裸鼠胶质瘤模型的建立及其病理
作者：牛朝诗 徐纪文 罗其中
单位：上海第二医科大学附属仁济医院神经外科，上海 200001
关键词：神经胶质瘤；疾病模型；动物；小鼠，裸；免疫组织化学
安徽医科大学学报000205
摘要 目的 建立裸鼠胶质瘤动物模型。方法 采用瘤细胞悬液接种法和瘤组织块接种法制作裸小鼠皮下移植瘤，并研究肿瘤的病理组织学特征。结果 两种方法所建肿瘤模型其成功率均为100%，肿瘤生长状况良好，裸鼠无明显恶异质变化，肿瘤病理形态学检查符合胶质瘤细胞的形态学特征，免疫组化证实体外培养的胶质瘤细胞和体内胶质瘤组织胶质纤维酸性蛋白均高表达。结论 该方法所建裸鼠皮下移植瘤模型能作为研究胶质瘤发病机制、生物学特性以及基因治疗的可靠动物模型。
中图分类号 R739.41
, 百拇医药
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)02-0098-03
Glioma model in nude mice and its pathology
Niu Chaoshi，Xu Jiwen，Luo Qizhong
(Dept of Neurosurgery, Renji Hospital Affiliated to Shanghai Second
Medical University, Shanghai 200001)
Abstract Objective To develop glioma model in nude mice. Methods The glioma xenografts were developed by means of either C6 cell suspension or tumor tissue pieces inoculated sc into Balb/c nude mice, and the pathology of the tumor tissue was studied. Results Both glioma models in nude mice were successfully developed in 100%, the growth of tumor was well, the pathology of tumor was accord with the morphological features of human glioma cell. The expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP) protein was positive in cultured C6 cells and glioma tissue of tumor-bearing nude mice. Conclusion The glioma xenograft model in nude mice is a reliable animal model for studying the tumorigenesis mechanism and biological characteristics and gene therapy of glioma.
, 百拇医药
MeSH glioma；disease model, animal；mice,nude；immunohistochemistry
裸鼠肿瘤模型是人们研究人类肿瘤生物特性以及肿瘤治疗常用的实验模型，这种模型可以保持原发肿瘤本身所具有的形态特征和遗传性。目前，裸鼠肿瘤模型常作为肿瘤基因治疗最重要的动物模型。本实验为研究胶质瘤的基因治疗而制作了荷大鼠胶质瘤的裸小鼠模型，并研究了其病理组织学特征，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 大鼠胶质瘤细胞系C6购自中国科学院上海细胞生物学研究所；DMEM培养基：Gibco BRL公司；胰蛋白酶：Sigma公司；新生小牛血清：杭州四季青生物制品公司；胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)单抗：Dako公司；ABC试剂盒：Vector公司。
