前列腺癌组织中转化性生长因子β2含量的研究*
作者：刘运初 吴二平 李清 詹炳炎 王玲珑
单位：刘运初 詹炳炎 王玲珑 吴二平(湖北医科大学第一附属医院妇产科，武汉 430060)；李清(湖北省当阳市人民医院外科，当阳 444100)
关键词：双抗体夹心ELISA；前列腺癌；前列腺增生；转化性生长因子β2
同济医科大学学报000219 摘要：采用双抗体夹心法ELISA测定了20例前列腺癌和20例前列腺增生(BPH)患者前列腺组织提取物 中转化性生长因子β2(TGF-β2)的含量。结果发现：前列腺癌组织中的TGF-β2 的含量[(1864.6±566.9) ng/g]明显高于BPH组[(1318.7±619.6) ng/g]，两个实 验组TGF-β2含量比8例正常对照[(370.8±122.6) ng/g]高得多， 差异具有显著性 意义。提示TGF-β2不仅对前列腺的生理过程具有重要的生物学作用，而且可能参与BPH 和前列腺癌的发病过程。
, http://www.100md.com
中图法分类号：R737.25， Q71
A Quantitative Study on Transforming Gro wth Factor-β2 in Tissue of Prostatic Cancer
Liu Yunchu, Wu Erping, Li Qing et al
Department of Urology, The 1st Affiliated Hospit al, Hubei Medical University, Wuhan 430060
Abstract：Prostatic tissue extracts from 20 patients with prostatic carcinoma (PC) and 20 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) were quantitatively assayed for the expression of transforming growth factor-β2 (TGF-β2) by using sandw ich ELISA. The content of TGF-β2 was significantly higher in PC (1864.6±56 6.9 ng/g tissue) than in BPH (1318.7±619.6 ng/g tissue). While the content o f TGF-β2 in 8 normal prostates (370.8±122.5 ng/g tissue) was much lower t han that in both experimental groups. The findings suggest that TGF-β2 may b e biologically inportant not only in the physiological process of prostate but a lso in the pathogenesis of PC and BPH.
, 百拇医药
Key words：sandwich ELISA; prostatic cancer; prostatic hyperplasia; transforming growth factor-β2
转化性生长因子β(TGF-β)是一类具有广泛生物学活性的多肽，与前列腺的生理过程和病 理变化关系密切。实验证明转化性生长因子β1是前列腺癌的重要生物标记[1]， 而转化性生长因子β2的mRNA在前列腺增生组织中表达水平提高[2]，但迄今未见 TGF-β2在前列腺癌和前列腺增生组织中的含量的报道。为此， 我们用双抗体夹心法ELI SA定量检测了前列腺癌、BPH及正常前列腺组织提取物中TGF-β2的含量，以探讨TGF-β 2与前列腺癌和BPH的关系。
1 材料与方法
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1.1 临床资料
前列腺癌和BPH患者各20例，前者年龄56～89岁，平均72.9岁；后者年龄57～88岁，平均 70.5岁。20例前列腺癌按TNM系统分期：ToNoMo 3例，T2 NoMo 11例， T3 NoMo 4例， T4 NoMo 2例，按Gleason评分系统分级：低分化(8～10分)6例，中分化(5～7分)11例，高 分化(2～4分)3例，标本均经开放手术获得。8例正常前列腺标本取自因交通事故死亡的老年 男性。
1.2 TGF-β2的提取
