吗啡戒断大鼠脊髓和脑干以及前脑皮层胶质细胞源性神经营养因子及受体mRNA的表达
作者：周文华 刘惠芬 谢小虎 顾钧 杨国栋 吴其夏
单位：周文华 刘惠芬 谢小虎 顾钧 杨国栋(315010 宁波微循环与莨菪类药研究所 宁波戒毒研究中心)；吴其夏(中国协和医科大学病理生理教研室)
关键词：吗啡依赖；受体，神经递质；基因表达
中华医学杂志000224
【摘要】 目的 观察吗啡依赖或戒断时大鼠脊髓、脑干和皮层胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)以及受体GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达以及毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAch)、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂或一氧化氮合酶(NOS)抑制剂处理后对它们表达的影响，并观察侧脑室注射GDNF反义寡核苷酸对吗啡戒断症状的影响。方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) ，以β-actin mRNA作为内标检测GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β mRNA，应用lipofectAMINE 转染GDNF反义寡核苷酸，戒断症状评分根据纳洛酮注射后1 h内的各项症状的分值。结果 吗啡依赖时脊髓和脑干中GDNF 基因表达增加，GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达轻微增加，吗啡依赖大鼠注射纳洛酮1 h后脊髓和脑干GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β基因表达较依赖组降低，2 h后增加，4 h后接近正常。大鼠前脑皮层GDNF和 GDNFR-α基因的基因表达水平较低，当注射纳洛酮1、2和4 h后前脑皮层GDNF 、GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达明显增加。在注射纳洛酮前30 min给予NOS抑制剂L-N-硝基精氨酸甲酯(10 mg/kg)，脊髓中GDNF和GDNFR-β基因以及前脑皮层中GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达较戒断组减少；给予MK801(0.125mg/kg)后前脑皮层GDNF和GDNFR-α基因表达减少；给予甲基东莨菪碱(0.5mg/kg)后脑干GDNF以及前脑皮层中GDNF和GDNFR-β基因表达减少。吗啡依赖大鼠在纳洛酮激发前24 h和6 h侧脑室内注射GDNF反义寡核苷酸可明显减少吗啡戒断症状(P值分别<0.01和0.05,n=5)。结论 胶质细胞GDNF基因的表达在吗啡戒断过程中起重要作用；吗啡戒断时脊髓、脑干和前脑皮层GDNF及受体系统的持续表达可能引起神经元长程适应；mAch受体、NMDA受体或NO系统对吗啡戒断引起的GDNF 和GDNFR-α及GDNFR-β基因表达有一定调节。
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The expression of glial cell derived neurotrophic factor and its receptor GDNFR-α and GDNFR-β mRNA in spinal cord, brainstem and frontal cortex during morphine withdrawal in rats
ZHOU Wenhua*, LIU Huifen, XIE Xiaohu, et al.
(*Ningbo Institute of Microcirculation & Henbane,Ningbo Drug Addiction Research and Treatment Center, Ningbo 315010, China)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of glial cell derived neurotrophic factor (GDNF) and its receptor GDNFR-α(GFRα-1) and GDNFR-β(Ret) genes and the effects of muscarinic receptor antagonists, NMDA receptor antagonist, inhibitor of nitric oxide synthase on the expression of these genes in the spinal cord, brainstem and frontal cortex during morphine withdrawal, and to observe the effects of GDNF antisense oligoneucleotide (i.c.v) on the morphine withdrawal symptoms in rats. Methods The levels of GDNF, GDNFR-α and GDNFR-β mRNA were assayed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) with the β-actin mRNA as an internal control. Results The GDNF mRNA levels were increased, and GDNFR-α and GDNFR-β mRNA levels was slightly increased in the spinal cord and brainstem during morphine dependence. These genes were decreased at 1 h, increased at 2 h after administration of naloxone in morphine dependent rats. While the GDNF , GDNFR-α and GDNFR-β levels in the frontal cortex were increased significantly at 1, 2 and 4 h after the injection of naloxone during morphine withdrawal. The pre-treatment with L-N-nitric arginine methylester (10 mg/kg), the expressions of GDNF and GDNFR-β in the spinal cord, both GDNFR-α and GDNFR-β in the frontal cortex were decreased . The expressions of both GDNF and GDNFR-α in the frontal cortex were decreased by treatment with MK801 (0.5 mg/kg), and the expressions of GDNF in both the stem and cortex, and GDNFR-β in the brainstem decreased by treatment with the methyl-scopolamine (0.5 mg/kg). The β-actin mRNA levels were not different in each group. Moreover, the morphine withdrawal symptoms were attenuated by intracerebroven-tricular injection of GDNF antisense oligoneucleotide in 6 hour and 24 hour before naloxone administration in morphine dependent rats. Conclusion The results not only provide direct evidence that the expressions of GDNF and its receptors mRNA in glial cells play an important role in mediating the process of morphine dependence and may be account for the long-term neuro-adaptation associated with morphine dependence, but also suggest that muscarinic receptor, NMDA receptor and nitric oxide pathways may be involved in the expression of GDNF and GDNF receptor genes during morphine withdrawal.
