视网膜神经上皮移植研究进展
作者：赵淑姣 徐海峰 王红 王传富
单位：赵淑姣(烟台毓璜顶医院 山东烟台264000)；徐海峰(烟台毓璜顶医院 山东烟台264000)；王红(烟台毓璜顶医院 山东烟台264000)；王传富(青岛医学院附属医院)
关键词：
山东医药001444 自1959年Royo等报道了第1例视网膜移植以来，视网膜移植经历了前房内移植、玻璃体腔移植、中枢神经系统移植。目前多集中于最接近于其生理功能的视网膜内及视网膜下移植的研究。虽然这项技术还没有达到人们所期望的程度，但随着分子生物学、遗传学等的发展及显微手术技巧的提高，视网膜移植术已展现出诱人的前景。本文就视网膜移植有关的几个主要问题及其研究现状作一综述。
1 玫瑰花结的形成
在视网膜移植的研究中，无论供体是鼠、兔、人，移植部位是前房、玻璃体腔，还是视网膜内及视网膜下腔，均可见移植物中细胞呈花环状排列，花环状结构的形成机理还不完全清楚。Aramant认为花环的形成是细胞的重新排列而不是真正的发育。有些研究[1，2]则认为花环的形成与视网膜色素上皮、胚胎组织生长及基因表达异常有关。其根据是视网膜色素上皮在视网膜发育过程中可通过细胞因子诱导成神经细胞增殖分化，对感光细胞的发育起重要的调节作用，先天性色素上皮病变造成的视网膜营养不良可见感光细胞呈花环状排列。因此，处于胚胎期的视网膜感光细胞移植进入成熟体内，可能接受处于不同成熟程度的色素上皮诱导而出现这种异常排列。此外，胚胎视网膜的发育成熟需要多种基因的控制，处于不同成熟程度的视网膜调控基因调节视网膜细胞生长发育使之成层状排列，而基因表达异常则可能使感光细胞生长呈花环状。
, 百拇医药
玫瑰花结构的出现，虽然标志着移植片的存活，但却无正常的视功能。故许多学者就如何克服玫瑰花结的形成作了大量的探索。Gouras等[3]研究发现，只要能够将视网膜神经上皮植入到视网膜色素上皮的适当位置上，感光细胞就可以正常存活，其外节及神经突触均表现正常，移植的感光细胞能够在原视网膜损伤部位形成新的结构正常的视细胞层。Seiler等[4]将视网膜色素上皮与神经上皮一同移植，发现结果明显优于单纯神经上皮移植，植片分层清晰，结构更接近正常。Sharma等[5]则认为植片的取材及移植方法对正常的发育很关键。另外，宿主―移植片界面的许多未知因子对玫瑰花结的形成及感光细胞外节的发育也起着举足轻重的作用。Ghosh[6]等采用全神经上皮移植，取得了令人鼓舞的成果。他们用一种特制的小钩样器械，通过睫状体平坦部玻璃体切割，将全层胚胎兔视网膜植入同种成年兔视网膜下腔，发现长达1.8mm的平整视网膜植片，其分层、排列均正常，感光细胞外节与色素上皮之间正常结合。Ghosh等对比研究证明，胚胎兔全层神经上皮移植较成年兔全层或外层神经视网膜移植、胚胎兔外层神经视网膜移植在手术并发症、术后视网膜的正常分层、极性发育及与宿主的融合等方面均表现出明显的优势。
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2 视网膜移植片的成功表达
视网膜移植最终的目的是获得正常的视功能。近几年来，众多学者们从神经生理学、组织学等方面的研究证实，视网膜植片可与大脑中枢建立正常的结构和功能联系，并参与宿主的行为过程，表达一定的视功能。中枢神经系统视网膜移植发现，植片在中枢神经系统内形成的突触与正常的突触结构相似，光照植片可在脑皮质测得相应反应电位，并引起宿主瞳孔反应。
Aramant等将胚胎兔视网膜移植到成年的兔的视网膜损伤部位，3～11个月后分别特殊染色并电镜下观察，发现植片的神经纤维可深入宿主视网膜内并与只形成突触。Zucker等[7]的研究也证实植片感光细胞的内外节均正常发育，基突触结构与正常视网膜相似，如内丛状层、双极细胞、无长突细胞及神经节细胞均具有正常的突触结构，即植片拥有光传导及视功能形成的所有结构成分。Serler等用免疫组化法证实，人的胚胎视网膜植入宿主视网膜下腔后，可继续发育，产生相同胚龄正常视网膜所拥有的特异蛋白，如锥体特异视蛋白、视紫红质、a-视杆转换蛋白、S抗原等。而Adolph等则用电生理方法测定了视网膜移植片的功能，他们发现植片对光刺激的反应与周围宿主视网膜的反应相差无几。Ghosh等在胚胎兔全厚视网膜神经上皮移植中对免疫组化标记物的研究中发现胚胎兔全厚视网膜神经上皮移植可产生正常的视网膜外观和数种视网膜正常功能所必须的成分，这在近几年报道的其他种类的移植中是不存在的。
