地塞米松、氨甲喋呤对人眼球后成纤维细胞增殖的影响
作者：安振梅 魏松全 许淑惠 李双庆
单位：华西医科大学附一院内分泌科 610041
关键词：Graves眼病；成纤维细胞；MTT比色法
重庆医学000606
摘 要 目的 探讨地塞米松、氨甲喋呤对人眼球后成纤维细胞 增殖的影响。方法 采用体外培养人眼球后成纤维细胞(HROFb)，用M TT比色法测定HROFb增殖程度，并观察了不同浓度地塞米松、氨甲喋呤单独及联合使用对HRO Fb生长、增殖的影响。结果和结论 MTT比色法能精确反映HROFb的增 殖程度，所测定吸收值与细胞数目成正相关(r=0.996,P<0.001)，地塞米松、氨甲喋呤均可 抑制HROFb的增殖，且随剂量加大，抑制作用增强，两者联合使用可减少用量，增加抑制作 用。
The Influences of Dexamethasone and Methotrexate on the Proli feration of Human Retro-ocular Fibroblasts
, 百拇医药
An Zhenmei,Wesi Songquan Xu Shuhuei Li Shuangqing
(Division of Endocrinolgy,The First Afflilaten Hospital of W est China University of Medical Sciences,Chengdu,Si Chuan 610041)
Abstract Objective:Study on the influences of Dexa methasone and Methotrexate on the proliferation of human retro-ocular fibroblast s(HROFb).Methods:HROFb was cultured and MTT colorimetry as say was used to determine the proliferation of HROFb, the influences of Dexameth asone and methotrexate on the proliferation of HROFb was observed in vitro.Results and Conclusion: MTT colorimetry assay could precisely r eflect the proliferation of HROFb. The absorbance was directly proportional to t he mumbers of the cells(r=0.996,P<0.001),the proliferation of HROFb was inhibite d by Dexamethasone and Methotrexate respectively. The inhibitory effects wer e stronger when the levels of the agents were higher. Combination of Demethasone and Methoerexate could enhance the inhibitory effects with smaller doses of two agents.
, 百拇医药
Key words:Graves ophthalmopathy Fibroblasts MTT colorim etry assay
Graves眼病(Graves' ophthalmopathy, GO)的临床表现有眼睑水肿、突眼、复视，严重者视 力下降，甚至失明。目前认为GO是一种自身免疫性疾病。人眼球后成纤维细胞(human retro -ocular fibroblasts, HROFb)是免疫攻击的靶细胞，HROFb受免疫刺激合成吸水性较强的氨 基多糖，最终使眼球后内容物体积增大，出现GO表现[1]。糖皮质激素是治疗GO的 主要药物，但单独使用的有效率仅约2/3左右，因此，为提高疗效，联合用药是一种可行的 方法之一，为此，本实验在培养HROFb的基础上观察了地塞米松及氨甲喋呤单独与联合使用 对HROFb增殖的影响，现将结果报道如下：
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 主要材料
PRMI1640培养粉、[3-4，5-甲基噻唑-2]2，5-二苯基四氮唑(MTT)、胰蛋白酶 均购自美国Sigma公司；二氧化碳培养箱(美国Forrna scientitic)；酶联免疫测定仪(国营 华东电子管厂)。
眼球后结缔组织取自于意外死亡的无Graves病者(n=3)。
1.2 方法
1.2.1 HROFb的原代培养及传代
球后结缔组织用含青链霉素的RPMI1640培养液清洗数遍，剪成1mm3大小组织块，加入含20 %小牛血清的RPMI1640培养液，5%CO2培养箱中培养，细胞铺满培养瓶底时即用0.25%胰蛋 白酶-0.02%DETA消化传代，取第四代HROFb进行实验用。
, 百拇医药
1.2.2 MTT比色法测定HROFb增殖程度
