转导人bax α基因的CNE-2B细胞株凋亡及其裸鼠成瘤能力的改变
作者：朱振宇 张清秀 黄必军 高国全 邓诣群 马涧泉
单位：黄必军(中山医科大学肿瘤防治中心)；朱振宇 张清秀 高国全 邓诣群 马涧泉(中山医科大学生物化学教研室 广州 510089)
关键词：基因bcl-2；鼻咽肿瘤；凋亡；小鼠，裸
肿瘤000407 摘要：目的 观察导入bax α基因并稳定表达的人低分化鼻咽癌细胞株(CNE-2B)生物学行为变化。方法 琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段化；γ-射线照射。结果 CNE-2B在进行正常及受γ-射线照射后传代培养时，其细胞总数的增加速度比导入载体的对照组CNE-2P细胞株明显减慢；自发性细胞凋亡数明显增加。CNE-2B细胞接种到10只裸鼠双侧背部皮下均未见形成移植瘤(0/20)，而对照的10只裸鼠的成瘤率为100 %(20/20)。结论 转导人bax α基因的CNE-2B细胞株的生物学行为发生了显著性改变(P<0.01)。
, 百拇医药
中图分类号：R73-362 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0258-03
APOPTOSIS AND TRANSPLANTABILITY OF CNE-2 CELL LINE CONTAINING HUMAN bax α GENE (CNE-2B) IN NUDE MICE
ZHANG Qing-xiu
(Department of Biochemistry,# Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
ZHU Zhen-yu
(Department of Biochemistry,# Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
, 百拇医药
HUANG Bi-jun, et al.
(Department of Biochemistry,# Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
Abstract：Objective To observe the changing of biological behavior in human poorly differentiated nasopharyngeal cell line (CNE-2B), which is integrated with human bax α gene. Methods DNA fragmentation analysis by agarose gel electrophoresis; γ-rays irradiation. Results CNE-2B cell line grew much slower than CNE-2P cell line (containg pSFFV-neo without human baxα gene) Whether 60Co γ ray irradiation was given or not. Spontaneous apoptotic cell number of CNE-2B increased greatly. No transplanted tumor occurred after CNE-2B cells were inoculated subcutaneously into nude mice(0/20), while CNE-2P cells' transplantability was 100 % (20/20). Conclusion The biological behavior of CNE-2B was significantly changed (P<0.01) in compare with CNE-2P cell line as control.
, http://www.100md.com
Key words： Gene,bcl-2； Nasopharyngeal neoplasm; Apoptosis; Mice,nude
