测定RF双夹心ELISA试剂的制备与检定
作者：左永太 何良修 黄玉霞 吴泓舟 彭江华
单位：卫生部成都生物制品研究所(成都 610016)
关键词：
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol [中图分类号]R446.62 [文献标识码]D
[文章编号]1002-0179(1999)02-0242-01
类风湿因子(RF)首先由Rose等于1948年在类风湿关节炎病人血清中发现，是一种抗变性IgG的自身抗体。以前人们一直认为是IgM型抗体，经过实验证实，RF不仅只有IgM，还有IgG、IgA、IgD、IgE等，类风湿因子不仅存在于类风湿关节炎病人中，它还在干燥综合症等其它病种病人中占很大的比例，类风湿因子对人类的健康有严重的危害作用。因此，要对类风湿等病人进行及早的治疗，其检测方法是非常重要的，这类病人的诊断除临床症状外，还有X线诊断和血清学诊断，而仪器诊断不能发现早期病人，因此，血清学诊断就非常重要，有利于早期发现，早期治疗。血清学诊断测RF的方法早期用Woaler-Rose间接血凝法，但重复性差。现应用的方法多种多样，有胶乳凝集、激光比浊、速率比浊、放射免疫及ELISA等方法。前四种方法存在只能测IgM类RF，敏感性差，重复性不好，仪器昂贵，需专用设备和设施，对人体有一定的危害等缺陷；而ELISA法不具有以上缺陷，且可测到含五类抗体的RF，对提高检出率和对RF患者的早期诊断有重要的意义。因此本文作者研制出双夹心ELISA法测定RF的试剂，并对该试剂的基本特性进行了考证。现报道如下∶
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1 材料与方法
1.1 材料与仪器 ① 辣根过氧化物酶(HRP)；②ELISA板 四川分析仪器厂；③兔IgG：本室自制；④底物液：本室自配；⑤小牛血清白蛋白(BSA)；⑥ELISA仪：国营华东电子管厂DG3022A。
1.2 方法
1.2.1 热聚合IgG的制备 用33%饱和硫酸铵盐析后，用离子交换柱提取兔IgG，浓缩后进行热聚合，再过PBS平衡的S-400，收集第一峰测蛋白的含量，分装保存。
1.2.2 标记 改良过碘酸钠法。本室常规。
1.2.3 ELISA包被液、稀释液、洗涤液等按本室常规配制。
1.2.4 操作 ①包被∶包被一定浓度的热聚合IgG，每孔加包被物0.1ml 4℃过夜，洗涤甩干；②封闭：每孔加1%BSA4℃过夜，洗涤三次，甩干后加膜包封后4℃保存；③加标本0.1ml，设置阴性、阳性、空白对照，37℃孵育20min，洗涤后甩干；④加酶结合物：每孔100μl 37℃孵育30min，洗涤5次甩干；⑤加底物显色，终止反应；⑥阳性以大于阴性A值2.1倍为阳性。
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1.2.5 ELISA条件选择 ①包被物浓度及标记物浓度选择∶固定其它条件，包被物浓度69μg/ml与标记物浓度(1:250)，分别做2倍稀释后棋盘测定包被物与标记物浓度的最佳配比。②标本、酶及底物反应时间的观测∶固定其它条件，分别改变标本、酶标记物、底物等的反应时间，分别取反应后其A值，反应达饱和时的时间为试剂反应时间。③标本加量测量∶为了避免前带现象，取RF病人血清30份，按系列稀释，观察其A值，取接近最大反应值的稀释度为测定时标本稀释度。
1.2.6 ELISA试剂检测 ①补体对试剂的影响∶取共计40份标本，56℃ 30min灭活前、后测定A值，根据阳性例数的变化进行比较。②灵敏度测试∶取按临床指标确定为类风湿病人血清共计30份，分别用胶乳和本试剂进行测定。其灵敏度计算公式为∶%sensT=TP/(TP+FN)×100，TP—真阳，FN—假阴。 ③特异性：取无临床指征及相关疾病标本共计30份，用本试剂和胶乳进行测定。其计算公式为∶%specificity特异性=TN/(TN+FP)×100。TN—真阴性，FP—假阳性。④ELISA试剂的稳定性测定∶将试剂系统放置37℃每天测定其A值。
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2 结果 ELISA试剂的条件为