每一标本取约3 g组织，以150 mmol/L氯化钠溶液洗3次并吸干，将其剪成1 mm×1 mm× 1 mm大小，以液氮快速冷冻后立即用微肢解器粉碎制成粉末组织。 每一标本称取50 mg组织 粉末，每份加入2 ml提取液 (275 mmol/L 氯化钠， 75 mmol/L 氯化钾，10 mmol/L EDTA， 100 mmol/L L-精氨酸，2.5 g/L吐温-80，冰醋酸调pH至4.0， 以匀化器匀化20 s和1 5 s(其间间歇1 min)制成组织匀浆， 组织匀浆置冰上平衡1 h 。 以13 000 r/min离心匀浆 物3 min，上清液分装后以液氮快速冷冻，然后贮存于-70 ℃待用。取10份粉末组织标本， 每份加入2 ml提取液及1000 cpm 125I TGF-β2(Amersham，英国)，然后按上述 提取过程进行操作，取离心后的上清液以γ-计数器测放射活性，并计算回收率。
, 百拇医药
1.3 双抗体夹心法ELISA测TGF-β2
抗TGF-β2中和抗体(British Biotec英国)80 μg/ml溶于10×TBS(45 g氯化钠，6. 06 g Tris碱基，蒸馏水加至500 ml，调pH至7.4)，25 μl/孔分别包被96孔ELISA板4 ℃过 夜；次日以TBS(500 ml含氯化钠4.5 g Tris碱基0.606 g，调pH至7.4)洗涤3次，加入35 0 μl/孔TBS/30 g/L BSA封闭，室温下孵化1 h；TBS 洗3次后加标准抗原即入TGF-β2( 为British Biotice)产品，以TBS分别配成100、75、50、37.5、25、12.5、6.25、3.12 5及1 ng/ml)和前列腺组织提取物，100 μl/孔，每份标本加3孔，并设空白对照，室温孵化 2 h；经洗涤液(TBS/30 g/L BSA)洗3次，加入TBS/30 g/L BS A 稀释的免抗人TGF-β2探 测抗体(British Biotec英国，1 μg/ml)100 μl/孔， 于室温在摇动器上摇动孵化1 h；加 入HRP-驴抗兔IgG(SAPU英国，TBS/30 g/L BSA 稀释至1:2500)100 μl/孔，于室温摇动孵 化1 h；TBS/30 g/L BSA洗3次， 以临时配制的OPD(Sigma)底物液(1 mg溶解于25 ml 0.1 mol/L磷酸氢二钠/0.05 mol/L 枸橼酸溶液中，调pH至5.0，临用前加30 μl 27.5% H2 O2)100 μl/孔，孵化15～20 min 直至获得适当的标准曲线，加3 mol/L盐酸100 μl/孔 终止反应；立即以96孔酶标读数仪测波长492 nm的吸光度A值；以标准品A值绘制标准曲线， 用样品A值在标准曲线上查出含量。
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2 结果
通过对含125I TGF-β2的提取物放射活性的测定，发现回收率在55.6 %～50 .7 %之间，平均为52.4 %；底物最佳显色时间在15～20 min之间；根据上面探索的工作条 件，应用双抗体夹心法ELISA分析TGF-β2浓度的标准工作曲线，方程为Y=0.03+0 .002X，r=0.992。当其浓度在1～100 ng/ml范围内，线性关系良好，相关系数最 高达0.995，阴性孔A值在0.05以下，可以特异地检测到浓度为1 ng/ml的TGF-β2。
应用上述建立的ELISA方法及标准工作曲线对20例前列腺癌、20例BPH及8 例正常前列腺 组织中TGF-β2进行检测，结果表明前列腺癌组织中TGF-β2含量明显高于BPH组，而 两个实验组TGF-β2的水平均比正常前列腺组织高得多(见表1)。腺癌组内按病理分级及 临床分期进行比较，未发现TGF-β2的水平与肿瘤分级及分期有相关关系。
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表1 前列腺组织TGF-β2测定结果 组 别
例数
范围(ng/g)
±s(ng/g)
前列腺癌
20
2413.5～1326.8
1864.6±566.9
前列腺增生
20
1734.5～854.6
, 百拇医药
1318.7±324.5**
正常前列腺
8
536.9～276.5
370.8±122.6*△
与前列腺癌比较 *P<0.05 ** P<0.01
与前列腺增生比较 △ P<0.01
3 讨论
TGF-β具有广泛的生物学功能，它们对不同类型的细胞或同一类细胞，根据其细胞环 境，分化情况和各种内源性基因的表达而呈现生长刺激或抑制作用[3]。 虽然TGF -β是上 皮细胞的强力抑制剂，对体外培养的某些前列腺癌细胞表现出抑制作用[4]，然而 ，动物实 验发现TGF-β能促进移植性前列腺癌的生长[5]。它们的某些与促生长无关的特性 如抑制体 液和细胞免疫反应、促血管生成及刺激成骨细胞有丝分裂等[2,3,6]能促进癌的浸 润和转移，因此TGF- β对前列腺癌综合作用的最终结果可能不是抑制而是促进其生长。
, 百拇医药
Hirataka发现TGF-β2在BPH组织中的表达比在正常前列腺组织中的表达增加，提示T GF- β2可能参与BPH的发病过程[2]。本研究亦发现BPH组织中的TGF-β2含量明显 高于正常前列 腺组织，而TGF-β2在前列腺癌组织中的含量明显高于BPH组，提示TGF-β2不仅与BPH 的发病有关，而且可能对前列腺癌的发生和发展起作用。