细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，不仅参与生物体发育及正常组织动态平衡的维持，而且多种肿瘤的发生、发展及转归均与PCD有关[1]，促进肿瘤细胞发生PCD已成为目前治疗肿瘤的目标之一。促进PCD的基因有多种如bad,bak,bax,bcl-x-s及bik等，bax基因发现于1993年[2]，Bax蛋白质(Bax)可与Bcl-2形成异二聚体而消除bcl-2的抑制PCD的作用，从而能促进肿瘤细胞发生PCD的作用[3，4]。已有报道[5]人0.62 kb的bax α cDNA与真核表达载体pSFFV-neo正向连接重组体的构建、转导及鉴定。本文对照研究能稳定表达人bax α蛋白质的低分化鼻咽癌细胞株CNE-2B与仅导入pSFFV-neo载合格的CNE-2P细胞株(对照组)的细胞总数改变、自发性细胞凋亡、对γ-射线照射的反应性及其裸鼠皮下接种形成移植瘤能力等生物学行为的差异。
, 百拇医药
材料与方法
一、实验材料
(一)细胞株 人低分化鼻咽癌细胞株(CNE-2)，由本校肿瘤防治中心提供；CNE-2P及CNE-2B由本室建立及鉴定。
(二)实验动物 BALB/c裸鼠，4周龄，雌雄兼用，共20只，购于本校动物中心，在无特殊病原体(specific-pathogen free ,SPF)条件下饲养、接种。
二、实验方法
(一)细胞计数及死细胞数检测 台盼蓝染色，检测死细胞数目(实验重复3次)。
(二)60Co γ-射线照射 CNE-2P和CNE-2B每瓶(细胞数均为1×106)分别接受0.25，0.50，1.00及2.00 Gy的γ-射线照射后，进行检测。
, 百拇医药
(三)细胞株DNA电泳 不同剂量γ-射线照射后，常规培养12 d,离心收集细胞，按文献方法[6]。
(四)动物分组及细胞株接种[7] 将20只裸鼠随机分成2组(各10只)，分别在裸鼠双侧颈背部皮下接种未受γ-射线照射的CNE-2P细胞株(对照组)和CNE-2B细胞株(实验组)，每组接种细胞数均为5×105。
(五)统计 用方差分析法。
结果
一、细胞株增殖情况 CNE-2B细胞株的增殖速度较对照组CNE-2P明显减慢，经过6次传代培养后细胞总数仅为对照组的1/6左右，P<0.01(见表1)。
表1 每次换液前的总细胞计数(1×106)* 细胞株
, http://www.100md.com
培养细胞天数
0
2
4
6
8
10
12
CNE-2P
1.0
1.7
2.9
5.1
, http://www.100md.com 7.5
9.6
12.8
CNE-2B
1.0
1.2
1.4
1.6
1.7
1.9
2.1
P
>0.05
, http://www.100md.com
>0.05
>0.05
>0.05
<0.05
<0.05
<0.01
*实验重复3次 二、细胞株自发死亡情况 正常传代培养时，CNE-2B较CNE-2P细胞株死亡细胞所占的百分数亦明显增加，分别为18.7%±5.3%和3.9%±1.3%(P<0.05)。
三、γ-射线对细胞株的影响 低剂量(≤0.50 Gy)的γ-射线对CNE-2P的早期(≤6 d)细胞数改变无明显影响，却能明显抑制CNE-2B细胞株细胞总数的增加；剂量≥1.00 Gy的γ-射线照射能使CNE-2B的细胞数增加受到明显抑制，因原有细胞死亡等原因，细胞数较开始传代时反而减少(见表2)。
, http://www.100md.com
表2 不同剂量γ-射线照射后，每次换液前的
总细胞计数(×105) 细胞株
照射剂
(Gy)
培养细胞天数
0
2
4
6
8
10
12
, 百拇医药 CNE-2P
0.25
0.50
1.00
2.00
1.0
1.0
1.0
1.0
1.7
1.6
1.6
1.3
, http://www.100md.com
2.8
2.6
2.3
1.5
4.9
5.2
4.3
1.9
6.9
5.6
5.0
2.6
9.2
, 百拇医药
6.7
5.9
3.2
10.7
8.5
6.7
3.5
CNE-2B
0.25
0.50
1.00
2.00
1.0
, 百拇医药
1.0
1.0
1.0
1.1
1.0
1.0
0.8
1.2
1.1
0.9
0.6
1.2
1.1
, 百拇医药
0.9
0.5
1.3
1.2
0.8
0.4
1.5
1.3
0.7
0.3
1.8
1.2
0.5
, http://www.100md.com
0.2
*实验重复3次
四、细胞株DNA电泳结果 CNE-2B在正常换液传代时，已有较多的自发性死亡细胞出现，电泳时出现细胞凋亡特征性的“梯形”(ladder)DNA降解片段。随γ-射线照射剂量的增加，CNE-2B和CNE-2P细胞株的凋亡均更为明显。而在受相同剂量的γ-射线照射后，CNE-2B较CNE-2P细胞凋亡程度明显为强(见附图)。