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3 免疫反应
视网膜移植，如同其他组织器官的移植一样，免疫排斥反应是人们关注的热点之一。视网膜具有多种抗原，其中包括S抗原、光感受器间维生素A结合蛋白、P抗原、A抗原等，故许多学者就视网膜移植后是否发生排斥反应作了大量探索。
以往认为眼的前房及玻璃体腔为免疫赦免部位，而Jiang等的研究则表明视网膜下腔也为免疫赦免部位之一，他们将同种异体的视网膜分别移植到结膜下、玻篱体腔及视网膜下腔，观察术后排斥反应。移植在视网膜下腔及玻璃体腔的视网膜分化良好，未发现炎症改变，而移植在结膜下的视网膜遭免疫排斥反应而消失，表现出强烈的特异性超敏反应，其他许多反应也有类似表现。Gouras等[3]在同种鼠视网膜下腔移植中，观察9个月无排斥反应，在视网膜移植区未见到淋巴细胞、单核细胞及巨噬细胞等炎症细胞的聚集。术后用免疫抑制剂和不用无明显的差别。在人的视网膜移植中，Kaplan等[8]将两个取自尸眼的视网膜移植到两位视网膜色素上皮变性患者黄斑部视网膜下腔，观察1年，无黄斑部囊样水肿、葡萄膜炎等任何免疫排斥迹象。说明视网膜下间隙移植存在一定限度的免疫赦免。视网膜下腔表现的这种免疫赦免状态的可能的解释是与其特殊的解剖结构有关，即视网膜下腔处在玻璃体、视网膜神经上皮层及色素上皮层之间，有血―视网膜屏障保护，成为免疫赦免状态的基础，另外也与视网膜感光细胞Ⅰ类抗原表达较弱，几乎无Ⅱ类抗原表达有关。
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4 移植材料的选择
目前视网膜移植的研究多采用鼠、兔的视网膜做供体，亦有用猴、人的。其中，小鼠供体年龄多为胎龄10天至生后3天，大鼠供体多为胎龄13天至生后5天，兔供体多为胎龄15天至生后5天。研究发现，胚胎视网膜植入视网膜下腔后可继续正常发育、分化，产生相同胚龄视网膜所具备的实杆、视锥细胞，Muller细胞、特异蛋白，感光细胞的内外节均正常发育且具备光传导所必需的结构。Ghosh等[6]发现胚龄小于15天的大鼠视网膜移植后其视网膜结构发育较大胚龄者(19天、21天)差，故应采用发育较成熟的视网膜做供体。
Diloreti等[9]将人胚胎视网膜用Optisol于4℃保存0～7天，发现保存48小时时，视网膜内层少量细胞水肿，有核浓缩现象，细胞存活率(83.2±8.5)%，而至7天时外丛状层仍保存很好，但内层核浓缩及细胞水肿更明显，细胞存活率(76.8±4.6)%。用保存2～7天的视网膜植入兔视网膜下腔，1个月后光镜检查见植片与宿主视网膜整和良好并能正常分化。
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至于供体的形态，细胞悬液移植由于破坏了感光细胞间的正常联系及神经胶质细胞的营养支持，移植后细胞成活率低等较多局限性而逐渐被组织移植取代，而组织移植有分成单纯视细胞层移植、视神经上皮层移植及视神经上皮层与色素上皮层联合移植，这些方法避免了细胞移植的缺点，植片拥有更接近正常的组织结构及功能表达。至于哪一种效果最佳，目前尚无定论。
随着分子生物学及生物医学技术的不但发展，常规视网膜移植术已难以满足人类对视网膜疾病研究的需要。人们开始设想将一些基因导入植片细胞中，然后通过视网膜移植方法导入宿主视网膜而达到治疗某些视网膜遗传病的目的。Gouras等将用Lac-ZZ标记的转基因鼠感光细胞移植到成年鼠视网膜下腔，发现转基因感光细胞与正常感光细胞同样存活、生长、且Lac-ZZ基因也得以表达。这无疑为某些遗传病的治疗提供了又一条新途径。
5 视网膜移植术亟待解决的问题
视网膜移植研究的不断深入，为某些眼底病的治疗开辟了新的途径。但目前这项技术的应用还没有达到人类所希望的程度，还有许多问题需要解决：①最低限度地减少对眼球和视网膜的损伤；②最佳感光细胞的选择，即植入多少感光细胞能满足治疗目的；③植片形态及材料来源。另外，微环境中细胞外基质和一些生长因子也影响植片存活。
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参考文献
1，Lee JE，Hollenberg SM，Snider L，et al.Conversion of Xenopus ectoderm into nerrons by Neurons by Neuro D，a basic helix-loop-helix protein.Science，1995，268：836～844.
