胎盘组织中促肾上腺皮质激素释放激素的免疫组化研究
作者：贺茜 沙金燕 张黎明 陈雄
单位：贺茜 陈雄 沙金燕(第二军医大学长海医院妇产科，上海 200433)；张黎明(海军医学系防化医学教研室)
关键词：促肾上腺皮质激素释放激素；胎盘；免疫组织化学
第二军医大学学报001218 [摘要] 目的：了解胎盘组织中促肾上腺 皮质激素释放激素(CRH)的表达量与分布，获取孕妇外周血中高浓度CRH来源于胎盘的直接 证据。方法：采用免疫组织化学LSAB法显示胎盘组织中CRH的表达量及 其分布。结果：早期绒毛合体滋养层细胞CRH表达量较低，呈弱阳性； 中期引产的胎盘组织合体滋养层细胞CRH表达量有所增加，呈弱阳性至阳性不等；晚期胎盘 组织合体滋养层细胞CRH表达量进一步增加，均呈强阳性。结论：妊娠 晚期及分娩时，母体血中高浓度的CRH主要来源于胎盘组织。
[中图分类号] R 714.12 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1152-03
Immunohistochemistry identification of corticotropin-releasing hormone positiv e cells from the human placenta
HE Qian SHA Jin-Yan CHEN Xiong
(Department of Gynecology and Obstetrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University , Shanghai 200433, China)
ZHANG Li-Ming
(Department of Chemical Defence Medicine, Faculty of Naval Medicine)
, 百拇医药
[ABSTRACT] Objective: To identify corticotropin-releasing h ormone(CRH) positive cells from the human placenta. Methods:Using immunohistochemistry to show the cellular expression of placental CRH. Results: During human pregnancy, placental CRH level rose marked ly from undetectable amounts prior to 20 weeks gestation to nearly the peak leve l. Conclusion: The presence of CRH in maternal plasma is attribu ted to the placental production and subsequent release of this hormone into th e maternal circulation.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] corticotropin-releasing hormone; placenta; immunohistoc hemistry
促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone, CRH)作为下丘脑神 经 肽已为人们所熟知。近年来发现，CRH还存在于下丘脑外的中枢其他部位，某些外周组织也 具有CRH分泌功能，但正常人外周血CRH水平很低，一般难以检测[1，2]。本室及其 他研究者发现[3，4]，妊娠时母体血浆CRH水平升高，并随妊娠期的进展呈指数增 加，于分娩时达到高峰，而且脐静脉血CRH水平远高于脐动脉血;当胎盘娩出后，母体血浆CR H水平急剧下降，产后24 h已基本恢复正常，提示胎盘可能是母体血CRH的主要来源。Northe rn印迹分析也表明，妊娠早、中期胎盘组织中有较低水平的CRH mRNA表达，到妊娠晚期时C RH mRNA表达量明显增加，分娩前5周增加了20多倍[5]。这与母体血浆CRH水平的 变化相符，也间接说明胎盘可能是母体血浆CRH的主要来源。为了观察胎盘组织CRH表达量是 否随妊娠进展而增加，以得到孕妇外周血中高浓度CRH来源于胎盘的直接证据，本研究采用 免疫组织化学LSAB法来检测胎盘组织中CRH的表达量与分布，以确定胎盘组织中究竟是否表 达CRH，其CRH的表达量是否与母体血浆中CRH含量的变化趋势相一致。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 试剂 胰蛋白酶，上海试剂一厂产品；二氨基联苯胺(DAB)，Sigma 公司 产品；CRH抗体，美国Peninsula Lab 产品；链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化染色 试剂盒(加强型)，丹麦Dako公司产品。采用生物素标记的第二抗体与链霉抗生物素蛋白连 接的过氧化物酶及基质色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