, 百拇医药
1.1.2 动物 Balb/c裸小鼠，♀，鼠龄5～6周，体重15～20 g，中国科学院上海药物研究所动物中心繁殖和提供(沪动合证121、122号)，饲养于上海第二医科大学动物科学部(沪动合证126号)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 大鼠C6胶质瘤细胞培养于含10%血清的DMEM培养基(青霉素105 U.L-1，链霉素100 mg.L-1)中，置于37℃、5% CO2培养箱培养至对数生长期。
1.2.2 肿瘤接种
1.2.2.1 瘤细胞悬液接种法 取对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，离心去上清，而后用无血清培养液(无血清DMEM)离心洗涤2次，计数细胞数，调整细胞浓度，将细胞悬浮于PBS(0.01 mol.L-1， pH 7.4)中，细胞浓度为5×109.L-1。然后用带6号针头的注射器抽取细胞悬液200 μl，接种于裸鼠的腋下。该组接种裸鼠5只。
, 百拇医药
1.2.2.2 瘤组织块接种法 经细胞接种而成功的移植瘤，进行裸鼠肿瘤异体移植。在无菌条件下，切取适当大小的肿瘤组织，立即放入无血清培养液中，修剪肿瘤组织，去除脂肪和坏死肿瘤组织，并用无血清培养液洗涤，将其剪成1 mm3大小的瘤组织块，加适量无菌PBS(0.01 mol.L-1， pH7.4)，待接种用。接种前，用碘酊和乙醇消毒接种部位的皮肤，先用消毒的12号针头在要接种的裸鼠腋下皮肤处刺破，而后用无菌套管针抽吸一小瘤块，沿刺破的皮肤处进入皮下接种。该组接种裸鼠5只。
1.2.3 肿瘤的观察和测量 裸鼠接种完毕后，置恒温(25℃±2℃)、恒湿(45%～50%)、无菌净化屏障系统内饲养，定期观察裸鼠精神、饮食和排便，用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径a和最短径b，根据公式计算肿瘤体积，V=1/6π(ab2)，求其平均值绘制肿瘤生长曲线。
, http://www.100md.com 1.2.4 病理组织学检查 处死裸鼠，详细观察移植瘤的大体形态。并取肿瘤组织固定于10%福尔马林溶液中，石蜡包埋，组织切片，常规HE染色，作组织病理检查。
1.2.5 免疫组化检测GFAP蛋白的表达 体外培养的C6胶质瘤细胞爬片以及裸鼠移植瘤组织常规应用免疫组化(ABC法)检测GFAP蛋白的表达，阳性细胞呈现胞浆棕黄色着染，胞核苏木精复染。
2 结果
2.1 肿瘤生长曲线 瘤细胞悬液接种法，需待细胞增殖达一定数量时，才能观察到肿瘤，因此，肿瘤的出现有一定的潜伏期，且随肿瘤类型、注射量的不同而不同。本实验每只裸鼠接种大鼠C6胶质瘤细胞1×106个，肿瘤形成的潜伏期均为4天，全部形成皮下移植瘤，肿瘤生长曲线如图1。
, 百拇医药 图1 裸鼠肿瘤生长曲线 瘤细胞悬液接种法
瘤组织块接种法，12 h左右接种伤口愈合，于次日接种部位可见肿瘤形成，肿瘤生长曲线如图2。
图2 裸鼠肿瘤生长曲线 瘤组织块接种法
2.2 病理学特征 在裸鼠接种的腋下部位可见到肿块，肿瘤随时间延长而增大，处死裸鼠后肉眼分离见肿瘤组织呈结节状、灰白色，与皮肤不粘连，切面可见鱼肉状，有些肿瘤中心有坏死现象。光镜下形态特点：HE染色切片可见肿瘤细胞多呈圆形或多角形，均匀分布，致密排列，细胞核呈圆形和椭圆形，染色质丰富，深染，分裂像多见，呈异质性，胞浆较少，略嗜伊红，细胞间质少见。
2.3 免疫组化检测GFAP蛋白的表达 体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞GFAP高表达(图3)，裸鼠胶质瘤组织GFAP也高表达(图4)，从而说明肿瘤细胞为胶质源性肿瘤，形成的裸鼠体内肿瘤的遗传性没有改变。
, 百拇医药
图3 体外培养大鼠C6胶质瘤细胞GFAP蛋白的表达
胶质瘤细胞胞浆呈棕黄色 ABC ×200
图4 瘤组织块法移植形成的裸鼠肿瘤组织GFAP蛋白的表达
胶质瘤细胞胞浆呈棕黄色 ABC ×100
3 讨论
