软骨细胞移植修复髁突软骨损伤的实验研究
作者：姚向前 马绪臣 张震康
单位：北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科，100081
关键词：下颌骨髁状突；软骨；关节；细胞移植
中华口腔医学杂志000219 【摘要】 目的 研究软骨细胞移植修复髁突软骨损伤后的效果及修复组织的性质。方法 选用成年雄性白兔53只，分成5组。第1组：细胞移植组；第2组：单纯胶原膜植入组；第3组：在实验动物的髁突前斜面形成直径2 mm的全层损伤后，未植入任何物品；第4组：空白手术对照组；第5组：正常对照组。结果 细胞移植组动物的髁突软骨损伤区形成软骨组织修复。结论 异体兔髁突软骨细胞移植能够形成类似正常的关节软骨修复髁突软骨缺损。
The repairment of the condylar cartilage defect by transplantation of chondrocytes embedded in the collagen membrane
, 百拇医药
AO Xiangqian, MA Xuchen, ZHANG Zhenkang.
(Department of Oral maxillofacial Surgery, School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081, China)
【Abstract】 Objective To study the effect of repairing the defect on the condylar articular cartilage by chondrocyte transplantation. Methods A full-thickness defect was made in the condylar articular cartilage of the adult rabbit. The isolated condylar chondrocytes of the rabbits cultured in vitro for one week were embedded in the collagen membrane, and then transplantated into the defect. Results The defects of the condylar articular cartilage were repaired with cartilage tissue. Conclusions The defect of the condylar articular cartilage could be repaired with articular cartilage-like tissue by transplantation of the condylar chondrocytes.
, 百拇医药
【Key words】 Mandibular condyle； Cartilage, articular； Cell transplantation
关节软骨自身修复能力差，损伤后治疗困难，重要原因之一是缺乏可供修复的软骨源性细胞[1]。许多研究表明，应用骨膜、软骨膜移植等修复髁突软骨损伤，虽能改善修复组织的性质、缓解症状，但不能使损伤的髁突软骨恢复正常组织结构[2，3]。我们探讨应用同种异体髁突软骨细胞接种于胶原膜后，移植修复髁突软骨全层损伤问题。
材料和方法
1.髁突软骨细胞的分离、培养和接种：按作者曾报道的方法[4]分离3只兔的髁突软骨细胞。用医用组织引导再生胶原膜(北京革瑞德生物制品中心提供)作为细胞载体，此膜呈多孔片状，由天然胶原蛋白人工合成，在体内75 d完全降解。将分离的髁突软骨细胞用DMEM细胞培养基(美国Gibco公司生产)调整细胞密度为1×1010个/L。将一片胶原膜置于35 mm塑胶培养皿内，吸取软骨细胞混悬液1 ml均匀滴于胶原膜上，于37℃预孵4 h后，再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基2 ml，于37℃、5% CO2的饱和湿度空气中培养。1周后用于细胞移植。
, 百拇医药
2.实验动物及分组：选用6个月龄雄性白兔53只(本院动物室提供)，体重2～2.5 kg。随机分成下列各组：第1组(细胞移植组)：20只。在髁突前斜面的中央处形成直径2 mm的全层损伤后，植入已接种软骨细胞的胶原膜。第2组(单纯胶原膜植入组)：6只。在髁突前斜面的中央处形成直径2 mm的全层损伤后，植入未接种软骨细胞的胶原膜。第3组：18只。伴软骨下骨皮质穿通的髁突软骨全层损伤组。第4组：6只。空白手术对照组。第5组：2只。正常对照组。此外，另随机选用1只白兔作为透射电镜观察正常对照。