2.1 包被与标记物浓度 包被物在17.25μg/ml～69μg/ml及标记物1∶250～1000时的A值均处于最大反应A值区，我们选取20μg/ml和标记物1∶500作为应用浓度。
2.2 标本、酶、TMB反应物时间的选择 酶标记物反应时间由图1、2、3可以看出标本与酶标记物的最佳反应时间在20 min以后，但考虑到实际操作，可考虑选取30min，而TMB的最佳反应时间为10～20min，一般选择12min，反应值高且本底低。
图1.酶标记物反应时间
图2.标本反应时间
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图3.TMP反应时间
2.3 标本加样量的选择 结果表明∶30份病人血清，其中阳性均在1∶10时测出高值，如原有部份值较低，故选择1∶10加100μl可较为真实地反应RF因子的高低。
3 检测
①补体灭活前、后其阳性例数不变，故无显著差异。②特异性=29/(29+1)×100%=96.7%。③灵敏度=25/(25+5)×100%=75%〔1〕。④稳定性∶将试剂放置37℃后，测定其特异性和灵敏度，连续测定5天，其灵敏度与特异性均分别为75%和96.7%，第6天后，灵敏度下降，特异性不变，说明本试剂可放置半年〔2〕。
4 结论与讨论
本文作者采用纯化聚合兔IgG作包被物与标记物利用双夹心法测定其RF，摸索出了最佳的包被物、标本、标记物用量；且选取了最佳标本、标记物、底物的反应时间；并对其灵敏度、特异性、稳定性等进行了检测。该试剂的研制，对其它ELISA试剂的研制具有一定的启示作用。且本试剂能避免其它测定RF方法的不足；并能较早、较为客观的为临床提供辅助诊断。由于使用的是夹心法，它可以测出具有5种类免疫球蛋白的类风湿因子，从而避免漏检。如果在病人用药前、后对标本进行多次重复测定，其滴度则可反映出治疗与愈后效果，这尤其对抗类风湿类新药的研制提供较为可靠的依据。
作者简介：左永太 黄玉霞 华西医科大学附属第一医院检验科(成都 610041)
何良修 课题负责人
5 参考文献
1 Larsen SA，et al.A manual of tests For Syphilis.APHA.1990；9
2 中国生物制品规程(二部)1993；189～193
(收稿日期：1999-03-28), 百拇医药
单位：卫生部成都生物制品研究所(成都 610016)
关键词：
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol [中图分类号]R446.62 [文献标识码]D
[文章编号]1002-0179(1999)02-0242-01
类风湿因子(RF)首先由Rose等于1948年在类风湿关节炎病人血清中发现，是一种抗变性IgG的自身抗体。以前人们一直认为是IgM型抗体，经过实验证实，RF不仅只有IgM，还有IgG、IgA、IgD、IgE等，类风湿因子不仅存在于类风湿关节炎病人中，它还在干燥综合症等其它病种病人中占很大的比例，类风湿因子对人类的健康有严重的危害作用。因此，要对类风湿等病人进行及早的治疗，其检测方法是非常重要的，这类病人的诊断除临床症状外，还有X线诊断和血清学诊断，而仪器诊断不能发现早期病人，因此，血清学诊断就非常重要，有利于早期发现，早期治疗。血清学诊断测RF的方法早期用Woaler-Rose间接血凝法，但重复性差。现应用的方法多种多样，有胶乳凝集、激光比浊、速率比浊、放射免疫及ELISA等方法。前四种方法存在只能测IgM类RF，敏感性差，重复性不好，仪器昂贵，需专用设备和设施，对人体有一定的危害等缺陷；而ELISA法不具有以上缺陷，且可测到含五类抗体的RF，对提高检出率和对RF患者的早期诊断有重要的意义。因此本文作者研制出双夹心ELISA法测定RF的试剂，并对该试剂的基本特性进行了考证。现报道如下∶
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1 材料与方法
1.1 材料与仪器 ① 辣根过氧化物酶(HRP)；②ELISA板 四川分析仪器厂；③兔IgG：本室自制；④底物液：本室自配；⑤小牛血清白蛋白(BSA)；⑥ELISA仪：国营华东电子管厂DG3022A。
1.2 方法
1.2.1 热聚合IgG的制备 用33%饱和硫酸铵盐析后，用离子交换柱提取兔IgG，浓缩后进行热聚合，再过PBS平衡的S-400，收集第一峰测蛋白的含量，分装保存。