1.2 材料 绒毛组织：人工流产的正常绒毛组织；有流产先兆的绒毛组织。胎盘 组织：4个月引产胎盘组织；6个月引产胎盘组织；8个月自然早产胎盘组织；过期产胎盘组 织；正常足月产胎盘组织；未经临产阶段的剖宫产胎盘组织。迅速切取新鲜绒毛和胎盘组织 约1 cm×1 cm×0.2 cm大小，放入Eppendorf管中，用液氮速冻后于-70℃冻存。
1.3 免疫组化染色 组织块用中性多聚甲醛固定液固定，石蜡包埋，切片厚4 μ m，载玻片 涂以白胶-多聚赖氨酸混合液。石蜡切片脱水后用0.1%胰蛋白酶消化30 min，0.3%过氧化氢 甲醇溶液去除内源性过氧化物酶。每张切片加50 μl第一抗体 (兔抗CRH多抗)，稀释度1 ∶800，37℃孵育30 min 后室温下继续孵育2 h，冲洗后加50 μl即用型生物素标记的通用 型第二抗体，37℃孵育30 min，冲洗后加50 μl链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，37 ℃孵育30 min，冲洗后入新鲜配制的DAB显色液中染色15～20 min，苏木精衬染后封片 观察。如果合体滋养层细胞表达CRH，则在细胞质或细胞膜上染有棕黄色细颗粒。根据出现 棕黄色颗粒的合体滋养层细胞数目以及各细胞中染色深浅，对合体滋养层细胞CRH表达量进 行半定量评估：无棕黄色颗粒计0分；20%以下合体滋养层细胞出现少量浅黄色颗粒计1分；2 0%～50%合体滋养层细胞出现黄色颗粒，多数颗粒浅黄色，计2分；20%～50%合体滋养层细胞出 现黄色颗粒，多数颗粒金黄色，计3分；50%～80%合体滋养层细胞出现黄色颗粒，多数颗粒金 黄色，计4分；50%～80%合体滋养层细胞出现棕黄色颗粒，多数颗粒深棕黄色，计5分；80%以 上合体滋养层细胞出现深棕黄色颗粒，计6分。
, 百拇医药
1.4 对照组设置 阳性对照：选用正常足月的胎盘组织切片作阳性对照。阴性对 照：正常足月胎盘组织切片，以PBS代替一抗。
1.5 统计学处理 CRH表达量比较采用秩和检验，阳性率比较采用χ2检验 。
2 结 果
通过反复摸索，确定了如上1.3中所述的最适染色条件，在此条件下阳性对照组和阴性对照 组均取得满意的预期结果。然后实验组与对照组同时按此条件操作，显微镜下读片对合体滋 养层细胞CRH表达量进行半定量评估。
免疫组化检测结果如表1和图1所示，早期绒毛合体滋养层细胞CRH表达量较低，呈弱阳性， 且阳性率低。中期引产的胎盘组织合体滋养层细胞CRH表达量有所增加，且阳性率亦升高。 晚期胎盘组织合体滋养层细胞CRH表达量进一步增加，不管是自然早产胎盘组织、正常足月 产胎盘组织、过期产胎盘组织还是未经临产阶段的剖宫产胎盘组织全都呈强阳性(资料另文 发表)。阳性颗粒主要出现在合体滋养层细胞质和细胞膜上。
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表 1 胎盘组织合体滋养层细胞中CRH免疫组化检测结果
Tab 1 Placental CRH expression
level by immunohistochemistry Group
n
CRH expression
level score
(Number)
CRH positive
rate(%)
Negative control
, 百拇医药
10
0(10)
0
First trimester villi
20
0(13)
35
1(5)
2(2)
Second trimester
20
0(2)
, http://www.100md.com 90*
placenta
1(2)
2(7)
3(7)
4(2)*
Term placenta
40
4(7)
100**△
5(18)
6(15) **△
, 百拇医药
*P<0.05, ** P<0.01 vs negative control; △ P <0.05 vs first trimester villi
图 1 免疫组化方法检测不同妊娠期胎盘组织CRH的表达
Fig 1 Expression of placental CRH during different gestation by immunohistochem istry (LSAB,×100)
, 百拇医药
A: Negative control; B: Threatened abortion villi, with a few pale yello w granules; C: Second trimester(6 months) induced