3.手术方法：经耳缘静脉注射2.5%的戊巴比妥钠溶液(1 ml/kg体重)将动物麻醉。本实验正常对照组及电镜观察正常动物取用双侧关节标本，其余各组动物均用左颞下颌关节作为实验侧。在无菌条件下，自外眦外侧5 mm处至外耳道方向行2 cm皮肤切口，分离皮下组织，暴露关节囊后，水平切开，进入关节腔，切开关节盘的外侧附着，暴露髁突关节面。用701#裂钻在髁突前斜面的中央处钻一直径2 mm的孔，穿透关节软骨及软骨下骨皮质至骨髓腔。然后，细胞移植组动物植入接种有软骨细胞的胶原膜，即将胶原膜修剪成稍大于髁突软骨损伤区的小块，仔细填塞于缺损内，使其与孔壁接触紧密、表面与周围正常关节软骨平齐。单纯胶原膜植入组动物以同样方法植入未接种软骨细胞的胶原膜。伴软骨下骨皮质穿通的髁突软骨全层损伤组不植入任何物品。用无菌生理盐水充分冲洗后，将关节盘复位，分层缝合关节囊、皮下组织及皮肤。空白手术对照组动物除不造成髁突软骨损伤外，其余手术步骤同前。术后动物下颌不制动，喂养颗粒状常规兔饲料。
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4.实验观察：分别于术后1、2、4、8、12和20周，将实验动物以过量麻醉处死。每次处死第1组和第3组动物各3只、第2组和第4组动物各1只行光镜观察。由于细胞移植组动物于术后12周和20周时已不能区分修复组织与原正常组织，随机选择术后8周时的2只动物处死，解剖分离实验侧髁突，沿修复组织与正常关节软骨交界处仔细切取修复组织，立即固定于3%戊二醛内，分切成约1 mm3大小，常规制作超薄切片，透射电镜下观察。
其余各实验组动物处死后，解剖分离实验侧髁突，观察其大体形态，然后固定于10%甲醛溶液内1周，混合脱钙液内脱钙1周。常规脱水、石蜡包埋，行5 μm厚矢状连续切片。选择损伤区中央部组织切片10张，间隔行HE和甲苯胺蓝染色，观察修复组织的结构和细胞外基质中蛋白多糖含量的变化。
结果
1.大体形态观察结果：单纯胶原膜植入组动物的髁突形态与伴软骨下骨皮质穿通的髁突软骨全层损伤组基本相同(6/6)。在整个实验观察期间内，细胞移植组除术后1周和12周时各有1侧髁突软骨损伤区凹陷，关节面前后径增大、有侵蚀现象外(2/20)，其余所有实验侧髁突的形态与正常对照组基本相同(18/20)。术后1～8周，除1周时1侧外(1/12)，其余所有细胞移植组动物的髁突软骨损伤区均充以修复组织，但与周围正常关节软骨之间的界限清晰可见(11/12)。术后12周和20周时，除12周时1侧外(1/6)，其余所有细胞移植组动物的髁突软骨损伤区均完全修复，肉眼下不能辨认损伤区，修复组织与原正常关节软骨之间互相融合(5/6)。在实验观察期内，所有细胞移植组和单纯植入胶原膜组动物的实验侧标本均无盘-髁粘连(26/26)。
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2.组织学及组织化学观察结果：
(1)单纯胶原膜植入组动物的组织学及组织化学染色与伴软骨下骨皮质穿通的髁突软骨全层损伤组基本相同(6/6)。透射电镜下，正常对照组2侧髁突的软骨细胞呈圆形、多角形，细胞表面有多数微绒毛突起，粗面内质网丰富。
(2)细胞移植组：术后1周时2侧髁突软骨损伤区充满修复组织，与毗邻的正常关节软骨融合，无裂隙，表面光滑。修复组织形成与正常关节软骨相连续的纤维组织层及增殖层，增殖层下方的细胞密集但排列无明显的规律(图1)。高倍镜下，修复组织内的细胞呈圆形、位于软骨陷窝内，为分化良好的软骨细胞。损伤区无软骨下骨皮质。甲苯胺蓝染色无异染性(2/3)。术后1周时的另一侧髁突软骨损伤区凹陷，充满疏松纤维结缔组织，血管丰富。高倍镜下大部分细胞为圆形的未分化间充质细胞，未见软骨组织。甲苯胺蓝染色无异染性(1/3)。术后2周时所有实验侧髁突软骨损伤区修复组织表面与毗邻正常关节软骨平齐，纤维组织层及增殖层与正常者连续。修复组织内细胞密集，高倍镜下为分化良好的软骨细胞。软骨下骨皮质缺如。甲苯胺蓝染色呈弱异染性(3/3)。术后4周时实验侧髁突软骨损伤区修复组织表面与毗邻正常关节软骨平齐，二者间无裂隙。已形成与正常者相连续的软骨下骨皮质。修复组织内为分化良好的软骨细胞，排列杂乱(图2)，甲苯胺蓝染色弱(3/3)。术后8周时所有实验侧髁突软骨损伤区修复组织与毗邻正常软骨及软骨下骨皮质间互相融合。修复组织内肥大软骨细胞层可见部分区域与透明软骨类似，软骨细胞有呈柱状排列的趋势(图3)。甲苯胺蓝染色部分区域呈紫红色，大部分区域染色弱(3/3)。术后12周时2侧髁突软骨损伤区表面光滑，纤维组织层及增殖层与正常者连续，增殖层下方可见分化良好的软骨细胞(图4)，甲苯胺蓝染色弱(2/3)。术后12周时另1侧髁突软骨损伤区的结构与伴有软骨下骨皮质穿通的髁突软骨损伤组相似，损伤区表面为纤维组织、深部为致密骨质，未见软骨细胞(1/3)。术后20周时的所有实验侧髁突软骨损伤区凹陷，稍低于周围正常关节软骨，修复组织与周围正常关节软骨及其下方皮质骨间互相融合，无裂隙。纤维组织层及增殖层与正常者连续，增殖层较厚，肥大软骨细胞层之细胞层数明显减少(图5)。甲苯胺蓝染色呈淡紫红色，比正常者弱(3/3)。光镜观察的全部髁突软骨损伤区修复组织周围均未见淋巴细胞浸润(18/18)。
