagnosis,1995,15:74～77
, 百拇医药
[4]Von Eggeling F,Susannb M,Michael G,et al.Determination of the origin of singl nucleated cells in matemal circulation by means of random PCR and a set of length polymorphisms.Hum Genet,1997,99:266～270
[5]Zhang L,Cui X F, Schmitt K,et al.Whole genome amplification from a single cell:implications for genetic analysis.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:5847
[6]Price J Q,Elias S,Wachtel S S,et al.Perinatal diagnosis with fetal cells isolated from matemal blood by multiparameter flow cytomety.Am J Obstet Gynecol,1991,165:1731～1737
, 百拇医药
[7]Kimura T,Sekizawa A,Taguti A,et al.Prenatal diagnosis of Duchenme muscuar dystrophy using single fetal cell in matemal blood.Nippon Rinsho,1997,55:3137～3141
[8]Geifman-Holtzman O,Bennstein I M,Berry S M,et al.Fetal RhD genotyping in fetal cells flow soted from matemal blood.Am J Obstet Gynecl,1996,174:818～822
(收稿 2000-05-24), 百拇医药
单位：邹丽(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)；朱剑文(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)；张会军(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)；李旻(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)；李敏(同济医科大学附属协和医院妇产科武汉，430022)
关键词：孕妇外周血；单个胎儿有核红细胞；引物延伸预扩增；产前诊断
临床血液学杂志000411 摘要 目的：获取孕妇外周血中的极少量胎儿有核红细胞(NRBC)，并进行单个NRBC的基因分析，探讨其在产前基因诊断中的价值。方法：将孕妇外周血进行不连续密度梯度离心，将分离后的细胞进行制片，光学显微镜下识别NRBC，然后用显微操作仪获取单个NRBC进行引物延伸预扩增(PEP)及Y染色体特异性DYZ1基因的聚合酶链反应(PCR)，以确定其来源于胎儿。结果：单个NRBC的PEP-PCR法检测结果，60%检出DYZ1的特异性条带，而单用PCR法则均未检出特异性DYZ1条带。结论：用母血中单个胎儿NRBC进行产前基因诊断是可行的。
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Genetic analysis of single fetal nucleated
red blood cell from maternal blood
ZOU Li ZHU Jian-wen ZHANG Hui-jun LI-Min LI-Min
(Department of Obstetrics and Gynaecology,Xiehe Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022)
Abstract Objective:To study the feasibility of usintg single fetal nucleated red blood cell(NRBC) for prenatal genetic analysis.Method:Fetal cells were isolated from maternal blood with discontinuous density gradient centrifugation.Single NRBC was found and retrieved using a micromanipulator under a microscope.To determine whether the origin of the NRBC was maternal of fetal,the single NRBC was analysed by primer extension preamplification(PEP)and polymerase chain reaction(PCR)to determine the presence of a Y-chromosome-specific repeat sequence.Result:We have determined the presence of DYZ1 specific repeat sequence by single NRBC. The male pregnancy was correctly predicted in 60%.Conclusion:Using single fetal NRBC for prenatal genetic analysis is feasible.
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Key words Maternal peripheral blood Single fetal nucleated red blood cell Primer extension preamplification Prenatal diagnosis
目前认为孕妇外周血中的单个胎儿有核红细胞(NRBC)作为胎儿遗传物质的来源可用于无创性产前基因诊断〔1、2〕。本实验为尝试在单个细胞水平对胎儿基因进行产前分析，采用显微操作法从孕妇外周血纯化胎儿遗传物质，并期望用一个微量样本来完成多个位点的基因分析，所得结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
采自无贫血等并发症的孕妇外周血7 ml(共44例)，置于盛有EDTA抗凝剂的无菌试管中，生理盐水等倍稀释后备用；另外各选3名正常男性及无生育史的正常女性作为阳性及阴性对照。
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1.2 方法
1.2.1 显微操作法获取单个NRBC：不连续密度梯度离心富集胎儿NRBC，所用分离介质为Pharmaci公司生产的Percoll细胞分离液，依Takabayashi法〔3〕进行。将分离后的细胞制成涂片，May-Giemsa复合染色法染色，光学显微镜下识别NRBC，然后用微操作仪(日本Narishige产品)吸取之，置于装有10 μl蒸馏水的离心管中，-20 ℃保存备用。
1.2.2 DNA提取及引物延伸预扩增(PEP)：将上述获得的细胞在95 ℃下热变性30 min，随后进行碱处理(200 mmol/L KOH与50 mmol/L 二硫代苏糖醇〔3〕)65 ℃，2 min，再用中和液进行中和。参照Ferdinand法〔4〕，向反应管中加入PEP反应物。其各物质终浓度如下：400 μmol/L 15碱基对随机引物(加拿大Sangon公司生产)，0.01 g/L Gelatin，10 mmol/L Tris-HCI，pH 8.3，2 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTP，5 IU Taq多聚酶。反应体积为50 μ1。扩增程序为：92 ℃，1 min，37 ℃，2 min，37 ℃升至55 ℃(1 ℃/10 s)，55 ℃，4 min，共50循环。取10 μ1反应产物，进行下一步。