labor placenta, with a relatively more golden-yellow granules; D: Normal term p lacenta, with a great deal of brown-yellow granules
3 讨 论
胎盘在整个妊娠过程中的作用无疑是非常重要的，它不仅是胎儿与母体间进行物质交换的重 要器官，也是重要的内分泌器官，同时具有免疫屏障作用。它不仅合成和分泌经典的绒毛膜 促性腺素、胎盘生乳素和类固醇激素，也分泌神经激素、神经肽、生长因子及细胞因子。它 们之间相互作用，共同维持正常妊娠[6]。近年研究发现，妊娠时母体血中CRH水平 随孕周增加而升高，于分娩时达峰值，胎盘娩出后，母体血中CRH水平又急剧降低，并在胎 盘组织检测到CRH mRNA的表达[3～5]，所以胎盘可能还具有合成和分泌CRH的功能 。CRH是一种41氨基酸残基的下丘脑多肽，主要定位于室旁核的小细胞性神经元和ACTH-可 的松轴等区域，首先在羊的下丘脑中被分提纯化 [7] 。下丘脑合成和分泌的CRH 主 要是促进垂体ACTH的释放。妊娠晚期，孕妇血中高浓度的CRH可能对分娩启动起着重要作用 [3，6]，因此而越来越受到人们的重视。
, 百拇医药
本实验结果表明，在正常的及有流产先兆的早期绒毛组织中，合体滋养层细胞CRH 的表达量都很低，CRH免疫组化检测呈阴性或弱阳性。中期胎盘组织中，合体滋养层细胞CRH表达量上 升，免疫组化检测呈弱阳性至阳性不等。经阴道自然分娩的足月产胎盘组织中合体滋养层细 胞CRH的表达量最高，达峰值，且不论是早产的、足月分娩的还是过期产的胎盘组织中合体 滋养层细胞CRH的表达量都呈强阳性，与孕中期相比，合体滋养层细胞中CRH的表达量剧增。 清楚表明随着妊娠周数的增加，胎盘组织中合体滋养层细胞CRH的表达量相应升高，胎盘组 织中CRH表达量的变化趋势与文献报道妊娠时母体血中CRH含量的变化趋势一致。这说 明妊娠 晚期及分娩时，母体血中高浓度的CRH主要来源于胎盘组织。鉴于孕妇血中CRH含量与分娩启 动密切相关[3，6]，孕妇血浆CRH水平有可能成为一项具有重要临床意义的产科检 测指标。
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39670757).
, 百拇医药 [作者简介] 贺 茜(1970-)，女(汉族)，硕士， 住院医师.
参考文献
[1] Jones SA, Challis JR. Effects of corticotropin-releasing hor mone and adrenocorticotropin on prostaglandin output by human placenta and fetal membranes [J]. Gynecol Obstet Invest, 1990,29(3):165-168.
[2] Jones SA, Challis JR. Steroid, corticotropin-releasing hormone, AC TH and prostaglandin interactions in the amnion and placenta of early pregnancy in man [J]. J Endocrinol, 1990,125(1):153-159.
, http://www.100md.com
[3] 贺 茜，沙金燕，王成海,等. 早产孕妇血浆促肾上腺皮质激素释放素含量的测 定 [J]. 第二军医大学学报，1998,19(4)：377-379.
[4] 孙 刚. 妊娠期的促肾上腺皮质激素释放激素 [J]. 生理科学进展, 1995, 26(3):270-272.
[5] Hatzoglou A, Margioris AN, Bakogeorgou E, et al. Identification, ch aracterization and localization of corticotropin-releasing hormone receptors in human placenta [J]. Life Sci, 1996,59(22):1871-1879.
[6] Petraglia F, Coukos G, Volpe A, et al. Involvement of placental neurohormones in human parturition [J]. Ann N Y Acad Sci, 1991,622:331-340.
[7] Keller WM, Wood CE. Corticotropin-releasing factor in the ovine fe tus and pregnant ewe: role of placenta [J]. Am J Physiol, 1991,261(4 Pt 2):R 995-R1002.