动物模型体内试验显示相关的肿瘤基因和生长因子既能诱导癌前病变，也能诱导癌肿发 生[7]。本研究虽然未能肯定TGF-β2与前列腺癌和前列腺增生的因果关系，但 联系其生物学 特征，可以说明以下问题：①基质增生是BPH的主要病理特征，而BPH组织中TGF-β2水平 的 升高，由于TGF-β2具有促进基质细胞生长和细胞外基质积淀的特性，说明前列腺增生是 一 种基质疾病，它是前列腺基质胚胎性促生长活动重新唤醒的结果；②已有的文献资料均说明 间质起源的组织能影响上皮的胚胎发展，而前列腺增生组织中高水平TGF-β2的存在有可 能通过旁分泌作用而促进后续前列腺癌的发生和发展；③已有人在体外培养的前列腺癌细 胞 系的培养液中分离出TGF-β2[8]，而本研究发现TGF-β2在前列腺癌组织的 过 度表达提示前列腺癌细胞已获得产生自身TGF-β的能力，这对于增加肿瘤进展和浸润的自 主性是十分重要的。
, 百拇医药
本研究中建立的ELISA方法检测前列腺组织提取物中的TGF-β2，具有灵敏度高，特 异性强，重复性好，标准曲线线性关系好等优点，TGF-β2水平可作为前列腺癌诊断的参 考指标，本文建立的方法学亦可用于其它组织和体液中各种TGF-β的检测。
刘运初，男，1956年生，副教授， 副主任医师
参考文献
1，Thompson T C, Truong L D. Transforming growth factor β1 as a biomarker of prostate cancer. J Cellular Bioche, 1992, 16H(Suppl):54
2，Hirotaka M. Increased expression of genes for basic fibroblast factor type β 2 in human prostatic hyperplasia. Prostate, 1990, 16:71
, 百拇医药
3，Barnald J A, Lyons R M, Moses H L. The cell biology of transforming growth factor beta. Biochim Biophy Acta, 1990, 1032:79
4，Thompson T C.Growth factor and oncogenes in prostate cancer .Cancer Cells, 1990, 2:345
5，Steiner M S, Barrack E R. Transforming growth factor-β1 over - production in prostate cancer: effects on growth in vivo and in vitro.Mol Endoc rinol, 1992, 6: 15
6，Centralla M, McCarthy T L, Canalis E. Transforming growth factor beta is a bifunctional regulator of replication and collagen synthesis in osteo blast-enriched cell cultures from fetal rat bone. J Bio Chem, 1987, 262:2869
, http://www.100md.com
7，Merz V W, Miller G J, Kadmon D et al. Elevated TGF-β1 mR NA levels are associated with ras+ myc-induced carcinomas in recontituted mouse prostate: Evidence for paracrine role during progression. Mol Endocrinol, 1 991, 5: 503
8，Ikeda T, Lioubin M N, Marquardt H. Human transforming growth factor type β2: production by a prostatic adenocarcinoma cell line, purific ation and initial characterization. Biochemistry, 1987,26:2406
(收稿：1998-12-05), 百拇医药
单位：刘运初 詹炳炎 王玲珑 吴二平(湖北医科大学第一附属医院妇产科，武汉 430060)；李清(湖北省当阳市人民医院外科，当阳 444100)
关键词：双抗体夹心ELISA；前列腺癌；前列腺增生；转化性生长因子β2