用96孔培养板，实验组每孔接种不同数量的HROFb细胞(1250-15000个/孔，平行六孔)，待细 胞贴壁后吸尽旧培养液培养6小时，加入0.5%MTT20μl后继续培养4小时，最后吸尽培养液 ，加入二甲亚砜，振荡至紫色结晶完全溶解，用酶标仪测定每孔的OD值(选择波长570nm,参 考波长630nm)。空白组不加细胞，余相同。
1.2.3 MTT比色法检测不同浓度地塞米松、氨甲喋呤HROFb对增殖的影响
用96孔板，每孔(实验组、对照组)接种相同数量的上述HROFb细胞(平行6孔)待细胞贴壁后吸 尽旧培养液，分别加入(对照组不加)含有不同浓度的地塞米松、氨甲喋呤及地塞米松与氨甲 喋呤的混合物的培养液培养48小时后，再按上述MTT比色法测定HROFb的增殖情况。空白组不 加细胞，其余相同。
, 百拇医药
1.3 统计学分析：数据用
±S表示，采用两样本均数t检 验。
2 结果
2.1 HROFb增殖程度测定
表1为MTT法测定培养后培养板每孔的OD值，OD值与细胞的数量成正相关(r=0.966,P<0.001) 。
表1 不同数量HROFb与吸光度(OD)
HROFb细胞数/孔
0
1250
2500
, 百拇医药
5000
7500
10000
15000
OD(
±S)
0
0.033±0.003
0.065±0.006
0.135±0.008
0.195±0.011
0.262±0.013
, 百拇医药
0.395±0.011
2.2 地塞米松(DM)对HROFb增殖的影响表2 不同浓度地塞米松对HROFb增殖的影响
对照组
实验组 (DM浓度mg/L)
0
0.025
0.25
2.5
25
OD(±S)
, 百拇医药 0.248±0.009
0.233±0.012
0.191±0.13
0.183±0.011
0.143±0.021
抑制率(%)
6.05%
22.98%
26.21%
42.34%
t检验
P>0.05
, 百拇医药
P<0.05
P<0.01
P<0.01
2.3 氨甲喋呤(MTX)对HROFb增殖的影响表3 不同浓度氨甲喋呤对HROFb增殖的影响(mg/L)
对照组
实验组 (MTX浓度mg/L)
0
0.025
0.25
2.5
25
OD(±S)
, http://www.100md.com
0.248±0.009
0.201±0.011
0.187±0.012
0.154±0.017
0.141±0.010
抑制率(%)
18.95%
24.60%
37.90
43.15
t检验
P>0.05
, 百拇医药
P<0.05
P<0.01
P<0.01
2.4 地塞米松-氨甲喋呤混合物对HROFb增殖的影响表4 不同浓度地塞米松-氨甲喋呤对HROFb增殖的影响
对照组
实验组 (DM-MTX浓度mg/L)
0
0.0125
0.125
1.25
12.5
, 百拇医药
OD(±S)
0.248±0.09
0.193±0.006
0 .153±0.012
0.123±0.015
0.091±0.026
抑制率(%)
22.18
38.31
50.40%
63.31%
, 百拇医药
t检验
P<0.01
P<0.01
P<0.01
P<0.01
3 讨论
Bahn等[2]首先报道了Graves眼病(GO)眼球后成纤维细胞(HROFb)的培养，建立了G O体外研究模型，采用掺入法测定HROFb合成GAG的量。本实验用MTT比色法测定HROFb的增殖 程度[3]，其原理是利用活细胞内与NADP有关的脱氢酶可将介质中黄色的MTT还原 为不溶性蓝紫色结晶物-甲，用二甲基亚砜溶解后，可测定其光吸收值(OD)，从而间接反 映活细胞数，该方法灵敏度高，操作简便，无污染，适用于几乎所有活细胞(红细胞除外)的 测定。本研究结果显示采用MTT法测定的OD值与HROFb数量呈直线正相关(r＝0.996，P<0.01 )，较好地反映了成纤维细胞的增殖程度[3]。
, http://www.100md.com
既往研究证实地塞米松不但可抑制成纤维细胞增殖还可抑制其合成氨基多糖合成与释放 [4]。而氨甲喋呤为叶酸抑制剂，可使细胞DNA合成障碍，还可干扰RNA和蛋白质的生物 合成，本实验证实地塞米松及氨甲喋呤对HROFb的增殖均有一定抑制作用，该作用随着药物 浓度的增加而增强，当地塞米松与氨甲喋呤联合应用时，在各自浓度减半的情况下，抑制HR OFb增殖的作用也明显增强。该结果表明：地塞米松与氨甲喋呤联合用药对HROFb增殖的抑制 作用较单一用药具有效果更明显，用药剂量更小的优点。
糖皮质激素主要作用为抗炎及免疫抑制作用，在50年代就用于GO的治疗，但其单独使用治疗 GO的有效率仅约2/3左右，且需要量较大，撤退后易出现症状反弹[5]，因此联合 用药成为提高GO治疗效果的方法之一。在国内有作者[6]联合使用地塞米松及氨甲 喋呤等治疗GO，可使免疫抑制作用加强，糖皮质激素用量可相应减少，且氨甲喋呤也是有抗 炎作用，该方案能使大多数GO患者眼部症状与体征获得明显改善，对眼球突度的回缩，改善 眼肌麻痹及复视等均有较好的效果，也未见明显毒副作用，药物价廉，实用性强，本研究结 果认为，糖皮质激素与氨甲喋呤联合用药可作为GO治疗的常规方法。
, 百拇医药
参考文献