[收稿日期] 2000-06-29
[修回日期] 2000-11-18, 百拇医药
单位：贺茜 陈雄 沙金燕(第二军医大学长海医院妇产科，上海 200433)；张黎明(海军医学系防化医学教研室)
关键词：促肾上腺皮质激素释放激素；胎盘；免疫组织化学
第二军医大学学报001218 [摘要] 目的：了解胎盘组织中促肾上腺 皮质激素释放激素(CRH)的表达量与分布，获取孕妇外周血中高浓度CRH来源于胎盘的直接 证据。方法：采用免疫组织化学LSAB法显示胎盘组织中CRH的表达量及 其分布。结果：早期绒毛合体滋养层细胞CRH表达量较低，呈弱阳性； 中期引产的胎盘组织合体滋养层细胞CRH表达量有所增加，呈弱阳性至阳性不等；晚期胎盘 组织合体滋养层细胞CRH表达量进一步增加，均呈强阳性。结论：妊娠 晚期及分娩时，母体血中高浓度的CRH主要来源于胎盘组织。
[中图分类号] R 714.12 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1152-03
Immunohistochemistry identification of corticotropin-releasing hormone positiv e cells from the human placenta
HE Qian SHA Jin-Yan CHEN Xiong
(Department of Gynecology and Obstetrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University , Shanghai 200433, China)
ZHANG Li-Ming
(Department of Chemical Defence Medicine, Faculty of Naval Medicine)
, 百拇医药
[ABSTRACT] Objective: To identify corticotropin-releasing h ormone(CRH) positive cells from the human placenta. Methods:Using immunohistochemistry to show the cellular expression of placental CRH. Results: During human pregnancy, placental CRH level rose marked ly from undetectable amounts prior to 20 weeks gestation to nearly the peak leve l. Conclusion: The presence of CRH in maternal plasma is attribu ted to the placental production and subsequent release of this hormone into th e maternal circulation.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] corticotropin-releasing hormone; placenta; immunohistoc hemistry
促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone, CRH)作为下丘脑神 经 肽已为人们所熟知。近年来发现，CRH还存在于下丘脑外的中枢其他部位，某些外周组织也 具有CRH分泌功能，但正常人外周血CRH水平很低，一般难以检测[1，2]。本室及其 他研究者发现[3，4]，妊娠时母体血浆CRH水平升高，并随妊娠期的进展呈指数增 加，于分娩时达到高峰，而且脐静脉血CRH水平远高于脐动脉血;当胎盘娩出后，母体血浆CR H水平急剧下降，产后24 h已基本恢复正常，提示胎盘可能是母体血CRH的主要来源。Northe rn印迹分析也表明，妊娠早、中期胎盘组织中有较低水平的CRH mRNA表达，到妊娠晚期时C RH mRNA表达量明显增加，分娩前5周增加了20多倍[5]。这与母体血浆CRH水平的 变化相符，也间接说明胎盘可能是母体血浆CRH的主要来源。为了观察胎盘组织CRH表达量是 否随妊娠进展而增加，以得到孕妇外周血中高浓度CRH来源于胎盘的直接证据，本研究采用 免疫组织化学LSAB法来检测胎盘组织中CRH的表达量与分布，以确定胎盘组织中究竟是否表 达CRH，其CRH的表达量是否与母体血浆中CRH含量的变化趋势相一致。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 试剂 胰蛋白酶，上海试剂一厂产品；二氨基联苯胺(DAB)，Sigma 公司 产品；CRH抗体，美国Peninsula Lab 产品；链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化染色 试剂盒(加强型)，丹麦Dako公司产品。采用生物素标记的第二抗体与链霉抗生物素蛋白连 接的过氧化物酶及基质色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