附图 不同剂量γ-射线照射后的CNE-2P和CNE-2B细胞DNA琼脂糖凝胶电泳
1.未照射的CNE-2P细胞株；2.未经照射的CNE-2B细胞株；
3，5分别受0.25 Gy，1.00 Gy γ-射线照射的CNE-2P细胞株；
, 百拇医药
4，6，7分别受0.25，1.00，2.00 Gy γ-射线照射的CNE-2B细胞株；
8.pBR322/Bst N I(1 857，1 060，929，383，121 bp)
五、细胞株裸鼠皮下成瘤能力 对照组裸鼠在接种CNE-2P细胞株后，移植瘤生长曲线与本室已报道的接种CNE-2细胞株相似[8]，即接种后第5d已可见皮下移植瘤形成，6～14 d生长开始加速，15～30 d生长速度最快，30 d后速度减慢，成瘤率为100 %。对照组裸鼠自第43 d开始有荷瘤裸鼠死亡，79 d内全部死亡，而接种CNE-2B的实验组裸鼠除62 d有1只意外死亡外(尸检未见皮下移植瘤)，其余9只在第80 d 处死后尸检未见有移植瘤形成。初步表明CNE-2B的裸鼠皮下成瘤能力较对照细胞株显著减弱(P<0.01)。
讨论
, 百拇医药
细胞凋亡与参与体内多种生理与病理过程，生物个体在生长发育过程中依赖细胞凋亡这种独特的细胞死亡方式来清除某些对机体无益的细胞，在保持正常组织的平衡、稳定方面具有重要作用。细胞凋亡失衡是导致人类的多种肿瘤发生、发展及转移的重要原因之一[1]。细胞凋亡受基因调控，促进细胞凋亡的bax基因，其表达产物Bax蛋白质可与Bcl-2形成异二聚体而消除bcl-2抑制细胞凋亡的作用，从而能促进肿瘤细胞发生凋亡作用[2～4]。多种肿瘤组织受到γ-射线照射后，细胞死亡方式部分与凋亡有关[8，9]。本研究对前文[5]转导bax α并成功表达的CNE-2B细胞株进行了初步的生物学行为研究。结果显示CNE-2B在正常传代培养时其细胞总数增加的速度比仅含载体的CNE-2P明显减慢，自发性细胞死亡数明显增加；而在受到不同剂量60Coγ-射线照射后，再传代培养时，上述差异更加明显，说明两种因素综合作用可导致肿瘤细胞株更易死亡，为恶性肿瘤治疗提供了一种新途径。CNE-2B的裸鼠皮下形成移植瘤的能力明显减弱，但是否真正失去了裸鼠成瘤能力尚需进一步研究。
, 百拇医药
感谢：感谢美国华盛顿大医学院Stanley J. Korsmeyer博士惠赠baxα cDNA、质粒pSFFV-neo及相关资料。
基金项目：广东省青年基金(950355)及广东省卫生厅基金资助项目
作者简介：朱振宇，男，医学博士，教授。
参考文献
[1]Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease〔J〕. Science,1995,267:1456
[2]Yin CY, Kundson CM, Korsmeyer SJ, et al. Bax suppresses tumorignesis and stimulated apoptosis in vivo〔J〕. Nature,1997，385：637
, 百拇医药
[3]Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line〔J〕. Blood, 1993,81(1):151
[4]Oltvai ZN, Milliman CT, Korsmeyer ST. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death〔J〕. Cell, 1993,74:609
[5]张清秀，朱振宇，马涧泉.Bax基因加强表达对Raji细胞程序性死亡的效应研究〔J〕. 中山医科大学学报，1998，19(2)：101
[6]朱振宇，潘景轩，赵群，等.地塞米松诱导裸鼠脾细胞凋亡的研究〔J〕.中国病理生理学杂志，1996，12(2)：131
, 百拇医药
[7]朱振宇，简志瀚，李树浓，裸鼠荷人鼻咽癌细胞株后免疫状态的动态观察〔J〕.中国病理生理学杂志，1992，8(5)：585
[8]Schulte HR, Grasl KB, Bursch W. Tumor development and apoptosis〔J〕. Int Arch Allergy Immunol,1994,105(4):363
[9]Martin SJ, Green DR. Apoptosis as goal of cancer therapy〔J〕. Curr Opin Oncol,1994,6(6):616