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1.2.3 DYZ1靶序列的扩增：聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)参照Takabaya-
shi法〔5〕，引物选自人Y染色体长臂特异性重复序列DYZ1区的一部分，扩增片段长度为149 bp。引物序列为：Y1.1：5′-TCC ACT TTA TTC CAG GCC TGT CC-3′，Y1.2：5′-TTG AAT GGA ATG GGA ACG AAT GG-3′ 反应总体积50 μ1，条件为：94 ℃，30 s，64 ℃，90 s，共40循环，72 ℃，15 min。取扩增产物10 μ1，加溴酚蓝2 μl，混匀，点样于2%含有EB(溴化乙锭)的琼脂糖凝胶上电泳，100 V，30 min，紫外灯下观察结果，照相记录。每次扩增均以1例无妊娠史的女性及1例男性外周血DNA作阴性和阳性对照。
2 结果
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2.1 母血中NRBC出现频率
44例孕妇中，有26例检出NRBC。检出数量为4～20个不等，平均8个。另外3例正常未孕女性及3例正常男性的外周血中均未检出NRBC。
2.2 PEP及PCR结果
将获取的单个NRBC(18例)行PEP后，有11例出现有非特异性的扩增带，继续行PCR，结果有6例扩增出Y染色体的特异性片段，其余5例则未扩增出。结合临床胎儿性别，男胎符合率为60%(6/10)。见图1。
图1 PEP-PCR扩增产物电泳结果
1.DNA相对分子量标记，2.阳性对照，3.阴性对照，4.孕20周男胎单个NRBC，5.孕15周男胎单个NRBC，6.孕19周女胎单个NRBC，7.孕17周女胎单个NRBC，8.孕20周男胎单个NRBC(示阴性结果)
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2.3 PCR结果
将获取的单个NRBC全部用于PCR，结果均未扩增出Y染色体的特异性片段。
3 讨论
3.1 母血中单个胎儿NRBC的获取
目前，识别母血中胎儿细胞主要应用单克隆抗体识别技术，包括荧光激活细胞分离法(FACS)和磁激活细胞分离法(MACS)，由于此类方法均存在抗体特异性的问题且分离纯度低，无法实用于临床。在本研究中，我们采用了显微操作法获取单个NRBC，并用PEP-PCR扩增法证实了6例男性胎儿。因此我们认为从形态学上对胎儿NRBC进行识别，再用显微操作法获取单个NRBC，是纯化母血中胎儿遗传物质较准确而可行的方法。
3.2 PEP-PCR扩增技术在单个NRBC基因诊断中的应用
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引物延伸预扩增法(primer extension prea-mplification,PEP)〔5〕是一种通过随机引物将细胞克隆或单个细胞进行全基因组扩增，有效地使模板DNA的含量达到足以被检测水平的方法。在此基础上再进行特异序列的扩增，即聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)即可完成对微量靶基因的分析。本研究经PEP-PCR扩增证实NRBC的胎儿来源，其检出率为60%，而单用PCR法无一例被检出。这说明PEP-PCR法用于单个NRBC的基因分析是可行的，它对于用孕妇外周血中极少量的胎儿遗传物质进行产前基因诊断十分重要，使一个样本完成多个位点的基因分析成为可能。
3.3 单个NRBC基因诊断在产前诊断中的意义
单个NRBC基因诊断的最终目的是为了无创性地对产前先天性疾病进行诊断及处理。目前国内外的研究均尚处于起步阶段，但也有个别检出的报道。在染色体异常的预测方面，Price等〔6〕从孕10周孕妇外周血NRBC中用FISH法诊断了18三体及21三体胎儿。在单基因疾病的预测方面，Kimura等〔7〕用PEP-PCR法诊断了8～10孕周胎儿的Duchenne型肌营养不良。在胎儿Rh状态的预测方面，Geifman-Hlotzman等〔8〕报道预测胎儿Rh状态的特异性为100%，敏感性为84%。本次实验中单细胞PEP-PCR法的成功为今后广泛用于产前诊断及进一步的深入研究提供了理论及技术基础。
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国家教委留学回国人员启动基金资助项目(No.96644)和卫生部回国人员启动基金资助项目(No. 9602412)
参考文献
[1]Bianchi D W.Clinical trials and experience:Boston.Ann N Y Acad Sci,1994,731～792
[2]Sekizawa A,Samura O,Zhen D K,et al.Fetal cell recycling:diagnosis of gender and RhD genotype in the same fetal cell retieved from matemal blood.Am J Obstet Gynecol,1999,181:1237～1242
[3]Takabayashi H,Kuwabara S,Ukita T,et al.Development of non-invasive fetal DNA diagnosis from matemal blood.Prenatal Diagnosis,1995,15:74～77
, 百拇医药
[4]Von Eggeling F,Susannb M,Michael G,et al.Determination of the origin of singl nucleated cells in matemal circulation by means of random PCR and a set of length polymorphisms.Hum Genet,1997,99:266～270
[5]Zhang L,Cui X F, Schmitt K,et al.Whole genome amplification from a single cell:implications for genetic analysis.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:5847
[6]Price J Q,Elias S,Wachtel S S,et al.Perinatal diagnosis with fetal cells isolated from matemal blood by multiparameter flow cytomety.Am J Obstet Gynecol,1991,165:1731～1737
, 百拇医药
[7]Kimura T,Sekizawa A,Taguti A,et al.Prenatal diagnosis of Duchenme muscuar dystrophy using single fetal cell in matemal blood.Nippon Rinsho,1997,55:3137～3141
[8]Geifman-Holtzman O,Bennstein I M,Berry S M,et al.Fetal RhD genotyping in fetal cells flow soted from matemal blood.Am J Obstet Gynecl,1996,174:818～822
(收稿 2000-05-24), 百拇医药