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【Key words】 Addiction morphine; Receptor, neurotransmitter; Gene expression
神经营养因子在吗啡依赖所引起的神经元可塑性改变中具有潜在的作用， 在已分化的神经元中，神经营养因子调节信号传导和神经元的存活。有报道在伏隔核直接注射脑源性神经营养因子(BDNF)可以阻止吗啡所引起神经元的萎缩和一些生化改变[1]。于1993年发现的胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF)[2]通过多种受体复合物来介导生长和信息转导，受体结合主要由糖基磷脂酰肌醇锚蛋白类型的GDNF受体GDNFR-α介导，而细胞内活性由GDNF受体GDNFR-β基因产物酪氨酸激酶介导[3，4]。GDNF能促进多种外周和中枢神经元的存活，减少多巴胺神经元损伤，延长多巴胺神经元的存活等[5]，对培养的胆碱能神经元有保护作用，增加运动神经元的胆碱脂酶活性[6]，表明GDNF对多巴胺和胆碱能神经元有特异性作用，提示胶质细胞表达的GDNF在维持神经元的表型中起重要作用。吗啡慢性处理引起神经元的适应被认为是吗啡依赖的神经生物学基础[7]。我们采用RT-PCR方法检测吗啡戒断时大鼠脊髓、&127;脑干和前脑皮层GDNF和GDNF 受体GDNFR-α和GDNF-β mRNA的表达以及毒蕈碱乙酰胆碱(M)受体、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂或一氧化氮合酶(NOS)抑制剂处理后对它们表达的影响；并观察GDNF反义寡核苷酸侧脑室注射后对吗啡戒断反应的影响。
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材料和方法
一、试剂
吗啡系沈阳制药厂产品(批号970701)。纳洛酮、MK801、哌拉唑嗪(pirenzepine )、甲基东莨菪碱和L-N-Nitro-arginine methylester(L-NAME)等系美国Sigma公司产品，lipofectAMINE 系美国GIBCOBRL产品。总RNA提取试剂盒和RNA逆转录试剂盒均为美国Promega公司产品。PCR试剂盒、琼脂糖、PCR Marker系华美公司产品。DEPC系美国Fluka公司产品。其它试剂均为分析纯。
二、动物分组
雄性SD大鼠由上海动物中心提供，体重250 g±20 g，分9组，每组3只。参照文献[8]，大鼠皮下注射吗啡，首日10 mg/kg，每日2次，隔日每次增加10 mg/kg，至第6日末次注射50 mg/kg，建立吗啡依赖模型。此组动物为吗啡依赖组，注射生理盐水者为正常对照组。吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮4 mg/kg后1、2和4 h处死的大鼠分别为吗啡戒断1 h组，戒断2 h组和戒断4 h组。在纳洛酮激发前30 min腹腔分别注射MK-801(0.125 mg/kg)、哌拉唑嗪(10 mg/kg)、甲基东莨菪碱(0.5 mg/kg)或L-NAME(10 mg/kg)，纳洛酮注射激发戒断症状1 h后处死的大鼠为各药物处理组。
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三、总RNA抽提
大鼠断头处死，迅速分离取出颈椎和胸椎脊髓(约1.5 cm)、脑干(小脑正中下)和大脑前脑皮层组织各50 mg，按试剂盒说明操作，得到RNA沉淀，用20 μl无RNAase的水溶解，紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260 nm/A280 nm为1.8～2.0，并用甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量。提取总RNA置于-70℃保存。
四、逆转录反应
取2 μg总RNA于65℃变性3 min后，依次加入10×Buffer、10 mmol/L dNTP混合物、Oilgo(dT)、RNA酶抑制剂和AMV逆转录酶，总反应体积20 μl。42℃反应90 min，95℃ 5 min终止反应，加水稀释至100 μl。
五、PCR反应
GDNF引物参照文献[2]，两条引物序列分别为：上游引物为5'TCACCACATAAACAAGCGGCG-GCACT3'，下游引物为5'GTCAGATACATCCAC-ACCGTTTAG3'，扩增长度为404 bp的cDNA片段，GDNFR-α的引物[3]为:上游引物为 5'GACTCCCAACTACGTAGACTC3'，下游为5'GAGTCTACGTAGTTGGGAGTC3'，扩增长度为552 bp cDNA 片段。GDNFR-β的引物[9]为:上游引物为5'GTGCAATTGTCGTGGCAGT3'，下游引物为5'ACTGCCACGACAATT-GCAC3'，扩增长度为661 bp cDNA 片段。经检验引物与基因库之间无特异性同源区域。内参照的β-actin 两条引物序列分别为：上游引物为5'TCATGAAGTGTGACGTTGACATCC-GTAAAG3'，下游引物为5'CCTAGAAGCATTT-GCGGTGCACGATGGAGG3'，扩增长度为409 bp。所有引物由上海生工生物工程公司合成。