(收稿日期：1998-03-18；修回日期：1998-06-22), 百拇医药
单位：黄必军(中山医科大学肿瘤防治中心)；朱振宇 张清秀 高国全 邓诣群 马涧泉(中山医科大学生物化学教研室 广州 510089)
关键词：基因bcl-2；鼻咽肿瘤；凋亡；小鼠，裸
肿瘤000407 摘要：目的 观察导入bax α基因并稳定表达的人低分化鼻咽癌细胞株(CNE-2B)生物学行为变化。方法 琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段化；γ-射线照射。结果 CNE-2B在进行正常及受γ-射线照射后传代培养时，其细胞总数的增加速度比导入载体的对照组CNE-2P细胞株明显减慢；自发性细胞凋亡数明显增加。CNE-2B细胞接种到10只裸鼠双侧背部皮下均未见形成移植瘤(0/20)，而对照的10只裸鼠的成瘤率为100 %(20/20)。结论 转导人bax α基因的CNE-2B细胞株的生物学行为发生了显著性改变(P<0.01)。
, 百拇医药
中图分类号：R73-362 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0258-03
APOPTOSIS AND TRANSPLANTABILITY OF CNE-2 CELL LINE CONTAINING HUMAN bax α GENE (CNE-2B) IN NUDE MICE
ZHANG Qing-xiu
(Department of Biochemistry,# Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
ZHU Zhen-yu
(Department of Biochemistry,# Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
, 百拇医药
HUANG Bi-jun, et al.
(Department of Biochemistry,# Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
Abstract：Objective To observe the changing of biological behavior in human poorly differentiated nasopharyngeal cell line (CNE-2B), which is integrated with human bax α gene. Methods DNA fragmentation analysis by agarose gel electrophoresis; γ-rays irradiation. Results CNE-2B cell line grew much slower than CNE-2P cell line (containg pSFFV-neo without human baxα gene) Whether 60Co γ ray irradiation was given or not. Spontaneous apoptotic cell number of CNE-2B increased greatly. No transplanted tumor occurred after CNE-2B cells were inoculated subcutaneously into nude mice(0/20), while CNE-2P cells' transplantability was 100 % (20/20). Conclusion The biological behavior of CNE-2B was significantly changed (P<0.01) in compare with CNE-2P cell line as control.
, http://www.100md.com
Key words： Gene,bcl-2； Nasopharyngeal neoplasm; Apoptosis; Mice,nude