同济医科大学学报000219 摘要：采用双抗体夹心法ELISA测定了20例前列腺癌和20例前列腺增生(BPH)患者前列腺组织提取物 中转化性生长因子β2(TGF-β2)的含量。结果发现：前列腺癌组织中的TGF-β2 的含量[(1864.6±566.9) ng/g]明显高于BPH组[(1318.7±619.6) ng/g]，两个实 验组TGF-β2含量比8例正常对照[(370.8±122.6) ng/g]高得多， 差异具有显著性 意义。提示TGF-β2不仅对前列腺的生理过程具有重要的生物学作用，而且可能参与BPH 和前列腺癌的发病过程。
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中图法分类号：R737.25， Q71
A Quantitative Study on Transforming Gro wth Factor-β2 in Tissue of Prostatic Cancer
Liu Yunchu, Wu Erping, Li Qing et al
Department of Urology, The 1st Affiliated Hospit al, Hubei Medical University, Wuhan 430060
Abstract：Prostatic tissue extracts from 20 patients with prostatic carcinoma (PC) and 20 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) were quantitatively assayed for the expression of transforming growth factor-β2 (TGF-β2) by using sandw ich ELISA. The content of TGF-β2 was significantly higher in PC (1864.6±56 6.9 ng/g tissue) than in BPH (1318.7±619.6 ng/g tissue). While the content o f TGF-β2 in 8 normal prostates (370.8±122.5 ng/g tissue) was much lower t han that in both experimental groups. The findings suggest that TGF-β2 may b e biologically inportant not only in the physiological process of prostate but a lso in the pathogenesis of PC and BPH.
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Key words：sandwich ELISA; prostatic cancer; prostatic hyperplasia; transforming growth factor-β2
转化性生长因子β(TGF-β)是一类具有广泛生物学活性的多肽，与前列腺的生理过程和病 理变化关系密切。实验证明转化性生长因子β1是前列腺癌的重要生物标记[1]， 而转化性生长因子β2的mRNA在前列腺增生组织中表达水平提高[2]，但迄今未见 TGF-β2在前列腺癌和前列腺增生组织中的含量的报道。为此， 我们用双抗体夹心法ELI SA定量检测了前列腺癌、BPH及正常前列腺组织提取物中TGF-β2的含量，以探讨TGF-β 2与前列腺癌和BPH的关系。
1 材料与方法
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1.1 临床资料
前列腺癌和BPH患者各20例，前者年龄56～89岁，平均72.9岁；后者年龄57～88岁，平均 70.5岁。20例前列腺癌按TNM系统分期：ToNoMo 3例，T2 NoMo 11例， T3 NoMo 4例， T4 NoMo 2例，按Gleason评分系统分级：低分化(8～10分)6例，中分化(5～7分)11例，高 分化(2～4分)3例，标本均经开放手术获得。8例正常前列腺标本取自因交通事故死亡的老年 男性。
1.2 TGF-β2的提取
每一标本取约3 g组织，以150 mmol/L氯化钠溶液洗3次并吸干，将其剪成1 mm×1 mm× 1 mm大小，以液氮快速冷冻后立即用微肢解器粉碎制成粉末组织。 每一标本称取50 mg组织 粉末，每份加入2 ml提取液 (275 mmol/L 氯化钠， 75 mmol/L 氯化钾，10 mmol/L EDTA， 100 mmol/L L-精氨酸，2.5 g/L吐温-80，冰醋酸调pH至4.0， 以匀化器匀化20 s和1 5 s(其间间歇1 min)制成组织匀浆， 组织匀浆置冰上平衡1 h 。 以13 000 r/min离心匀浆 物3 min，上清液分装后以液氮快速冷冻，然后贮存于-70 ℃待用。取10份粉末组织标本， 每份加入2 ml提取液及1000 cpm 125I TGF-β2(Amersham，英国)，然后按上述 提取过程进行操作，取离心后的上清液以γ-计数器测放射活性，并计算回收率。