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细胞移植组术后8周时，透射电镜观察见2侧髁突软骨损伤区修复组织内的软骨细胞为圆形，细胞表面有微绒毛突起，细胞浆内除可见部分粗面内质网扩张外(图6)，其余细胞器与正常髁突软骨细胞基本相同。
图1 软骨细胞移植后1周,修复组织内可见分化良好的软骨细胞(HE ×100) 图2 软骨细胞移植后4周,软骨细胞分化良好、排列杂乱(HE ×200) 图3 软骨细胞移植后8周，损伤区为纤维软骨样组织(HE ×200) 图4 软骨细胞移植后12周，损伤区为纤维软骨样组织(HE ×200)图5 软骨细胞移植后20周，肥大软骨细胞层数明显减少(HE ×200) 图6 软骨细胞移植后8周，细胞浆内可见扩张的内质网(透射电镜 ×6700)
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讨论
本研究表明应用体外培养的髁突软骨细胞移植修复同种异体髁突软骨全层损伤，能够形成基本正常的关节软骨而使损伤区愈合。
一、软骨细胞移植后的功能
本实验在髁突软骨全层损伤后植入接种于胶原膜内的异体软骨细胞，术后观察20周发现，髁突的大体形态基本正常(18/20)，光镜下见修复组织与周围正常组织完全融合、无裂隙。修复组织内的细胞为分化良好的软骨细胞，随时间延长对甲苯胺蓝异染性逐渐增强，说明移植的软骨细胞能够合成软骨特异性基质——蛋白多糖。此外，术后8周时修复组织的透射电镜观察表明，移植的软骨细胞形态及超微结构与正常对照组基本相同。
而单纯植入胶原膜组和未植入任何物品的髁突软骨全层损伤组，关节软骨损伤后髁突的大体形态异常，损伤区不能恢复正常关节软骨结构，且未受损伤的正常关节软骨出现裂隙、变薄、纤维组织层消失、软骨下骨皮质内骨细胞稀少、骨小梁钙化、骨髓腔消失等明显的退行性变化。
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本研究结果充分说明，软骨细胞移植可在软骨损伤区形成类似正常的关节软骨组织，对修复髁突软骨的全层损伤具有极大的应用价值。至于本实验细胞移植组术后1周和12周时分别有1侧髁突软骨损伤区未能形成软骨样组织修复，可能为植入损伤区的胶原膜脱落所致。
二、细胞载体——胶原膜的作用
应用细胞载体的目的是为了输送并将软骨细胞固位于损伤区，且使移植的软骨细胞能够按照具有一定外形的模板再生软骨。作为细胞移植载体的物质应具备下列条件[5]：①能够加工成三维立体结构；②随移植的细胞生长增殖及分泌细胞外基质而逐渐分解；③良好的生物相容性；④疏松多孔，以利细胞的均匀分布；⑤一定的机械强度。本研究将分离的兔髁突软骨细胞接种于胶原膜后，预孵4 h再加入培养基，目的在于使软骨细胞贴附于胶原膜内。在倒置相差显微镜及光镜下观察均发现，软骨细胞均匀分布于胶原膜的孔隙中，体外培养1周后移植时，细胞密度明显高于接种时的密度，软骨细胞位于类似软骨陷窝之空隙内。这说明胶原膜提供了适当的软骨细胞生长增殖环境，适于细胞贴附和增殖，且对髁突软骨细胞无毒性。此外，尚有研究表明胶原有利于软骨细胞的增殖和分化[6]。因此认为，胶原膜可以作为一种比较好的细胞载体用于细胞移植实验研究，其缺陷为机械强度较差。
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三、异体软骨细胞移植后的免疫排斥反应
软骨细胞表面抗原的抗原性很弱，而且软骨基质无抗原性并可阻挡宿主细胞与植入的软骨细胞表面抗原接触。因此，宿主免疫系统不能生成相应的致敏淋巴细胞和抗体，保护了植入的软骨细胞[7]。本实验应用胶原膜作为髁突软骨细胞移植的载体，体外培养1周后再植入动物体内，在此期间软骨细胞不断生长增殖，并分泌一定量的软骨基质分布于软骨细胞周围。移植后观察，未见淋巴细胞浸润等免疫排斥反应。我们的实验结果说明，应用低抗原性的胶原作为细胞移植载体，移植低抗原性的软骨细胞，修复异体髁突软骨的损伤能够成功，而不会引起免疫排斥反应。这与Wakitani等[8]对膝关节软骨损伤后移植异体软骨细胞的观察结果一致。
此外，本研究发现应用异体软骨细胞移植能够形成与正常关节软骨基本相同的修复组织，而不发生明显的退行性改变。但对于修复组织的生物化学成分、分子生物学特性等尚需进一步研究，以探索治疗髁突软骨损伤的理想方法。
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参考文献：
[1] Shapiro F, Koide S, Glimcher MJ. Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage. J Bone Joint Surg Am, 1993,75：532-553.
[2] 张桐，李秀林，刘建华.自体肋软骨膜移植修复髁状突关节软骨的实验研究.中华口腔医学杂志，1988，23：356-358.