1，Bahn RS. The fibroblast in the target cell in the connective t issue manifestations of disease.Int-Arch-Allergy-Immunol,1995,106(3):213
2，Banh RS, Gorman CA, Woloschar GE, et al. Human retro-ocular fi broblasts in vitro.A model for the study of Graves' ophthalmopathy. J of Clinic al Endo Crinology and metabolism,1987,65(4):665
3，Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and su rvival:Application to proliferation and cytotoxicity assay. J of Immunological M ethods,1989,65:55
, 百拇医药
4，Smith TJ, Bahn RS, Gorman CA. Connective tissue glycosaminogly cans,and diseases of the thyroid. Endocr Rev,1989,10:366
5，Burch HB, Wartofsky L. Graves'ophthalmopathy:current concepts regarding pathogenesis and managemant. Endocr Rev,1993,747
6，魏松全，童楠伟，罗清礼，等.DMPA方案在Graves眼病的治疗效果.华 西医科大学学报，1996，27：306
, 百拇医药
单位：华西医科大学附一院内分泌科 610041
关键词：Graves眼病；成纤维细胞；MTT比色法
重庆医学000606
摘 要 目的 探讨地塞米松、氨甲喋呤对人眼球后成纤维细胞 增殖的影响。方法 采用体外培养人眼球后成纤维细胞(HROFb)，用M TT比色法测定HROFb增殖程度，并观察了不同浓度地塞米松、氨甲喋呤单独及联合使用对HRO Fb生长、增殖的影响。结果和结论 MTT比色法能精确反映HROFb的增 殖程度，所测定吸收值与细胞数目成正相关(r=0.996,P<0.001)，地塞米松、氨甲喋呤均可 抑制HROFb的增殖，且随剂量加大，抑制作用增强，两者联合使用可减少用量，增加抑制作 用。
The Influences of Dexamethasone and Methotrexate on the Proli feration of Human Retro-ocular Fibroblasts
, 百拇医药
An Zhenmei,Wesi Songquan Xu Shuhuei Li Shuangqing
(Division of Endocrinolgy,The First Afflilaten Hospital of W est China University of Medical Sciences,Chengdu,Si Chuan 610041)
Abstract Objective:Study on the influences of Dexa methasone and Methotrexate on the proliferation of human retro-ocular fibroblast s(HROFb).Methods:HROFb was cultured and MTT colorimetry as say was used to determine the proliferation of HROFb, the influences of Dexameth asone and methotrexate on the proliferation of HROFb was observed in vitro.Results and Conclusion: MTT colorimetry assay could precisely r eflect the proliferation of HROFb. The absorbance was directly proportional to t he mumbers of the cells(r=0.996,P<0.001),the proliferation of HROFb was inhibite d by Dexamethasone and Methotrexate respectively. The inhibitory effects wer e stronger when the levels of the agents were higher. Combination of Demethasone and Methoerexate could enhance the inhibitory effects with smaller doses of two agents.