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1.3 双抗体夹心法ELISA测TGF-β2
抗TGF-β2中和抗体(British Biotec英国)80 μg/ml溶于10×TBS(45 g氯化钠，6. 06 g Tris碱基，蒸馏水加至500 ml，调pH至7.4)，25 μl/孔分别包被96孔ELISA板4 ℃过 夜；次日以TBS(500 ml含氯化钠4.5 g Tris碱基0.606 g，调pH至7.4)洗涤3次，加入35 0 μl/孔TBS/30 g/L BSA封闭，室温下孵化1 h；TBS 洗3次后加标准抗原即入TGF-β2( 为British Biotice)产品，以TBS分别配成100、75、50、37.5、25、12.5、6.25、3.12 5及1 ng/ml)和前列腺组织提取物，100 μl/孔，每份标本加3孔，并设空白对照，室温孵化 2 h；经洗涤液(TBS/30 g/L BSA)洗3次，加入TBS/30 g/L BS A 稀释的免抗人TGF-β2探 测抗体(British Biotec英国，1 μg/ml)100 μl/孔， 于室温在摇动器上摇动孵化1 h；加 入HRP-驴抗兔IgG(SAPU英国，TBS/30 g/L BSA 稀释至1:2500)100 μl/孔，于室温摇动孵 化1 h；TBS/30 g/L BSA洗3次， 以临时配制的OPD(Sigma)底物液(1 mg溶解于25 ml 0.1 mol/L磷酸氢二钠/0.05 mol/L 枸橼酸溶液中，调pH至5.0，临用前加30 μl 27.5% H2 O2)100 μl/孔，孵化15～20 min 直至获得适当的标准曲线，加3 mol/L盐酸100 μl/孔 终止反应；立即以96孔酶标读数仪测波长492 nm的吸光度A值；以标准品A值绘制标准曲线， 用样品A值在标准曲线上查出含量。
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2 结果
通过对含125I TGF-β2的提取物放射活性的测定，发现回收率在55.6 %～50 .7 %之间，平均为52.4 %；底物最佳显色时间在15～20 min之间；根据上面探索的工作条 件，应用双抗体夹心法ELISA分析TGF-β2浓度的标准工作曲线，方程为Y=0.03+0 .002X，r=0.992。当其浓度在1～100 ng/ml范围内，线性关系良好，相关系数最 高达0.995，阴性孔A值在0.05以下，可以特异地检测到浓度为1 ng/ml的TGF-β2。
应用上述建立的ELISA方法及标准工作曲线对20例前列腺癌、20例BPH及8 例正常前列腺 组织中TGF-β2进行检测，结果表明前列腺癌组织中TGF-β2含量明显高于BPH组，而 两个实验组TGF-β2的水平均比正常前列腺组织高得多(见表1)。腺癌组内按病理分级及 临床分期进行比较，未发现TGF-β2的水平与肿瘤分级及分期有相关关系。
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表1 前列腺组织TGF-β2测定结果 组 别
例数
范围(ng/g)
±s(ng/g)前列腺癌
20
2413.5～1326.8
1864.6±566.9
前列腺增生
20
1734.5～854.6
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1318.7±324.5**
正常前列腺
8
536.9～276.5
370.8±122.6*△
与前列腺癌比较 *P<0.05 ** P<0.01
与前列腺增生比较 △ P<0.01
3 讨论
TGF-β具有广泛的生物学功能，它们对不同类型的细胞或同一类细胞，根据其细胞环 境，分化情况和各种内源性基因的表达而呈现生长刺激或抑制作用[3]。 虽然TGF -β是上 皮细胞的强力抑制剂，对体外培养的某些前列腺癌细胞表现出抑制作用[4]，然而 ，动物实 验发现TGF-β能促进移植性前列腺癌的生长[5]。它们的某些与促生长无关的特性 如抑制体 液和细胞免疫反应、促血管生成及刺激成骨细胞有丝分裂等[2,3,6]能促进癌的浸 润和转移，因此TGF- β对前列腺癌综合作用的最终结果可能不是抑制而是促进其生长。
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Hirataka发现TGF-β2在BPH组织中的表达比在正常前列腺组织中的表达增加，提示T GF- β2可能参与BPH的发病过程[2]。本研究亦发现BPH组织中的TGF-β2含量明显 高于正常前列 腺组织，而TGF-β2在前列腺癌组织中的含量明显高于BPH组，提示TGF-β2不仅与BPH 的发病有关，而且可能对前列腺癌的发生和发展起作用。