2，Tomita K，Ishibashi M，Nakahara K，et al.Mamalian hairy and enhencer of split homolog regulates differentiation of retinal nerrons and is essential for eye morphogenesis.Neuron，1996，16：723～734.
3，Gouras P，Du J，Kjeldbye H，et al.Long-term photoreceptor transplant in dystrophic and normal mouse retina，Invest-pphthalmol-Vis-Sci，1994，35(8)：3145～3153.
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4，Seiler-MJ，Bergstrom-A.Co-transplantation of embryonic retinas and retinal Pigment epithelial cells to rabbit retina.Curr-Eye-Res，1995，14(3)199～207.
5，Sharma-RK，Bergstrom-A，Ehinger-B.Influence of technique and transplantation site on rosette formation in rabbit retinal transplants.A cta-ophthalmol-Scand，1997，75(1)：3～10.
6，Ghosh-F，Arner-K，Ehinger-B.Transplant of full-thickness embryonic rabbit retina using parsplana vitrectomy.Retina，1998，18(2)：136～42.
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7，Zncker-CL，Ehinger-B，Seile-M，et al.Ultrastructural circuitry in retinal cell transplants to rat retina.J-Neural-Transplant-plast，1994，5(1)：17～29.
8，Kaplan-HJ，Tezel-TH，Berger-AS，et al.Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa.Arch-ophthalmol，1997，115(97)：1168～72.
9，Diloreto-DA，Cerro-C，Lazar-ES，et al.Storage of human fetal retinal in option prior to subretinal transplantation.Cell-transplant，1996，5(5)：553～61.
(2000-02-08收稿), http://www.100md.com
单位：赵淑姣(烟台毓璜顶医院 山东烟台264000)；徐海峰(烟台毓璜顶医院 山东烟台264000)；王红(烟台毓璜顶医院 山东烟台264000)；王传富(青岛医学院附属医院)
关键词：
山东医药001444 自1959年Royo等报道了第1例视网膜移植以来，视网膜移植经历了前房内移植、玻璃体腔移植、中枢神经系统移植。目前多集中于最接近于其生理功能的视网膜内及视网膜下移植的研究。虽然这项技术还没有达到人们所期望的程度，但随着分子生物学、遗传学等的发展及显微手术技巧的提高，视网膜移植术已展现出诱人的前景。本文就视网膜移植有关的几个主要问题及其研究现状作一综述。
1 玫瑰花结的形成
在视网膜移植的研究中，无论供体是鼠、兔、人，移植部位是前房、玻璃体腔，还是视网膜内及视网膜下腔，均可见移植物中细胞呈花环状排列，花环状结构的形成机理还不完全清楚。Aramant认为花环的形成是细胞的重新排列而不是真正的发育。有些研究[1，2]则认为花环的形成与视网膜色素上皮、胚胎组织生长及基因表达异常有关。其根据是视网膜色素上皮在视网膜发育过程中可通过细胞因子诱导成神经细胞增殖分化，对感光细胞的发育起重要的调节作用，先天性色素上皮病变造成的视网膜营养不良可见感光细胞呈花环状排列。因此，处于胚胎期的视网膜感光细胞移植进入成熟体内，可能接受处于不同成熟程度的色素上皮诱导而出现这种异常排列。此外，胚胎视网膜的发育成熟需要多种基因的控制，处于不同成熟程度的视网膜调控基因调节视网膜细胞生长发育使之成层状排列，而基因表达异常则可能使感光细胞生长呈花环状。