1.2 材料 绒毛组织：人工流产的正常绒毛组织；有流产先兆的绒毛组织。胎盘 组织：4个月引产胎盘组织；6个月引产胎盘组织；8个月自然早产胎盘组织；过期产胎盘组 织；正常足月产胎盘组织；未经临产阶段的剖宫产胎盘组织。迅速切取新鲜绒毛和胎盘组织 约1 cm×1 cm×0.2 cm大小，放入Eppendorf管中，用液氮速冻后于-70℃冻存。
1.3 免疫组化染色 组织块用中性多聚甲醛固定液固定，石蜡包埋，切片厚4 μ m，载玻片 涂以白胶-多聚赖氨酸混合液。石蜡切片脱水后用0.1%胰蛋白酶消化30 min，0.3%过氧化氢 甲醇溶液去除内源性过氧化物酶。每张切片加50 μl第一抗体 (兔抗CRH多抗)，稀释度1 ∶800，37℃孵育30 min 后室温下继续孵育2 h，冲洗后加50 μl即用型生物素标记的通用 型第二抗体，37℃孵育30 min，冲洗后加50 μl链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，37 ℃孵育30 min，冲洗后入新鲜配制的DAB显色液中染色15～20 min，苏木精衬染后封片 观察。如果合体滋养层细胞表达CRH，则在细胞质或细胞膜上染有棕黄色细颗粒。根据出现 棕黄色颗粒的合体滋养层细胞数目以及各细胞中染色深浅，对合体滋养层细胞CRH表达量进 行半定量评估：无棕黄色颗粒计0分；20%以下合体滋养层细胞出现少量浅黄色颗粒计1分；2 0%～50%合体滋养层细胞出现黄色颗粒，多数颗粒浅黄色，计2分；20%～50%合体滋养层细胞出 现黄色颗粒，多数颗粒金黄色，计3分；50%～80%合体滋养层细胞出现黄色颗粒，多数颗粒金 黄色，计4分；50%～80%合体滋养层细胞出现棕黄色颗粒，多数颗粒深棕黄色，计5分；80%以 上合体滋养层细胞出现深棕黄色颗粒，计6分。
, 百拇医药
1.4 对照组设置 阳性对照：选用正常足月的胎盘组织切片作阳性对照。阴性对 照：正常足月胎盘组织切片，以PBS代替一抗。
1.5 统计学处理 CRH表达量比较采用秩和检验，阳性率比较采用χ2检验 。
2 结 果
通过反复摸索，确定了如上1.3中所述的最适染色条件，在此条件下阳性对照组和阴性对照 组均取得满意的预期结果。然后实验组与对照组同时按此条件操作，显微镜下读片对合体滋 养层细胞CRH表达量进行半定量评估。
免疫组化检测结果如表1和图1所示，早期绒毛合体滋养层细胞CRH表达量较低，呈弱阳性， 且阳性率低。中期引产的胎盘组织合体滋养层细胞CRH表达量有所增加，且阳性率亦升高。 晚期胎盘组织合体滋养层细胞CRH表达量进一步增加，不管是自然早产胎盘组织、正常足月 产胎盘组织、过期产胎盘组织还是未经临产阶段的剖宫产胎盘组织全都呈强阳性(资料另文 发表)。阳性颗粒主要出现在合体滋养层细胞质和细胞膜上。
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表 1 胎盘组织合体滋养层细胞中CRH免疫组化检测结果
Tab 1 Placental CRH expression
level by immunohistochemistry Group
n
CRH expression
level score
(Number)
CRH positive
rate(%)
Negative control
, 百拇医药
10
0(10)
0
First trimester villi
20
0(13)
35
1(5)
2(2)
Second trimester
20
0(2)
, http://www.100md.com 90*
placenta
1(2)
2(7)
3(7)
4(2)*
Term placenta
40
4(7)
100**△
5(18)
6(15) **△
, 百拇医药
*P<0.05, ** P<0.01 vs negative control; △ P <0.05 vs first trimester villi
图 1 免疫组化方法检测不同妊娠期胎盘组织CRH的表达
Fig 1 Expression of placental CRH during different gestation by immunohistochem istry (LSAB,×100)
, 百拇医药
A: Negative control; B: Threatened abortion villi, with a few pale yello w granules; C: Second trimester(6 months) induced