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取逆转录反应液20 μl，分别进行GDNF、GDNFR-α、GDNFR-β和β-actin基因的PCR扩增。PCR反应液总体积为50 μl，包含Tris-HCl 10 mmol/L，pH 8.3，KCl 50 mmol/L，质量分数为0.1%的TritonX-100，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，DTT 5 mmol/L，上、下游引物各50 pmol，94℃变性10 min，加Taq DNA聚合酶2.5 U，再覆盖石蜡油50 μl，94℃变性2 min后进行PCR循环(美国AMPLITRON公司PCR仪)，条件为：94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，完成35个循环后，72℃再延伸10 min，置冰浴中。取15 μl GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的PCR产物和5 μl β-actin 的PCR产物在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，5 V/cm，45 min，用自动成像仪(美国FOTODYNE公司)观察拍照。重复实验的电泳图谱用STORM860荧光扫描分析仪(美国DYNAMIC 公司)分析，相对表达量根据各电泳区带的面积与内对照β-actin的面积之比来计算。
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六、立体定位和侧脑室注GDNF反义寡核苷酸
40只大鼠巴比妥钠麻醉后，置立体定位仪(ASI小动物立体定位仪)，根据de Groot鼠立体定位图谱，侧脑室的立体定标为AP-1.0 mm、RL -1.5 mm和DV-4.0 mm。9号注射针(长度4 mm)插入左侧侧脑室，埋管用牙托粉固定在头颅上。动物恢复后注射吗啡建立吗啡依赖模型。20只动物在纳洛酮催促实验前24 h和12 h侧脑室微量注射(美国BAS微量注射泵)质量浓度为0.3 nmol的反义寡核苷酸、有义链寡核苷酸和错义寡核苷酸溶液，其中包括质量分数为20% Lipofectin AMINE，对照组注射同体积的20% Lipofectin AMINE。另20只动物在纳洛酮注射前6 h微量注射寡核苷酸，分组和处理与24 h组相同。戒断症状评分参见动物分组处理。GDNF特异性的反义寡核苷酸根据GDNF的基因结构，针对翻译起始密码ATG的-11到+7的碱基设计，反义(antisense)寡核苷酸的序列为5'-ACTTCATCTTAGTGTCCC-3'，有义(sense)寡核苷酸为5'-GGGACTCTAAGATGAAGT-3'和错义(mismatch)的反义寡核苷酸5'-ACATCAACTAAGAGTCGA-3'作为阴性对照，寡核苷酸由上海生工生物工程公司合成。
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七、应用组间t检验方法进行统计学处理。
结果
一、吗啡戒断大鼠脊髓GDNF和GDNFR-α和GDNFR-β mRNA 的表达
图1所示，扩增产物电泳后经扫描分析，吗啡依赖时脊髓GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的扩增产物均增加，重复实验的各相对表达量较正常对照组差异有显著意义(P均<0.01,n=3)。吗啡依赖大鼠注射纳洛酮1 h后GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的相对表达量较依赖组减少，2 h后明显增加, 4 h后接近正常对照。在纳洛酮注射前30 min腹腔注射NOS抑制剂L-NAME处理后，GDNF的相对表达量由戒断1 h组的0.58±0.04减少到0.08±0.02(t=19.4,P<0.01,n=3)；而GDNFR-α的相对表达由戒断组的1.04±0.05减少到0.84±0.04(t=5.41,P<0.01)；GDNFR-β的相对表达量由0.75±0.05减少到0.14±0.02(P<0.01,n=3)，而NMDA受体拮抗剂MK801、M受体拮抗剂甲基东莨菪碱和M1受体选择性拮抗剂哌拉唑嗪处理后，对脊髓GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的表达没有明显影响。
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O：PCR DNA分子量参照物：A：吗啡依赖组；B：对照组；C：戒断1 h组；D：戒断2 h组；E：戒断4 h组；F：MK801处理组；G：哌拉唑嗪处理组；H：东莨菪碱处理组；I：L-NAME处理组
图1 脊髓组织中GDNF、GDNF-α受体、GDNF-β受体和
β-actin mRNA经PCR扩增特异产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
二、吗啡戒断大鼠脑干GDNF和GDNFR-α和GDNFR-β mRNA 的表达