1.2.2 标记 改良过碘酸钠法。本室常规。
1.2.3 ELISA包被液、稀释液、洗涤液等按本室常规配制。
1.2.4 操作 ①包被∶包被一定浓度的热聚合IgG，每孔加包被物0.1ml 4℃过夜，洗涤甩干；②封闭：每孔加1%BSA4℃过夜，洗涤三次，甩干后加膜包封后4℃保存；③加标本0.1ml，设置阴性、阳性、空白对照，37℃孵育20min，洗涤后甩干；④加酶结合物：每孔100μl 37℃孵育30min，洗涤5次甩干；⑤加底物显色，终止反应；⑥阳性以大于阴性A值2.1倍为阳性。
, 百拇医药
1.2.5 ELISA条件选择 ①包被物浓度及标记物浓度选择∶固定其它条件，包被物浓度69μg/ml与标记物浓度(1:250)，分别做2倍稀释后棋盘测定包被物与标记物浓度的最佳配比。②标本、酶及底物反应时间的观测∶固定其它条件，分别改变标本、酶标记物、底物等的反应时间，分别取反应后其A值，反应达饱和时的时间为试剂反应时间。③标本加量测量∶为了避免前带现象，取RF病人血清30份，按系列稀释，观察其A值，取接近最大反应值的稀释度为测定时标本稀释度。
1.2.6 ELISA试剂检测 ①补体对试剂的影响∶取共计40份标本，56℃ 30min灭活前、后测定A值，根据阳性例数的变化进行比较。②灵敏度测试∶取按临床指标确定为类风湿病人血清共计30份，分别用胶乳和本试剂进行测定。其灵敏度计算公式为∶%sensT=TP/(TP+FN)×100，TP—真阳，FN—假阴。 ③特异性：取无临床指征及相关疾病标本共计30份，用本试剂和胶乳进行测定。其计算公式为∶%specificity特异性=TN/(TN+FP)×100。TN—真阴性，FP—假阳性。④ELISA试剂的稳定性测定∶将试剂系统放置37℃每天测定其A值。
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2 结果 ELISA试剂的条件为
2.1 包被与标记物浓度 包被物在17.25μg/ml～69μg/ml及标记物1∶250～1000时的A值均处于最大反应A值区，我们选取20μg/ml和标记物1∶500作为应用浓度。
2.2 标本、酶、TMB反应物时间的选择 酶标记物反应时间由图1、2、3可以看出标本与酶标记物的最佳反应时间在20 min以后，但考虑到实际操作，可考虑选取30min，而TMB的最佳反应时间为10～20min，一般选择12min，反应值高且本底低。
图1.酶标记物反应时间
图2.标本反应时间
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图3.TMP反应时间
2.3 标本加样量的选择 结果表明∶30份病人血清，其中阳性均在1∶10时测出高值，如原有部份值较低，故选择1∶10加100μl可较为真实地反应RF因子的高低。
3 检测
①补体灭活前、后其阳性例数不变，故无显著差异。②特异性=29/(29+1)×100%=96.7%。③灵敏度=25/(25+5)×100%=75%〔1〕。④稳定性∶将试剂放置37℃后，测定其特异性和灵敏度，连续测定5天，其灵敏度与特异性均分别为75%和96.7%，第6天后，灵敏度下降，特异性不变，说明本试剂可放置半年〔2〕。
4 结论与讨论
本文作者采用纯化聚合兔IgG作包被物与标记物利用双夹心法测定其RF，摸索出了最佳的包被物、标本、标记物用量；且选取了最佳标本、标记物、底物的反应时间；并对其灵敏度、特异性、稳定性等进行了检测。该试剂的研制，对其它ELISA试剂的研制具有一定的启示作用。且本试剂能避免其它测定RF方法的不足；并能较早、较为客观的为临床提供辅助诊断。由于使用的是夹心法，它可以测出具有5种类免疫球蛋白的类风湿因子，从而避免漏检。如果在病人用药前、后对标本进行多次重复测定，其滴度则可反映出治疗与愈后效果，这尤其对抗类风湿类新药的研制提供较为可靠的依据。
作者简介：左永太 黄玉霞 华西医科大学附属第一医院检验科(成都 610041)
何良修 课题负责人
5 参考文献
1 Larsen SA，et al.A manual of tests For Syphilis.APHA.1990；9
2 中国生物制品规程(二部)1993；189～193
(收稿日期：1999-03-28), 百拇医药