[3] Wong TY, Jin YT, Laskin DM. Autologous pericranial graft resurfacing after high condylectomy and discectomy of the temporomandibular joint in rabbits. J Oral Maxillofac Surg, 1996,54：747-752.
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[4] 姚向前，马绪臣，张震康.兔下颌骨髁状突软骨细胞的分离、培养和鉴定.北京医科大学学报，1996，28：436-438.
[5] Mikos AG, Bao Y, Cima LG, et al. Preparation of poly (glycolic acid) bonded fiber structures for cell attachment and transplantation. J Biomed Mater Res, 1993,27：183-189.
[6] Maor G, von der Mark K, Reddi H, et al. Acceleration of cartilage and bone differentiation on collagenous substrata. Coll Relat Res, 1987,7：351-370.
[7] Quinn RW, Cerroni R. Antigenicity of chondrointin sulfate proceedings of the society for experiment. Biology, 1985,96：268-275.
[8] Wakitani S, Kimura T, Hirooka A, et al. Repair of rabbit articular surfaces with allograft chondrocytes embedded in collagen gel. J Bone Joint Surg, 1989,71：74-80.
收稿日期：1998-06-02, http://www.100md.com
单位：北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科，100081
关键词：下颌骨髁状突；软骨；关节；细胞移植
中华口腔医学杂志000219 【摘要】 目的 研究软骨细胞移植修复髁突软骨损伤后的效果及修复组织的性质。方法 选用成年雄性白兔53只，分成5组。第1组：细胞移植组；第2组：单纯胶原膜植入组；第3组：在实验动物的髁突前斜面形成直径2 mm的全层损伤后，未植入任何物品；第4组：空白手术对照组；第5组：正常对照组。结果 细胞移植组动物的髁突软骨损伤区形成软骨组织修复。结论 异体兔髁突软骨细胞移植能够形成类似正常的关节软骨修复髁突软骨缺损。
The repairment of the condylar cartilage defect by transplantation of chondrocytes embedded in the collagen membrane
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AO Xiangqian, MA Xuchen, ZHANG Zhenkang.
(Department of Oral maxillofacial Surgery, School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081, China)
【Abstract】 Objective To study the effect of repairing the defect on the condylar articular cartilage by chondrocyte transplantation. Methods A full-thickness defect was made in the condylar articular cartilage of the adult rabbit. The isolated condylar chondrocytes of the rabbits cultured in vitro for one week were embedded in the collagen membrane, and then transplantated into the defect. Results The defects of the condylar articular cartilage were repaired with cartilage tissue. Conclusions The defect of the condylar articular cartilage could be repaired with articular cartilage-like tissue by transplantation of the condylar chondrocytes.