, 百拇医药
Key words:Graves ophthalmopathy Fibroblasts MTT colorim etry assay
Graves眼病(Graves' ophthalmopathy, GO)的临床表现有眼睑水肿、突眼、复视，严重者视 力下降，甚至失明。目前认为GO是一种自身免疫性疾病。人眼球后成纤维细胞(human retro -ocular fibroblasts, HROFb)是免疫攻击的靶细胞，HROFb受免疫刺激合成吸水性较强的氨 基多糖，最终使眼球后内容物体积增大，出现GO表现[1]。糖皮质激素是治疗GO的 主要药物，但单独使用的有效率仅约2/3左右，因此，为提高疗效，联合用药是一种可行的 方法之一，为此，本实验在培养HROFb的基础上观察了地塞米松及氨甲喋呤单独与联合使用 对HROFb增殖的影响，现将结果报道如下：
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 主要材料
PRMI1640培养粉、[3-4，5-甲基噻唑-2]2，5-二苯基四氮唑(MTT)、胰蛋白酶 均购自美国Sigma公司；二氧化碳培养箱(美国Forrna scientitic)；酶联免疫测定仪(国营 华东电子管厂)。
眼球后结缔组织取自于意外死亡的无Graves病者(n=3)。
1.2 方法
1.2.1 HROFb的原代培养及传代
球后结缔组织用含青链霉素的RPMI1640培养液清洗数遍，剪成1mm3大小组织块，加入含20 %小牛血清的RPMI1640培养液，5%CO2培养箱中培养，细胞铺满培养瓶底时即用0.25%胰蛋 白酶-0.02%DETA消化传代，取第四代HROFb进行实验用。
, 百拇医药
1.2.2 MTT比色法测定HROFb增殖程度
用96孔培养板，实验组每孔接种不同数量的HROFb细胞(1250-15000个/孔，平行六孔)，待细 胞贴壁后吸尽旧培养液培养6小时，加入0.5%MTT20μl后继续培养4小时，最后吸尽培养液 ，加入二甲亚砜，振荡至紫色结晶完全溶解，用酶标仪测定每孔的OD值(选择波长570nm,参 考波长630nm)。空白组不加细胞，余相同。
1.2.3 MTT比色法检测不同浓度地塞米松、氨甲喋呤HROFb对增殖的影响
用96孔板，每孔(实验组、对照组)接种相同数量的上述HROFb细胞(平行6孔)待细胞贴壁后吸 尽旧培养液，分别加入(对照组不加)含有不同浓度的地塞米松、氨甲喋呤及地塞米松与氨甲 喋呤的混合物的培养液培养48小时后，再按上述MTT比色法测定HROFb的增殖情况。空白组不 加细胞，其余相同。
, 百拇医药
1.3 统计学分析：数据用
±S表示，采用两样本均数t检 验。2 结果
2.1 HROFb增殖程度测定
表1为MTT法测定培养后培养板每孔的OD值，OD值与细胞的数量成正相关(r=0.966,P<0.001) 。
表1 不同数量HROFb与吸光度(OD)
HROFb细胞数/孔
0
1250
2500
, 百拇医药
5000
7500
10000
15000
OD(
±S)0
0.033±0.003
0.065±0.006
0.135±0.008
0.195±0.011
0.262±0.013
, 百拇医药
0.395±0.011
2.2 地塞米松(DM)对HROFb增殖的影响表2 不同浓度地塞米松对HROFb增殖的影响
对照组
实验组 (DM浓度mg/L)
0
0.025
0.25
2.5
25
OD(
±S), 百拇医药 0.248±0.009
0.233±0.012
0.191±0.13
0.183±0.011
0.143±0.021
抑制率(%)
6.05%
22.98%
26.21%
42.34%
t检验
P>0.05
, 百拇医药
P<0.05
P<0.01
P<0.01
2.3 氨甲喋呤(MTX)对HROFb增殖的影响表3 不同浓度氨甲喋呤对HROFb增殖的影响(mg/L)
对照组
实验组 (MTX浓度mg/L)
0
0.025
0.25
2.5
25
OD(
±S), http://www.100md.com
0.248±0.009
0.201±0.011
0.187±0.012
0.154±0.017
0.141±0.010
抑制率(%)
18.95%
24.60%
37.90
43.15
t检验
P>0.05
, 百拇医药
P<0.05
P<0.01
P<0.01