裸小鼠是1966年发现和培育的一种小鼠突变株，此种小鼠先天无毛、无胸腺、T淋巴细胞功能完全缺乏，对异种移植不产生排斥反应。因此，特别适用于异种动物组织的移植和人类肿瘤异种移植。1969年Rygarrrd和Polsen 首次将人类结肠癌移植于裸小鼠皮下，成功地建立了裸鼠移植瘤动物模型。此后，人们相继建立了乳腺癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤等肿瘤的裸小鼠肿瘤动物模型，并且移植肿瘤能够良好生长和传代。我国1985年开展脑肿瘤的裸小鼠的移植研究〔1〕。移植的肿瘤仍保持原肿瘤的染色体组型、组织学形态以及肿瘤的生物学行为。因此，裸小鼠肿瘤模型是研究恶性肿瘤的一种较为理想的模型系统。尤其近年来，肿瘤基因治疗应运而生，裸小鼠肿瘤模型的建立和应用，为肿瘤基因治疗过渡到临床应用起着非常重要的作用。
, 百拇医药
建立可靠的胶质瘤动物模型是探讨胶质瘤发病机制以及开展各种治疗方法在体实验的基础。理想的胶质瘤动物模型应具备：①肿瘤细胞具有胶质瘤细胞和恶性细胞的生物学特性，且体外能培养生长；②肿瘤能在较短时间内形成，能够测定肿瘤的生长率；③肿瘤应具备与人脑胶质瘤相似的生长特征；④模型动物应较小且经济；⑤用于治疗的动物模型应能够模拟人脑胶质瘤的治疗过程〔2〕。
大鼠C6胶质瘤细胞是经N-亚硝基甲脲诱发的大鼠脑胶质瘤细胞，是国际上通用的胶质瘤细胞系，它与人类脑胶质母细胞瘤病理特征一致，常作为人们研究胶质瘤较好的细胞株〔3〕。C6细胞的大鼠胶质瘤模型成为胶质瘤基因治疗研究中常用的模型。本组所制作模型是将大鼠C6胶质瘤细胞移植到Balb/c裸小鼠皮下，形成裸鼠皮下移植瘤，瘤细胞悬液接种法和瘤组织块接种法制作的胶质瘤模型其成功率均为100%，且裸鼠生长状况良好。两种方法相比较，在瘤组织块传代移植时肿瘤生长速度较快。当然，瘤细胞悬液接种法的肿瘤生长速度与细胞接种的数量密切有关，随着注射量的增加，其移植瘤的生长速度也增加。
, http://www.100md.com
病理组织检查证实裸鼠皮下移植瘤呈典型的胶质瘤细胞特征。GFAP是一种胶质细胞所特有的细胞骨架蛋白，经免疫组化证实它是星形胶质细胞及其肿瘤的特异标记物，GFAP表达对于维持胶质细胞的正常形态及其遗传性具有重要的作用〔2，4〕。本研究免疫组化GFAP检测证实该动物模型的肿瘤为胶质瘤源性肿瘤，且重复性好，是一种理想的胶质瘤模型。胶质瘤动物模型是人体肿瘤的一种较为理想的模型系统，可以将临床手术切除的胶质瘤经瘤组织块法或瘤细胞悬液法制作成胶质瘤模型。当然，胶质瘤颅内移植瘤与临床的关系将更为密切。但是，裸鼠颅内肿瘤不便于观察，同时，由于肿瘤迅速生长，较早产生颅高压，使动物较早死亡。所以，裸鼠颅外皮下移植瘤是研究胶质瘤的生物学特性及其药物治疗等重要的动物模型。它可用于研究胶质瘤在体内的生物学行为，探讨肿瘤的发生机制以及胶质瘤的药物治疗、放射治疗，尤其基因治疗的开展。裸鼠胶质瘤动物模型将为基因治疗临床前的研究提供一个良好的治疗模型。
作者简介：牛朝诗，男，35岁，博士，副教授
, http://www.100md.com
罗其中，男，64岁，教授，博士生导师，中华神经外科学会副主任委员，世界神经外科联合会委员
参考文献
1，杜子威.人脑胶质瘤的研究. 北京：原子能出版社,1992:1～10
2，黄 强.脑肿瘤分子外科学.北京：中国科学技术出版社，1998:203～217
3，Peterson DL, Sheoilam PL, Brown WE et al. Animal models for brain tumors: historical perspectives and future directions. J Neurosurg,1994;80(5):865～876
4，Rutka JT, Hubbard SL, Fukuyama K et al. Effect of antisense glial fibrillary acidic protein complementary DNA on the growth, invasion, and adhesion of human astrocytoma cells. Cancer Res, 1994; 54(11):3 267～3 272
1999-12-09收稿