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【Key words】 Mandibular condyle； Cartilage, articular； Cell transplantation
关节软骨自身修复能力差，损伤后治疗困难，重要原因之一是缺乏可供修复的软骨源性细胞[1]。许多研究表明，应用骨膜、软骨膜移植等修复髁突软骨损伤，虽能改善修复组织的性质、缓解症状，但不能使损伤的髁突软骨恢复正常组织结构[2，3]。我们探讨应用同种异体髁突软骨细胞接种于胶原膜后，移植修复髁突软骨全层损伤问题。
材料和方法
1.髁突软骨细胞的分离、培养和接种：按作者曾报道的方法[4]分离3只兔的髁突软骨细胞。用医用组织引导再生胶原膜(北京革瑞德生物制品中心提供)作为细胞载体，此膜呈多孔片状，由天然胶原蛋白人工合成，在体内75 d完全降解。将分离的髁突软骨细胞用DMEM细胞培养基(美国Gibco公司生产)调整细胞密度为1×1010个/L。将一片胶原膜置于35 mm塑胶培养皿内，吸取软骨细胞混悬液1 ml均匀滴于胶原膜上，于37℃预孵4 h后，再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基2 ml，于37℃、5% CO2的饱和湿度空气中培养。1周后用于细胞移植。
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2.实验动物及分组：选用6个月龄雄性白兔53只(本院动物室提供)，体重2～2.5 kg。随机分成下列各组：第1组(细胞移植组)：20只。在髁突前斜面的中央处形成直径2 mm的全层损伤后，植入已接种软骨细胞的胶原膜。第2组(单纯胶原膜植入组)：6只。在髁突前斜面的中央处形成直径2 mm的全层损伤后，植入未接种软骨细胞的胶原膜。第3组：18只。伴软骨下骨皮质穿通的髁突软骨全层损伤组。第4组：6只。空白手术对照组。第5组：2只。正常对照组。此外，另随机选用1只白兔作为透射电镜观察正常对照。
3.手术方法：经耳缘静脉注射2.5%的戊巴比妥钠溶液(1 ml/kg体重)将动物麻醉。本实验正常对照组及电镜观察正常动物取用双侧关节标本，其余各组动物均用左颞下颌关节作为实验侧。在无菌条件下，自外眦外侧5 mm处至外耳道方向行2 cm皮肤切口，分离皮下组织，暴露关节囊后，水平切开，进入关节腔，切开关节盘的外侧附着，暴露髁突关节面。用701#裂钻在髁突前斜面的中央处钻一直径2 mm的孔，穿透关节软骨及软骨下骨皮质至骨髓腔。然后，细胞移植组动物植入接种有软骨细胞的胶原膜，即将胶原膜修剪成稍大于髁突软骨损伤区的小块，仔细填塞于缺损内，使其与孔壁接触紧密、表面与周围正常关节软骨平齐。单纯胶原膜植入组动物以同样方法植入未接种软骨细胞的胶原膜。伴软骨下骨皮质穿通的髁突软骨全层损伤组不植入任何物品。用无菌生理盐水充分冲洗后，将关节盘复位，分层缝合关节囊、皮下组织及皮肤。空白手术对照组动物除不造成髁突软骨损伤外，其余手术步骤同前。术后动物下颌不制动，喂养颗粒状常规兔饲料。
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4.实验观察：分别于术后1、2、4、8、12和20周，将实验动物以过量麻醉处死。每次处死第1组和第3组动物各3只、第2组和第4组动物各1只行光镜观察。由于细胞移植组动物于术后12周和20周时已不能区分修复组织与原正常组织，随机选择术后8周时的2只动物处死，解剖分离实验侧髁突，沿修复组织与正常关节软骨交界处仔细切取修复组织，立即固定于3%戊二醛内，分切成约1 mm3大小，常规制作超薄切片，透射电镜下观察。
其余各实验组动物处死后，解剖分离实验侧髁突，观察其大体形态，然后固定于10%甲醛溶液内1周，混合脱钙液内脱钙1周。常规脱水、石蜡包埋，行5 μm厚矢状连续切片。选择损伤区中央部组织切片10张，间隔行HE和甲苯胺蓝染色，观察修复组织的结构和细胞外基质中蛋白多糖含量的变化。