从图2显示，当吗啡依赖时，脑干GDNF扩增产物明显增加，相对表达量由正常的0.91±0.05增加到1.14±0.05(t=5.63,P<0.01)，而GDNFR-α和GDNFR-β的扩增产物较正常对照组差异无显著意义。 吗啡依赖大鼠注射纳洛酮1h后脑干的GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的扩增产物较依赖组减少，2h和 4h后GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的相对表达增加。甲基东莨菪碱处理后脑干GDNF的相对表达量由戒断1 h的0.59±0.05减少到0.1±0.02(P<0.01),而GDNFR-α和GDNFR-β的相对表达与戒断组差异无显著意义；哌拉唑嗪和L-NAME处理后脑干GDNF、 GDNFR-α和GDNFR-β的相对表达较戒断组明显升高。
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图2 脑干组织中GDNF、GDNF-α受体、GDNF-β受体和
β-actin mRNA经PCR扩增特异产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
三、吗啡戒断大鼠前脑皮层GDNF和GDNFR-α及GDNFR-β mRNA 的表达
图3显示,正常大鼠前脑皮层GDNF和GDNFR-α基础表达量极少，而GDNFR-β基础表达较高。吗啡依赖大鼠皮层GDNF较正常对照组稍高，GDNFR-α增加，而GDNFR-β的表达则减少。吗啡依赖大鼠注射纳洛酮1 h、2 h和4 h后GDNF相对表达分别为依赖组的290%，448%和460%；GDNFR-α相对表达量分别为依赖组的118%、125%和137%；GDNFR-β的相对表达分别为依赖组的125%、139%和113%。在纳洛酮注射前30 min腹腔注射MK801和甲基东莨菪碱&127;GDNF的相对表达由戒断1 h组的0.21±0.02分别减少为0.11±0.02(t=6.12,P<0.01)和0.16±0.02(t=3.06,P<0.05)，而哌拉唑嗪和L-NAME处理后GDNF的表达增加，分别为戒断组的109%和129%；MK801、哌拉唑嗪和L-NAME处理后GDNFR-α则明显降低(P均<0.01);甲基东莨菪碱和L-NAME处理后GDNFR-β明显降低，分别为戒断1 h组的60%和40%。
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图3 前脑皮层组织中GDNF、GDNF-α受体、GDNF-β受体和
β-actin mRNA经PCR扩增特异产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
四、侧脑室注射GDNF反义寡核苷酸对吗啡戒断症状的影响
图4显示在纳洛酮激发前24 h侧脑室注射GDNF反义寡核苷酸(与对照组相比,t=3.74，P<0.01,n=5)和GDNF有义寡核苷酸(与对照组相比,t=3.27,P<0.05，n=5)可以明显地抑制体重减轻、腹泻、湿狗摇动、激惹、扭体和异常姿势等吗啡戒断症状，而错义寡核苷酸组的戒断症状评分与对照组差异无显著意义。在纳洛酮激发前6 h注射GDNF反义寡核苷酸动物其戒断症状评分值较对照组明显减少(与对照组相比,t=3.16,P<0.05,n=5)、GDNF有义寡核苷酸和错义寡核苷酸处理组较对照组差异无显著意义。
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图4 侧脑室注射GDNF反义寡核苷酸对吗啡戒断症状的影响
讨论 文献报道在吗啡大鼠蓝板核中注射CREB的反义寡核苷酸可以减少吗啡戒断症状[10]，在吗啡依赖大鼠注射纳洛酮可引起大脑皮层、脊髓和脑干的c-fos的大量表达[11]。因此，在中枢神经GDNF所介导的细胞转导信号可能通过直接或间接的方式参与吗啡依赖过程。纳洛酮系短效阿片受体拮抗剂，激发戒断反应的峰值时间约30 min。我们发现在吗啡依赖和戒断后脊髓和脑干GDNF表达增加，受体结合活性和细胞内转导活性均增加；前脑皮层GDNF 基因戒断后持续表达，受体结合和细胞内活性均明显增加，同时神经元组成性表达如β-actin基因表达没有明显变化，因此，在吗啡依赖和戒断引起GDNF和它的受体基因持续表达。当吗啡依赖大鼠在纳洛酮激发前6 h(考虑到前脑皮层GDNF的表达在注射纳洛酮后6 h后降低，提示GDNF mRNA的半衰期不超过6 h)侧脑室内注射GDNF反义寡核苷酸能有意义地抑制吗啡戒断症状，而有义和错义寡核苷酸没有作用，在纳洛酮激发前24 h侧脑室内注射GDNF反义寡核苷酸和有义寡核苷酸可明显减少吗啡戒断症状, 而有义寡核苷酸24 h处理组结果可能抑制GDNF的转录有关。结果直接证实了GDNF参与吗啡的依赖和戒断过程。
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由于GDNF主要由胶质细胞合成和分泌，而GDNF受体复合物在神经元有广泛分布，GDNF可能通过逆行和顺行转运的方式相对特异地作用于神经元,因此,在吗啡依赖过程中,胶质细胞和神经元共同参与了吗啡的依赖戒断过程。 吗啡慢性处理可以引起神经元的适应性改变是造成吗啡依赖的神经生物学基础，其特征是一旦停止使用吗啡或使用阿片受体拮抗剂，将出现吗啡躯体性和精神性戒断症状[7]。现已证实BDNF能阻止吗啡慢性处理引起的神经元萎缩[1]，GDNF对多巴胺神经元和胆碱能神经元作用特异性更强。因此，吗啡戒断反应中GDNF的持续表达可影响神经元的可塑性或适应性改变，为吗啡戒断反应引起神经元可塑性调节以及长程适应提供了证据。