2000-01-10修回, 百拇医药
单位：上海第二医科大学附属仁济医院神经外科，上海 200001
关键词：神经胶质瘤；疾病模型；动物；小鼠，裸；免疫组织化学
安徽医科大学学报000205
摘要 目的 建立裸鼠胶质瘤动物模型。方法 采用瘤细胞悬液接种法和瘤组织块接种法制作裸小鼠皮下移植瘤，并研究肿瘤的病理组织学特征。结果 两种方法所建肿瘤模型其成功率均为100%，肿瘤生长状况良好，裸鼠无明显恶异质变化，肿瘤病理形态学检查符合胶质瘤细胞的形态学特征，免疫组化证实体外培养的胶质瘤细胞和体内胶质瘤组织胶质纤维酸性蛋白均高表达。结论 该方法所建裸鼠皮下移植瘤模型能作为研究胶质瘤发病机制、生物学特性以及基因治疗的可靠动物模型。
中图分类号 R739.41
, 百拇医药
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)02-0098-03
Glioma model in nude mice and its pathology
Niu Chaoshi，Xu Jiwen，Luo Qizhong
(Dept of Neurosurgery, Renji Hospital Affiliated to Shanghai Second
Medical University, Shanghai 200001)
Abstract Objective To develop glioma model in nude mice. Methods The glioma xenografts were developed by means of either C6 cell suspension or tumor tissue pieces inoculated sc into Balb/c nude mice, and the pathology of the tumor tissue was studied. Results Both glioma models in nude mice were successfully developed in 100%, the growth of tumor was well, the pathology of tumor was accord with the morphological features of human glioma cell. The expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP) protein was positive in cultured C6 cells and glioma tissue of tumor-bearing nude mice. Conclusion The glioma xenograft model in nude mice is a reliable animal model for studying the tumorigenesis mechanism and biological characteristics and gene therapy of glioma.
, 百拇医药
MeSH glioma；disease model, animal；mice,nude；immunohistochemistry
裸鼠肿瘤模型是人们研究人类肿瘤生物特性以及肿瘤治疗常用的实验模型，这种模型可以保持原发肿瘤本身所具有的形态特征和遗传性。目前，裸鼠肿瘤模型常作为肿瘤基因治疗最重要的动物模型。本实验为研究胶质瘤的基因治疗而制作了荷大鼠胶质瘤的裸小鼠模型，并研究了其病理组织学特征，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 大鼠胶质瘤细胞系C6购自中国科学院上海细胞生物学研究所；DMEM培养基：Gibco BRL公司；胰蛋白酶：Sigma公司；新生小牛血清：杭州四季青生物制品公司；胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)单抗：Dako公司；ABC试剂盒：Vector公司。
, 百拇医药