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玫瑰花结构的出现，虽然标志着移植片的存活，但却无正常的视功能。故许多学者就如何克服玫瑰花结的形成作了大量的探索。Gouras等[3]研究发现，只要能够将视网膜神经上皮植入到视网膜色素上皮的适当位置上，感光细胞就可以正常存活，其外节及神经突触均表现正常，移植的感光细胞能够在原视网膜损伤部位形成新的结构正常的视细胞层。Seiler等[4]将视网膜色素上皮与神经上皮一同移植，发现结果明显优于单纯神经上皮移植，植片分层清晰，结构更接近正常。Sharma等[5]则认为植片的取材及移植方法对正常的发育很关键。另外，宿主―移植片界面的许多未知因子对玫瑰花结的形成及感光细胞外节的发育也起着举足轻重的作用。Ghosh[6]等采用全神经上皮移植，取得了令人鼓舞的成果。他们用一种特制的小钩样器械，通过睫状体平坦部玻璃体切割，将全层胚胎兔视网膜植入同种成年兔视网膜下腔，发现长达1.8mm的平整视网膜植片，其分层、排列均正常，感光细胞外节与色素上皮之间正常结合。Ghosh等对比研究证明，胚胎兔全层神经上皮移植较成年兔全层或外层神经视网膜移植、胚胎兔外层神经视网膜移植在手术并发症、术后视网膜的正常分层、极性发育及与宿主的融合等方面均表现出明显的优势。
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2 视网膜移植片的成功表达
视网膜移植最终的目的是获得正常的视功能。近几年来，众多学者们从神经生理学、组织学等方面的研究证实，视网膜植片可与大脑中枢建立正常的结构和功能联系，并参与宿主的行为过程，表达一定的视功能。中枢神经系统视网膜移植发现，植片在中枢神经系统内形成的突触与正常的突触结构相似，光照植片可在脑皮质测得相应反应电位，并引起宿主瞳孔反应。
Aramant等将胚胎兔视网膜移植到成年的兔的视网膜损伤部位，3～11个月后分别特殊染色并电镜下观察，发现植片的神经纤维可深入宿主视网膜内并与只形成突触。Zucker等[7]的研究也证实植片感光细胞的内外节均正常发育，基突触结构与正常视网膜相似，如内丛状层、双极细胞、无长突细胞及神经节细胞均具有正常的突触结构，即植片拥有光传导及视功能形成的所有结构成分。Serler等用免疫组化法证实，人的胚胎视网膜植入宿主视网膜下腔后，可继续发育，产生相同胚龄正常视网膜所拥有的特异蛋白，如锥体特异视蛋白、视紫红质、a-视杆转换蛋白、S抗原等。而Adolph等则用电生理方法测定了视网膜移植片的功能，他们发现植片对光刺激的反应与周围宿主视网膜的反应相差无几。Ghosh等在胚胎兔全厚视网膜神经上皮移植中对免疫组化标记物的研究中发现胚胎兔全厚视网膜神经上皮移植可产生正常的视网膜外观和数种视网膜正常功能所必须的成分，这在近几年报道的其他种类的移植中是不存在的。
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3 免疫反应
视网膜移植，如同其他组织器官的移植一样，免疫排斥反应是人们关注的热点之一。视网膜具有多种抗原，其中包括S抗原、光感受器间维生素A结合蛋白、P抗原、A抗原等，故许多学者就视网膜移植后是否发生排斥反应作了大量探索。
以往认为眼的前房及玻璃体腔为免疫赦免部位，而Jiang等的研究则表明视网膜下腔也为免疫赦免部位之一，他们将同种异体的视网膜分别移植到结膜下、玻篱体腔及视网膜下腔，观察术后排斥反应。移植在视网膜下腔及玻璃体腔的视网膜分化良好，未发现炎症改变，而移植在结膜下的视网膜遭免疫排斥反应而消失，表现出强烈的特异性超敏反应，其他许多反应也有类似表现。Gouras等[3]在同种鼠视网膜下腔移植中，观察9个月无排斥反应，在视网膜移植区未见到淋巴细胞、单核细胞及巨噬细胞等炎症细胞的聚集。术后用免疫抑制剂和不用无明显的差别。在人的视网膜移植中，Kaplan等[8]将两个取自尸眼的视网膜移植到两位视网膜色素上皮变性患者黄斑部视网膜下腔，观察1年，无黄斑部囊样水肿、葡萄膜炎等任何免疫排斥迹象。说明视网膜下间隙移植存在一定限度的免疫赦免。视网膜下腔表现的这种免疫赦免状态的可能的解释是与其特殊的解剖结构有关，即视网膜下腔处在玻璃体、视网膜神经上皮层及色素上皮层之间，有血―视网膜屏障保护，成为免疫赦免状态的基础，另外也与视网膜感光细胞Ⅰ类抗原表达较弱，几乎无Ⅱ类抗原表达有关。
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4 移植材料的选择
目前视网膜移植的研究多采用鼠、兔的视网膜做供体，亦有用猴、人的。其中，小鼠供体年龄多为胎龄10天至生后3天，大鼠供体多为胎龄13天至生后5天，兔供体多为胎龄15天至生后5天。研究发现，胚胎视网膜植入视网膜下腔后可继续正常发育、分化，产生相同胚龄视网膜所具备的实杆、视锥细胞，Muller细胞、特异蛋白，感光细胞的内外节均正常发育且具备光传导所必需的结构。Ghosh等[6]发现胚龄小于15天的大鼠视网膜移植后其视网膜结构发育较大胚龄者(19天、21天)差，故应采用发育较成熟的视网膜做供体。
Diloreti等[9]将人胚胎视网膜用Optisol于4℃保存0～7天，发现保存48小时时，视网膜内层少量细胞水肿，有核浓缩现象，细胞存活率(83.2±8.5)%，而至7天时外丛状层仍保存很好，但内层核浓缩及细胞水肿更明显，细胞存活率(76.8±4.6)%。用保存2～7天的视网膜植入兔视网膜下腔，1个月后光镜检查见植片与宿主视网膜整和良好并能正常分化。