前脑皮层是中脑多巴胺神经元的主要投射区，它是介导吗啡精神依赖的主要部位，而脑干和脊髓是介导吗啡身体依赖的重要部位。吗啡的精神强化作用如欣快感和吗啡依赖过程中的戒断反应作为负性强化因素共同造成吗啡依赖的发生和发展，药理学实验证实mAch受体、NMDA受体或一氧化氮生成系统参与吗啡耐受和依赖过程[8，12]。来自大脑皮层的谷氨酸能神经对中脑介导吗啡精神依赖的多巴胺通路有调节作用，而东莨菪碱慢性处理可减少猕猴自身给药淬灭后的复吸。有报道发现神经元的兴奋引起了GDNF 基因的表达，注射海人酸可使海马或齿状回GDNF的基因表达增加，用高剂量的MK801处理后不仅阻止海人酸引起的惊厥，而且可阻止GDNF的表达，提示兴奋性氨基酸参与了GDNF 的调节，也有报道GDNF 可以减少脑缺血引起的NO的生成，GDNF对胆碱能神经元有保护作用，增加运动神经元的胆碱脂酶活性[6]。本研究发现NOS抑制剂L-NAME 抑制纳洛酮引起的前脑皮层中GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达；MK801抑制纳洛酮引起的前脑皮层GDNF和GDNFR-α基因表达；甲基东莨菪碱则抑制纳洛酮引起的前脑皮层中GDNF和GDNFR-β基因表达。由于兴奋性氨基酸、mAch受体与NO的生成系统相偶联，因此，GDNF及受体偶联的信号转导系统与mAch受体、NMDA受体的信号转导途径以及NO的生成系统存在着相互调节，其确切机制需要进一步探索。L-NAME、MK801、东莨菪碱以及哌拉唑嗪对GDNF以及受体GDNFR-α和GDNFR-β基因表达有一定程度调节作用,这些作用可能是它们参与吗啡依赖过程的机制之一。
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基金项目：浙江省医药卫生科研基金资助项目(98A093)
参 考 文 献
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收稿日期：1999-02-04, 百拇医药
单位：周文华 刘惠芬 谢小虎 顾钧 杨国栋(315010 宁波微循环与莨菪类药研究所 宁波戒毒研究中心)；吴其夏(中国协和医科大学病理生理教研室)
关键词：吗啡依赖；受体，神经递质；基因表达
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【摘要】 目的 观察吗啡依赖或戒断时大鼠脊髓、脑干和皮层胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)以及受体GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达以及毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAch)、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂或一氧化氮合酶(NOS)抑制剂处理后对它们表达的影响，并观察侧脑室注射GDNF反义寡核苷酸对吗啡戒断症状的影响。方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) ，以β-actin mRNA作为内标检测GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β mRNA，应用lipofectAMINE 转染GDNF反义寡核苷酸，戒断症状评分根据纳洛酮注射后1 h内的各项症状的分值。结果 吗啡依赖时脊髓和脑干中GDNF 基因表达增加，GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达轻微增加，吗啡依赖大鼠注射纳洛酮1 h后脊髓和脑干GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β基因表达较依赖组降低，2 h后增加，4 h后接近正常。大鼠前脑皮层GDNF和 GDNFR-α基因的基因表达水平较低，当注射纳洛酮1、2和4 h后前脑皮层GDNF 、GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达明显增加。在注射纳洛酮前30 min给予NOS抑制剂L-N-硝基精氨酸甲酯(10 mg/kg)，脊髓中GDNF和GDNFR-β基因以及前脑皮层中GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达较戒断组减少；给予MK801(0.125mg/kg)后前脑皮层GDNF和GDNFR-α基因表达减少；给予甲基东莨菪碱(0.5mg/kg)后脑干GDNF以及前脑皮层中GDNF和GDNFR-β基因表达减少。吗啡依赖大鼠在纳洛酮激发前24 h和6 h侧脑室内注射GDNF反义寡核苷酸可明显减少吗啡戒断症状(P值分别<0.01和0.05,n=5)。结论 胶质细胞GDNF基因的表达在吗啡戒断过程中起重要作用；吗啡戒断时脊髓、脑干和前脑皮层GDNF及受体系统的持续表达可能引起神经元长程适应；mAch受体、NMDA受体或NO系统对吗啡戒断引起的GDNF 和GDNFR-α及GDNFR-β基因表达有一定调节。