细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，不仅参与生物体发育及正常组织动态平衡的维持，而且多种肿瘤的发生、发展及转归均与PCD有关[1]，促进肿瘤细胞发生PCD已成为目前治疗肿瘤的目标之一。促进PCD的基因有多种如bad,bak,bax,bcl-x-s及bik等，bax基因发现于1993年[2]，Bax蛋白质(Bax)可与Bcl-2形成异二聚体而消除bcl-2的抑制PCD的作用，从而能促进肿瘤细胞发生PCD的作用[3，4]。已有报道[5]人0.62 kb的bax α cDNA与真核表达载体pSFFV-neo正向连接重组体的构建、转导及鉴定。本文对照研究能稳定表达人bax α蛋白质的低分化鼻咽癌细胞株CNE-2B与仅导入pSFFV-neo载合格的CNE-2P细胞株(对照组)的细胞总数改变、自发性细胞凋亡、对γ-射线照射的反应性及其裸鼠皮下接种形成移植瘤能力等生物学行为的差异。
, 百拇医药
材料与方法
一、实验材料
(一)细胞株 人低分化鼻咽癌细胞株(CNE-2)，由本校肿瘤防治中心提供；CNE-2P及CNE-2B由本室建立及鉴定。
(二)实验动物 BALB/c裸鼠，4周龄，雌雄兼用，共20只，购于本校动物中心，在无特殊病原体(specific-pathogen free ,SPF)条件下饲养、接种。
二、实验方法
(一)细胞计数及死细胞数检测 台盼蓝染色，检测死细胞数目(实验重复3次)。
(二)60Co γ-射线照射 CNE-2P和CNE-2B每瓶(细胞数均为1×106)分别接受0.25，0.50，1.00及2.00 Gy的γ-射线照射后，进行检测。
, 百拇医药
(三)细胞株DNA电泳 不同剂量γ-射线照射后，常规培养12 d,离心收集细胞，按文献方法[6]。
(四)动物分组及细胞株接种[7] 将20只裸鼠随机分成2组(各10只)，分别在裸鼠双侧颈背部皮下接种未受γ-射线照射的CNE-2P细胞株(对照组)和CNE-2B细胞株(实验组)，每组接种细胞数均为5×105。
(五)统计 用方差分析法。
结果
一、细胞株增殖情况 CNE-2B细胞株的增殖速度较对照组CNE-2P明显减慢，经过6次传代培养后细胞总数仅为对照组的1/6左右，P<0.01(见表1)。
表1 每次换液前的总细胞计数(1×106)* 细胞株
, http://www.100md.com
培养细胞天数
0
2
4
6
8
10
12
CNE-2P
1.0
1.7
2.9
5.1
, http://www.100md.com 7.5
9.6
12.8
CNE-2B
1.0
1.2
1.4
1.6
1.7
1.9
2.1
P
>0.05
, http://www.100md.com
>0.05
>0.05
>0.05
<0.05
<0.05
<0.01
*实验重复3次 二、细胞株自发死亡情况 正常传代培养时，CNE-2B较CNE-2P细胞株死亡细胞所占的百分数亦明显增加，分别为18.7%±5.3%和3.9%±1.3%(P<0.05)。
三、γ-射线对细胞株的影响 低剂量(≤0.50 Gy)的γ-射线对CNE-2P的早期(≤6 d)细胞数改变无明显影响，却能明显抑制CNE-2B细胞株细胞总数的增加；剂量≥1.00 Gy的γ-射线照射能使CNE-2B的细胞数增加受到明显抑制，因原有细胞死亡等原因，细胞数较开始传代时反而减少(见表2)。
, http://www.100md.com
表2 不同剂量γ-射线照射后，每次换液前的
总细胞计数(×105) 细胞株
照射剂
(Gy)
培养细胞天数
0
2
4
6
8
10
12
, 百拇医药 CNE-2P
0.25
0.50
1.00
2.00
1.0
1.0
1.0
1.0
1.7
1.6
1.6
1.3
, http://www.100md.com
2.8
2.6
2.3
1.5
4.9
5.2
4.3
1.9
6.9
5.6
5.0
2.6
9.2
, 百拇医药
6.7
5.9
3.2
10.7
8.5
6.7
3.5
CNE-2B
0.25
0.50
1.00
2.00
1.0
, 百拇医药
1.0
1.0
1.0
1.1
1.0
1.0
0.8
1.2
1.1
0.9
0.6
1.2
1.1
, 百拇医药
0.9
0.5
1.3
1.2
0.8
0.4
1.5
1.3
0.7
0.3
1.8
1.2
0.5
, http://www.100md.com
0.2
*实验重复3次
四、细胞株DNA电泳结果 CNE-2B在正常换液传代时，已有较多的自发性死亡细胞出现，电泳时出现细胞凋亡特征性的“梯形”(ladder)DNA降解片段。随γ-射线照射剂量的增加，CNE-2B和CNE-2P细胞株的凋亡均更为明显。而在受相同剂量的γ-射线照射后，CNE-2B较CNE-2P细胞凋亡程度明显为强(见附图)。
附图 不同剂量γ-射线照射后的CNE-2P和CNE-2B细胞DNA琼脂糖凝胶电泳