labor placenta, with a relatively more golden-yellow granules; D: Normal term p lacenta, with a great deal of brown-yellow granules
3 讨 论
胎盘在整个妊娠过程中的作用无疑是非常重要的，它不仅是胎儿与母体间进行物质交换的重 要器官，也是重要的内分泌器官，同时具有免疫屏障作用。它不仅合成和分泌经典的绒毛膜 促性腺素、胎盘生乳素和类固醇激素，也分泌神经激素、神经肽、生长因子及细胞因子。它 们之间相互作用，共同维持正常妊娠[6]。近年研究发现，妊娠时母体血中CRH水平 随孕周增加而升高，于分娩时达峰值，胎盘娩出后，母体血中CRH水平又急剧降低，并在胎 盘组织检测到CRH mRNA的表达[3～5]，所以胎盘可能还具有合成和分泌CRH的功能 。CRH是一种41氨基酸残基的下丘脑多肽，主要定位于室旁核的小细胞性神经元和ACTH-可 的松轴等区域，首先在羊的下丘脑中被分提纯化 [7] 。下丘脑合成和分泌的CRH 主 要是促进垂体ACTH的释放。妊娠晚期，孕妇血中高浓度的CRH可能对分娩启动起着重要作用 [3，6]，因此而越来越受到人们的重视。
, 百拇医药
本实验结果表明，在正常的及有流产先兆的早期绒毛组织中，合体滋养层细胞CRH 的表达量都很低，CRH免疫组化检测呈阴性或弱阳性。中期胎盘组织中，合体滋养层细胞CRH表达量上 升，免疫组化检测呈弱阳性至阳性不等。经阴道自然分娩的足月产胎盘组织中合体滋养层细 胞CRH的表达量最高，达峰值，且不论是早产的、足月分娩的还是过期产的胎盘组织中合体 滋养层细胞CRH的表达量都呈强阳性，与孕中期相比，合体滋养层细胞中CRH的表达量剧增。 清楚表明随着妊娠周数的增加，胎盘组织中合体滋养层细胞CRH的表达量相应升高，胎盘组 织中CRH表达量的变化趋势与文献报道妊娠时母体血中CRH含量的变化趋势一致。这说 明妊娠 晚期及分娩时，母体血中高浓度的CRH主要来源于胎盘组织。鉴于孕妇血中CRH含量与分娩启 动密切相关[3，6]，孕妇血浆CRH水平有可能成为一项具有重要临床意义的产科检 测指标。
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39670757).
, 百拇医药 [作者简介] 贺 茜(1970-)，女(汉族)，硕士， 住院医师.
参考文献
[1] Jones SA, Challis JR. Effects of corticotropin-releasing hor mone and adrenocorticotropin on prostaglandin output by human placenta and fetal membranes [J]. Gynecol Obstet Invest, 1990,29(3):165-168.
[2] Jones SA, Challis JR. Steroid, corticotropin-releasing hormone, AC TH and prostaglandin interactions in the amnion and placenta of early pregnancy in man [J]. J Endocrinol, 1990,125(1):153-159.
, http://www.100md.com
[3] 贺 茜，沙金燕，王成海,等. 早产孕妇血浆促肾上腺皮质激素释放素含量的测 定 [J]. 第二军医大学学报，1998,19(4)：377-379.
[4] 孙 刚. 妊娠期的促肾上腺皮质激素释放激素 [J]. 生理科学进展, 1995, 26(3):270-272.
[5] Hatzoglou A, Margioris AN, Bakogeorgou E, et al. Identification, ch aracterization and localization of corticotropin-releasing hormone receptors in human placenta [J]. Life Sci, 1996,59(22):1871-1879.
[6] Petraglia F, Coukos G, Volpe A, et al. Involvement of placental neurohormones in human parturition [J]. Ann N Y Acad Sci, 1991,622:331-340.
[7] Keller WM, Wood CE. Corticotropin-releasing factor in the ovine fe tus and pregnant ewe: role of placenta [J]. Am J Physiol, 1991,261(4 Pt 2):R 995-R1002.
[收稿日期] 2000-06-29
[修回日期] 2000-11-18, 百拇医药