2.4 地塞米松-氨甲喋呤混合物对HROFb增殖的影响表4 不同浓度地塞米松-氨甲喋呤对HROFb增殖的影响
对照组
实验组 (DM-MTX浓度mg/L)
0
0.0125
0.125
1.25
12.5
, 百拇医药
OD(
±S)0.248±0.09
0.193±0.006
0 .153±0.012
0.123±0.015
0.091±0.026
抑制率(%)
22.18
38.31
50.40%
63.31%
, 百拇医药
t检验
P<0.01
P<0.01
P<0.01
P<0.01
3 讨论
Bahn等[2]首先报道了Graves眼病(GO)眼球后成纤维细胞(HROFb)的培养，建立了G O体外研究模型，采用掺入法测定HROFb合成GAG的量。本实验用MTT比色法测定HROFb的增殖 程度[3]，其原理是利用活细胞内与NADP有关的脱氢酶可将介质中黄色的MTT还原 为不溶性蓝紫色结晶物-甲，用二甲基亚砜溶解后，可测定其光吸收值(OD)，从而间接反 映活细胞数，该方法灵敏度高，操作简便，无污染，适用于几乎所有活细胞(红细胞除外)的 测定。本研究结果显示采用MTT法测定的OD值与HROFb数量呈直线正相关(r＝0.996，P<0.01 )，较好地反映了成纤维细胞的增殖程度[3]。
, http://www.100md.com
既往研究证实地塞米松不但可抑制成纤维细胞增殖还可抑制其合成氨基多糖合成与释放 [4]。而氨甲喋呤为叶酸抑制剂，可使细胞DNA合成障碍，还可干扰RNA和蛋白质的生物 合成，本实验证实地塞米松及氨甲喋呤对HROFb的增殖均有一定抑制作用，该作用随着药物 浓度的增加而增强，当地塞米松与氨甲喋呤联合应用时，在各自浓度减半的情况下，抑制HR OFb增殖的作用也明显增强。该结果表明：地塞米松与氨甲喋呤联合用药对HROFb增殖的抑制 作用较单一用药具有效果更明显，用药剂量更小的优点。
糖皮质激素主要作用为抗炎及免疫抑制作用，在50年代就用于GO的治疗，但其单独使用治疗 GO的有效率仅约2/3左右，且需要量较大，撤退后易出现症状反弹[5]，因此联合 用药成为提高GO治疗效果的方法之一。在国内有作者[6]联合使用地塞米松及氨甲 喋呤等治疗GO，可使免疫抑制作用加强，糖皮质激素用量可相应减少，且氨甲喋呤也是有抗 炎作用，该方案能使大多数GO患者眼部症状与体征获得明显改善，对眼球突度的回缩，改善 眼肌麻痹及复视等均有较好的效果，也未见明显毒副作用，药物价廉，实用性强，本研究结 果认为，糖皮质激素与氨甲喋呤联合用药可作为GO治疗的常规方法。
, 百拇医药
参考文献
1，Bahn RS. The fibroblast in the target cell in the connective t issue manifestations of disease.Int-Arch-Allergy-Immunol,1995,106(3):213
2，Banh RS, Gorman CA, Woloschar GE, et al. Human retro-ocular fi broblasts in vitro.A model for the study of Graves' ophthalmopathy. J of Clinic al Endo Crinology and metabolism,1987,65(4):665
3，Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and su rvival:Application to proliferation and cytotoxicity assay. J of Immunological M ethods,1989,65:55
, 百拇医药
4，Smith TJ, Bahn RS, Gorman CA. Connective tissue glycosaminogly cans,and diseases of the thyroid. Endocr Rev,1989,10:366
5，Burch HB, Wartofsky L. Graves'ophthalmopathy:current concepts regarding pathogenesis and managemant. Endocr Rev,1993,747
6，魏松全，童楠伟，罗清礼，等.DMPA方案在Graves眼病的治疗效果.华 西医科大学学报，1996，27：306
, 百拇医药