结果
1.大体形态观察结果：单纯胶原膜植入组动物的髁突形态与伴软骨下骨皮质穿通的髁突软骨全层损伤组基本相同(6/6)。在整个实验观察期间内，细胞移植组除术后1周和12周时各有1侧髁突软骨损伤区凹陷，关节面前后径增大、有侵蚀现象外(2/20)，其余所有实验侧髁突的形态与正常对照组基本相同(18/20)。术后1～8周，除1周时1侧外(1/12)，其余所有细胞移植组动物的髁突软骨损伤区均充以修复组织，但与周围正常关节软骨之间的界限清晰可见(11/12)。术后12周和20周时，除12周时1侧外(1/6)，其余所有细胞移植组动物的髁突软骨损伤区均完全修复，肉眼下不能辨认损伤区，修复组织与原正常关节软骨之间互相融合(5/6)。在实验观察期内，所有细胞移植组和单纯植入胶原膜组动物的实验侧标本均无盘-髁粘连(26/26)。
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2.组织学及组织化学观察结果：
(1)单纯胶原膜植入组动物的组织学及组织化学染色与伴软骨下骨皮质穿通的髁突软骨全层损伤组基本相同(6/6)。透射电镜下，正常对照组2侧髁突的软骨细胞呈圆形、多角形，细胞表面有多数微绒毛突起，粗面内质网丰富。
(2)细胞移植组：术后1周时2侧髁突软骨损伤区充满修复组织，与毗邻的正常关节软骨融合，无裂隙，表面光滑。修复组织形成与正常关节软骨相连续的纤维组织层及增殖层，增殖层下方的细胞密集但排列无明显的规律(图1)。高倍镜下，修复组织内的细胞呈圆形、位于软骨陷窝内，为分化良好的软骨细胞。损伤区无软骨下骨皮质。甲苯胺蓝染色无异染性(2/3)。术后1周时的另一侧髁突软骨损伤区凹陷，充满疏松纤维结缔组织，血管丰富。高倍镜下大部分细胞为圆形的未分化间充质细胞，未见软骨组织。甲苯胺蓝染色无异染性(1/3)。术后2周时所有实验侧髁突软骨损伤区修复组织表面与毗邻正常关节软骨平齐，纤维组织层及增殖层与正常者连续。修复组织内细胞密集，高倍镜下为分化良好的软骨细胞。软骨下骨皮质缺如。甲苯胺蓝染色呈弱异染性(3/3)。术后4周时实验侧髁突软骨损伤区修复组织表面与毗邻正常关节软骨平齐，二者间无裂隙。已形成与正常者相连续的软骨下骨皮质。修复组织内为分化良好的软骨细胞，排列杂乱(图2)，甲苯胺蓝染色弱(3/3)。术后8周时所有实验侧髁突软骨损伤区修复组织与毗邻正常软骨及软骨下骨皮质间互相融合。修复组织内肥大软骨细胞层可见部分区域与透明软骨类似，软骨细胞有呈柱状排列的趋势(图3)。甲苯胺蓝染色部分区域呈紫红色，大部分区域染色弱(3/3)。术后12周时2侧髁突软骨损伤区表面光滑，纤维组织层及增殖层与正常者连续，增殖层下方可见分化良好的软骨细胞(图4)，甲苯胺蓝染色弱(2/3)。术后12周时另1侧髁突软骨损伤区的结构与伴有软骨下骨皮质穿通的髁突软骨损伤组相似，损伤区表面为纤维组织、深部为致密骨质，未见软骨细胞(1/3)。术后20周时的所有实验侧髁突软骨损伤区凹陷，稍低于周围正常关节软骨，修复组织与周围正常关节软骨及其下方皮质骨间互相融合，无裂隙。纤维组织层及增殖层与正常者连续，增殖层较厚，肥大软骨细胞层之细胞层数明显减少(图5)。甲苯胺蓝染色呈淡紫红色，比正常者弱(3/3)。光镜观察的全部髁突软骨损伤区修复组织周围均未见淋巴细胞浸润(18/18)。
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细胞移植组术后8周时，透射电镜观察见2侧髁突软骨损伤区修复组织内的软骨细胞为圆形，细胞表面有微绒毛突起，细胞浆内除可见部分粗面内质网扩张外(图6)，其余细胞器与正常髁突软骨细胞基本相同。
图1 软骨细胞移植后1周,修复组织内可见分化良好的软骨细胞(HE ×100) 图2 软骨细胞移植后4周,软骨细胞分化良好、排列杂乱(HE ×200) 图3 软骨细胞移植后8周，损伤区为纤维软骨样组织(HE ×200) 图4 软骨细胞移植后12周，损伤区为纤维软骨样组织(HE ×200)图5 软骨细胞移植后20周，肥大软骨细胞层数明显减少(HE ×200) 图6 软骨细胞移植后8周，细胞浆内可见扩张的内质网(透射电镜 ×6700)