1.1.2 动物 Balb/c裸小鼠，♀，鼠龄5～6周，体重15～20 g，中国科学院上海药物研究所动物中心繁殖和提供(沪动合证121、122号)，饲养于上海第二医科大学动物科学部(沪动合证126号)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 大鼠C6胶质瘤细胞培养于含10%血清的DMEM培养基(青霉素105 U.L-1，链霉素100 mg.L-1)中，置于37℃、5% CO2培养箱培养至对数生长期。
1.2.2 肿瘤接种
1.2.2.1 瘤细胞悬液接种法 取对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，离心去上清，而后用无血清培养液(无血清DMEM)离心洗涤2次，计数细胞数，调整细胞浓度，将细胞悬浮于PBS(0.01 mol.L-1， pH 7.4)中，细胞浓度为5×109.L-1。然后用带6号针头的注射器抽取细胞悬液200 μl，接种于裸鼠的腋下。该组接种裸鼠5只。
, 百拇医药
1.2.2.2 瘤组织块接种法 经细胞接种而成功的移植瘤，进行裸鼠肿瘤异体移植。在无菌条件下，切取适当大小的肿瘤组织，立即放入无血清培养液中，修剪肿瘤组织，去除脂肪和坏死肿瘤组织，并用无血清培养液洗涤，将其剪成1 mm3大小的瘤组织块，加适量无菌PBS(0.01 mol.L-1， pH7.4)，待接种用。接种前，用碘酊和乙醇消毒接种部位的皮肤，先用消毒的12号针头在要接种的裸鼠腋下皮肤处刺破，而后用无菌套管针抽吸一小瘤块，沿刺破的皮肤处进入皮下接种。该组接种裸鼠5只。
1.2.3 肿瘤的观察和测量 裸鼠接种完毕后，置恒温(25℃±2℃)、恒湿(45%～50%)、无菌净化屏障系统内饲养，定期观察裸鼠精神、饮食和排便，用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径a和最短径b，根据公式计算肿瘤体积，V=1/6π(ab2)，求其平均值绘制肿瘤生长曲线。
, http://www.100md.com 1.2.4 病理组织学检查 处死裸鼠，详细观察移植瘤的大体形态。并取肿瘤组织固定于10%福尔马林溶液中，石蜡包埋，组织切片，常规HE染色，作组织病理检查。
1.2.5 免疫组化检测GFAP蛋白的表达 体外培养的C6胶质瘤细胞爬片以及裸鼠移植瘤组织常规应用免疫组化(ABC法)检测GFAP蛋白的表达，阳性细胞呈现胞浆棕黄色着染，胞核苏木精复染。
2 结果
2.1 肿瘤生长曲线 瘤细胞悬液接种法，需待细胞增殖达一定数量时，才能观察到肿瘤，因此，肿瘤的出现有一定的潜伏期，且随肿瘤类型、注射量的不同而不同。本实验每只裸鼠接种大鼠C6胶质瘤细胞1×106个，肿瘤形成的潜伏期均为4天，全部形成皮下移植瘤，肿瘤生长曲线如图1。
, 百拇医药 图1 裸鼠肿瘤生长曲线 瘤细胞悬液接种法
瘤组织块接种法，12 h左右接种伤口愈合，于次日接种部位可见肿瘤形成，肿瘤生长曲线如图2。
图2 裸鼠肿瘤生长曲线 瘤组织块接种法
2.2 病理学特征 在裸鼠接种的腋下部位可见到肿块，肿瘤随时间延长而增大，处死裸鼠后肉眼分离见肿瘤组织呈结节状、灰白色，与皮肤不粘连，切面可见鱼肉状，有些肿瘤中心有坏死现象。光镜下形态特点：HE染色切片可见肿瘤细胞多呈圆形或多角形，均匀分布，致密排列，细胞核呈圆形和椭圆形，染色质丰富，深染，分裂像多见，呈异质性，胞浆较少，略嗜伊红，细胞间质少见。
2.3 免疫组化检测GFAP蛋白的表达 体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞GFAP高表达(图3)，裸鼠胶质瘤组织GFAP也高表达(图4)，从而说明肿瘤细胞为胶质源性肿瘤，形成的裸鼠体内肿瘤的遗传性没有改变。
, 百拇医药
图3 体外培养大鼠C6胶质瘤细胞GFAP蛋白的表达
胶质瘤细胞胞浆呈棕黄色 ABC ×200
图4 瘤组织块法移植形成的裸鼠肿瘤组织GFAP蛋白的表达
胶质瘤细胞胞浆呈棕黄色 ABC ×100
3 讨论