1.未照射的CNE-2P细胞株；2.未经照射的CNE-2B细胞株；
3，5分别受0.25 Gy，1.00 Gy γ-射线照射的CNE-2P细胞株；
, 百拇医药
4，6，7分别受0.25，1.00，2.00 Gy γ-射线照射的CNE-2B细胞株；
8.pBR322/Bst N I(1 857，1 060，929，383，121 bp)
五、细胞株裸鼠皮下成瘤能力 对照组裸鼠在接种CNE-2P细胞株后，移植瘤生长曲线与本室已报道的接种CNE-2细胞株相似[8]，即接种后第5d已可见皮下移植瘤形成，6～14 d生长开始加速，15～30 d生长速度最快，30 d后速度减慢，成瘤率为100 %。对照组裸鼠自第43 d开始有荷瘤裸鼠死亡，79 d内全部死亡，而接种CNE-2B的实验组裸鼠除62 d有1只意外死亡外(尸检未见皮下移植瘤)，其余9只在第80 d 处死后尸检未见有移植瘤形成。初步表明CNE-2B的裸鼠皮下成瘤能力较对照细胞株显著减弱(P<0.01)。
讨论
, 百拇医药
细胞凋亡与参与体内多种生理与病理过程，生物个体在生长发育过程中依赖细胞凋亡这种独特的细胞死亡方式来清除某些对机体无益的细胞，在保持正常组织的平衡、稳定方面具有重要作用。细胞凋亡失衡是导致人类的多种肿瘤发生、发展及转移的重要原因之一[1]。细胞凋亡受基因调控，促进细胞凋亡的bax基因，其表达产物Bax蛋白质可与Bcl-2形成异二聚体而消除bcl-2抑制细胞凋亡的作用，从而能促进肿瘤细胞发生凋亡作用[2～4]。多种肿瘤组织受到γ-射线照射后，细胞死亡方式部分与凋亡有关[8，9]。本研究对前文[5]转导bax α并成功表达的CNE-2B细胞株进行了初步的生物学行为研究。结果显示CNE-2B在正常传代培养时其细胞总数增加的速度比仅含载体的CNE-2P明显减慢，自发性细胞死亡数明显增加；而在受到不同剂量60Coγ-射线照射后，再传代培养时，上述差异更加明显，说明两种因素综合作用可导致肿瘤细胞株更易死亡，为恶性肿瘤治疗提供了一种新途径。CNE-2B的裸鼠皮下形成移植瘤的能力明显减弱，但是否真正失去了裸鼠成瘤能力尚需进一步研究。
, 百拇医药
感谢：感谢美国华盛顿大医学院Stanley J. Korsmeyer博士惠赠baxα cDNA、质粒pSFFV-neo及相关资料。
基金项目：广东省青年基金(950355)及广东省卫生厅基金资助项目
作者简介：朱振宇，男，医学博士，教授。
参考文献
[1]Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease〔J〕. Science,1995,267:1456
[2]Yin CY, Kundson CM, Korsmeyer SJ, et al. Bax suppresses tumorignesis and stimulated apoptosis in vivo〔J〕. Nature,1997，385：637
, 百拇医药
[3]Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line〔J〕. Blood, 1993,81(1):151
[4]Oltvai ZN, Milliman CT, Korsmeyer ST. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death〔J〕. Cell, 1993,74:609
[5]张清秀，朱振宇，马涧泉.Bax基因加强表达对Raji细胞程序性死亡的效应研究〔J〕. 中山医科大学学报，1998，19(2)：101
[6]朱振宇，潘景轩，赵群，等.地塞米松诱导裸鼠脾细胞凋亡的研究〔J〕.中国病理生理学杂志，1996，12(2)：131
, 百拇医药
[7]朱振宇，简志瀚，李树浓，裸鼠荷人鼻咽癌细胞株后免疫状态的动态观察〔J〕.中国病理生理学杂志，1992，8(5)：585
[8]Schulte HR, Grasl KB, Bursch W. Tumor development and apoptosis〔J〕. Int Arch Allergy Immunol,1994,105(4):363
[9]Martin SJ, Green DR. Apoptosis as goal of cancer therapy〔J〕. Curr Opin Oncol,1994,6(6):616
(收稿日期：1998-03-18；修回日期：1998-06-22), 百拇医药