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讨论
本研究表明应用体外培养的髁突软骨细胞移植修复同种异体髁突软骨全层损伤，能够形成基本正常的关节软骨而使损伤区愈合。
一、软骨细胞移植后的功能
本实验在髁突软骨全层损伤后植入接种于胶原膜内的异体软骨细胞，术后观察20周发现，髁突的大体形态基本正常(18/20)，光镜下见修复组织与周围正常组织完全融合、无裂隙。修复组织内的细胞为分化良好的软骨细胞，随时间延长对甲苯胺蓝异染性逐渐增强，说明移植的软骨细胞能够合成软骨特异性基质——蛋白多糖。此外，术后8周时修复组织的透射电镜观察表明，移植的软骨细胞形态及超微结构与正常对照组基本相同。
而单纯植入胶原膜组和未植入任何物品的髁突软骨全层损伤组，关节软骨损伤后髁突的大体形态异常，损伤区不能恢复正常关节软骨结构，且未受损伤的正常关节软骨出现裂隙、变薄、纤维组织层消失、软骨下骨皮质内骨细胞稀少、骨小梁钙化、骨髓腔消失等明显的退行性变化。
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本研究结果充分说明，软骨细胞移植可在软骨损伤区形成类似正常的关节软骨组织，对修复髁突软骨的全层损伤具有极大的应用价值。至于本实验细胞移植组术后1周和12周时分别有1侧髁突软骨损伤区未能形成软骨样组织修复，可能为植入损伤区的胶原膜脱落所致。
二、细胞载体——胶原膜的作用
应用细胞载体的目的是为了输送并将软骨细胞固位于损伤区，且使移植的软骨细胞能够按照具有一定外形的模板再生软骨。作为细胞移植载体的物质应具备下列条件[5]：①能够加工成三维立体结构；②随移植的细胞生长增殖及分泌细胞外基质而逐渐分解；③良好的生物相容性；④疏松多孔，以利细胞的均匀分布；⑤一定的机械强度。本研究将分离的兔髁突软骨细胞接种于胶原膜后，预孵4 h再加入培养基，目的在于使软骨细胞贴附于胶原膜内。在倒置相差显微镜及光镜下观察均发现，软骨细胞均匀分布于胶原膜的孔隙中，体外培养1周后移植时，细胞密度明显高于接种时的密度，软骨细胞位于类似软骨陷窝之空隙内。这说明胶原膜提供了适当的软骨细胞生长增殖环境，适于细胞贴附和增殖，且对髁突软骨细胞无毒性。此外，尚有研究表明胶原有利于软骨细胞的增殖和分化[6]。因此认为，胶原膜可以作为一种比较好的细胞载体用于细胞移植实验研究，其缺陷为机械强度较差。
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三、异体软骨细胞移植后的免疫排斥反应
软骨细胞表面抗原的抗原性很弱，而且软骨基质无抗原性并可阻挡宿主细胞与植入的软骨细胞表面抗原接触。因此，宿主免疫系统不能生成相应的致敏淋巴细胞和抗体，保护了植入的软骨细胞[7]。本实验应用胶原膜作为髁突软骨细胞移植的载体，体外培养1周后再植入动物体内，在此期间软骨细胞不断生长增殖，并分泌一定量的软骨基质分布于软骨细胞周围。移植后观察，未见淋巴细胞浸润等免疫排斥反应。我们的实验结果说明，应用低抗原性的胶原作为细胞移植载体，移植低抗原性的软骨细胞，修复异体髁突软骨的损伤能够成功，而不会引起免疫排斥反应。这与Wakitani等[8]对膝关节软骨损伤后移植异体软骨细胞的观察结果一致。
此外，本研究发现应用异体软骨细胞移植能够形成与正常关节软骨基本相同的修复组织，而不发生明显的退行性改变。但对于修复组织的生物化学成分、分子生物学特性等尚需进一步研究，以探索治疗髁突软骨损伤的理想方法。
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收稿日期：1998-06-02, http://www.100md.com