裸小鼠是1966年发现和培育的一种小鼠突变株，此种小鼠先天无毛、无胸腺、T淋巴细胞功能完全缺乏，对异种移植不产生排斥反应。因此，特别适用于异种动物组织的移植和人类肿瘤异种移植。1969年Rygarrrd和Polsen 首次将人类结肠癌移植于裸小鼠皮下，成功地建立了裸鼠移植瘤动物模型。此后，人们相继建立了乳腺癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤等肿瘤的裸小鼠肿瘤动物模型，并且移植肿瘤能够良好生长和传代。我国1985年开展脑肿瘤的裸小鼠的移植研究〔1〕。移植的肿瘤仍保持原肿瘤的染色体组型、组织学形态以及肿瘤的生物学行为。因此，裸小鼠肿瘤模型是研究恶性肿瘤的一种较为理想的模型系统。尤其近年来，肿瘤基因治疗应运而生，裸小鼠肿瘤模型的建立和应用，为肿瘤基因治疗过渡到临床应用起着非常重要的作用。
, 百拇医药
建立可靠的胶质瘤动物模型是探讨胶质瘤发病机制以及开展各种治疗方法在体实验的基础。理想的胶质瘤动物模型应具备：①肿瘤细胞具有胶质瘤细胞和恶性细胞的生物学特性，且体外能培养生长；②肿瘤能在较短时间内形成，能够测定肿瘤的生长率；③肿瘤应具备与人脑胶质瘤相似的生长特征；④模型动物应较小且经济；⑤用于治疗的动物模型应能够模拟人脑胶质瘤的治疗过程〔2〕。
大鼠C6胶质瘤细胞是经N-亚硝基甲脲诱发的大鼠脑胶质瘤细胞，是国际上通用的胶质瘤细胞系，它与人类脑胶质母细胞瘤病理特征一致，常作为人们研究胶质瘤较好的细胞株〔3〕。C6细胞的大鼠胶质瘤模型成为胶质瘤基因治疗研究中常用的模型。本组所制作模型是将大鼠C6胶质瘤细胞移植到Balb/c裸小鼠皮下，形成裸鼠皮下移植瘤，瘤细胞悬液接种法和瘤组织块接种法制作的胶质瘤模型其成功率均为100%，且裸鼠生长状况良好。两种方法相比较，在瘤组织块传代移植时肿瘤生长速度较快。当然，瘤细胞悬液接种法的肿瘤生长速度与细胞接种的数量密切有关，随着注射量的增加，其移植瘤的生长速度也增加。
, http://www.100md.com
病理组织检查证实裸鼠皮下移植瘤呈典型的胶质瘤细胞特征。GFAP是一种胶质细胞所特有的细胞骨架蛋白，经免疫组化证实它是星形胶质细胞及其肿瘤的特异标记物，GFAP表达对于维持胶质细胞的正常形态及其遗传性具有重要的作用〔2，4〕。本研究免疫组化GFAP检测证实该动物模型的肿瘤为胶质瘤源性肿瘤，且重复性好，是一种理想的胶质瘤模型。胶质瘤动物模型是人体肿瘤的一种较为理想的模型系统，可以将临床手术切除的胶质瘤经瘤组织块法或瘤细胞悬液法制作成胶质瘤模型。当然，胶质瘤颅内移植瘤与临床的关系将更为密切。但是，裸鼠颅内肿瘤不便于观察，同时，由于肿瘤迅速生长，较早产生颅高压，使动物较早死亡。所以，裸鼠颅外皮下移植瘤是研究胶质瘤的生物学特性及其药物治疗等重要的动物模型。它可用于研究胶质瘤在体内的生物学行为，探讨肿瘤的发生机制以及胶质瘤的药物治疗、放射治疗，尤其基因治疗的开展。裸鼠胶质瘤动物模型将为基因治疗临床前的研究提供一个良好的治疗模型。
作者简介：牛朝诗，男，35岁，博士，副教授
, http://www.100md.com
罗其中，男，64岁，教授，博士生导师，中华神经外科学会副主任委员，世界神经外科联合会委员
参考文献
1，杜子威.人脑胶质瘤的研究. 北京：原子能出版社,1992:1～10
2，黄 强.脑肿瘤分子外科学.北京：中国科学技术出版社，1998:203～217
3，Peterson DL, Sheoilam PL, Brown WE et al. Animal models for brain tumors: historical perspectives and future directions. J Neurosurg,1994;80(5):865～876
4，Rutka JT, Hubbard SL, Fukuyama K et al. Effect of antisense glial fibrillary acidic protein complementary DNA on the growth, invasion, and adhesion of human astrocytoma cells. Cancer Res, 1994; 54(11):3 267～3 272
1999-12-09收稿
2000-01-10修回, 百拇医药