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至于供体的形态，细胞悬液移植由于破坏了感光细胞间的正常联系及神经胶质细胞的营养支持，移植后细胞成活率低等较多局限性而逐渐被组织移植取代，而组织移植有分成单纯视细胞层移植、视神经上皮层移植及视神经上皮层与色素上皮层联合移植，这些方法避免了细胞移植的缺点，植片拥有更接近正常的组织结构及功能表达。至于哪一种效果最佳，目前尚无定论。
随着分子生物学及生物医学技术的不但发展，常规视网膜移植术已难以满足人类对视网膜疾病研究的需要。人们开始设想将一些基因导入植片细胞中，然后通过视网膜移植方法导入宿主视网膜而达到治疗某些视网膜遗传病的目的。Gouras等将用Lac-ZZ标记的转基因鼠感光细胞移植到成年鼠视网膜下腔，发现转基因感光细胞与正常感光细胞同样存活、生长、且Lac-ZZ基因也得以表达。这无疑为某些遗传病的治疗提供了又一条新途径。
5 视网膜移植术亟待解决的问题
视网膜移植研究的不断深入，为某些眼底病的治疗开辟了新的途径。但目前这项技术的应用还没有达到人类所希望的程度，还有许多问题需要解决：①最低限度地减少对眼球和视网膜的损伤；②最佳感光细胞的选择，即植入多少感光细胞能满足治疗目的；③植片形态及材料来源。另外，微环境中细胞外基质和一些生长因子也影响植片存活。
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参考文献
1，Lee JE，Hollenberg SM，Snider L，et al.Conversion of Xenopus ectoderm into nerrons by Neurons by Neuro D，a basic helix-loop-helix protein.Science，1995，268：836～844.
2，Tomita K，Ishibashi M，Nakahara K，et al.Mamalian hairy and enhencer of split homolog regulates differentiation of retinal nerrons and is essential for eye morphogenesis.Neuron，1996，16：723～734.
3，Gouras P，Du J，Kjeldbye H，et al.Long-term photoreceptor transplant in dystrophic and normal mouse retina，Invest-pphthalmol-Vis-Sci，1994，35(8)：3145～3153.
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4，Seiler-MJ，Bergstrom-A.Co-transplantation of embryonic retinas and retinal Pigment epithelial cells to rabbit retina.Curr-Eye-Res，1995，14(3)199～207.
5，Sharma-RK，Bergstrom-A，Ehinger-B.Influence of technique and transplantation site on rosette formation in rabbit retinal transplants.A cta-ophthalmol-Scand，1997，75(1)：3～10.
6，Ghosh-F，Arner-K，Ehinger-B.Transplant of full-thickness embryonic rabbit retina using parsplana vitrectomy.Retina，1998，18(2)：136～42.
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7，Zncker-CL，Ehinger-B，Seile-M，et al.Ultrastructural circuitry in retinal cell transplants to rat retina.J-Neural-Transplant-plast，1994，5(1)：17～29.
8，Kaplan-HJ，Tezel-TH，Berger-AS，et al.Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa.Arch-ophthalmol，1997，115(97)：1168～72.
9，Diloreto-DA，Cerro-C，Lazar-ES，et al.Storage of human fetal retinal in option prior to subretinal transplantation.Cell-transplant，1996，5(5)：553～61.
(2000-02-08收稿), http://www.100md.com