动物模型体内试验显示相关的肿瘤基因和生长因子既能诱导癌前病变，也能诱导癌肿发 生[7]。本研究虽然未能肯定TGF-β2与前列腺癌和前列腺增生的因果关系，但 联系其生物学 特征，可以说明以下问题：①基质增生是BPH的主要病理特征，而BPH组织中TGF-β2水平 的 升高，由于TGF-β2具有促进基质细胞生长和细胞外基质积淀的特性，说明前列腺增生是 一 种基质疾病，它是前列腺基质胚胎性促生长活动重新唤醒的结果；②已有的文献资料均说明 间质起源的组织能影响上皮的胚胎发展，而前列腺增生组织中高水平TGF-β2的存在有可 能通过旁分泌作用而促进后续前列腺癌的发生和发展；③已有人在体外培养的前列腺癌细 胞 系的培养液中分离出TGF-β2[8]，而本研究发现TGF-β2在前列腺癌组织的 过 度表达提示前列腺癌细胞已获得产生自身TGF-β的能力，这对于增加肿瘤进展和浸润的自 主性是十分重要的。
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本研究中建立的ELISA方法检测前列腺组织提取物中的TGF-β2，具有灵敏度高，特 异性强，重复性好，标准曲线线性关系好等优点，TGF-β2水平可作为前列腺癌诊断的参 考指标，本文建立的方法学亦可用于其它组织和体液中各种TGF-β的检测。
刘运初，男，1956年生，副教授， 副主任医师
参考文献
1，Thompson T C, Truong L D. Transforming growth factor β1 as a biomarker of prostate cancer. J Cellular Bioche, 1992, 16H(Suppl):54
2，Hirotaka M. Increased expression of genes for basic fibroblast factor type β 2 in human prostatic hyperplasia. Prostate, 1990, 16:71
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3，Barnald J A, Lyons R M, Moses H L. The cell biology of transforming growth factor beta. Biochim Biophy Acta, 1990, 1032:79
4，Thompson T C.Growth factor and oncogenes in prostate cancer .Cancer Cells, 1990, 2:345
5，Steiner M S, Barrack E R. Transforming growth factor-β1 over - production in prostate cancer: effects on growth in vivo and in vitro.Mol Endoc rinol, 1992, 6: 15
6，Centralla M, McCarthy T L, Canalis E. Transforming growth factor beta is a bifunctional regulator of replication and collagen synthesis in osteo blast-enriched cell cultures from fetal rat bone. J Bio Chem, 1987, 262:2869
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7，Merz V W, Miller G J, Kadmon D et al. Elevated TGF-β1 mR NA levels are associated with ras+ myc-induced carcinomas in recontituted mouse prostate: Evidence for paracrine role during progression. Mol Endocrinol, 1 991, 5: 503
8，Ikeda T, Lioubin M N, Marquardt H. Human transforming growth factor type β2: production by a prostatic adenocarcinoma cell line, purific ation and initial characterization. Biochemistry, 1987,26:2406
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