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ZHOU Wenhua*, LIU Huifen, XIE Xiaohu, et al.
(*Ningbo Institute of Microcirculation & Henbane,Ningbo Drug Addiction Research and Treatment Center, Ningbo 315010, China)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of glial cell derived neurotrophic factor (GDNF) and its receptor GDNFR-α(GFRα-1) and GDNFR-β(Ret) genes and the effects of muscarinic receptor antagonists, NMDA receptor antagonist, inhibitor of nitric oxide synthase on the expression of these genes in the spinal cord, brainstem and frontal cortex during morphine withdrawal, and to observe the effects of GDNF antisense oligoneucleotide (i.c.v) on the morphine withdrawal symptoms in rats. Methods The levels of GDNF, GDNFR-α and GDNFR-β mRNA were assayed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) with the β-actin mRNA as an internal control. Results The GDNF mRNA levels were increased, and GDNFR-α and GDNFR-β mRNA levels was slightly increased in the spinal cord and brainstem during morphine dependence. These genes were decreased at 1 h, increased at 2 h after administration of naloxone in morphine dependent rats. While the GDNF , GDNFR-α and GDNFR-β levels in the frontal cortex were increased significantly at 1, 2 and 4 h after the injection of naloxone during morphine withdrawal. The pre-treatment with L-N-nitric arginine methylester (10 mg/kg), the expressions of GDNF and GDNFR-β in the spinal cord, both GDNFR-α and GDNFR-β in the frontal cortex were decreased . The expressions of both GDNF and GDNFR-α in the frontal cortex were decreased by treatment with MK801 (0.5 mg/kg), and the expressions of GDNF in both the stem and cortex, and GDNFR-β in the brainstem decreased by treatment with the methyl-scopolamine (0.5 mg/kg). The β-actin mRNA levels were not different in each group. Moreover, the morphine withdrawal symptoms were attenuated by intracerebroven-tricular injection of GDNF antisense oligoneucleotide in 6 hour and 24 hour before naloxone administration in morphine dependent rats. Conclusion The results not only provide direct evidence that the expressions of GDNF and its receptors mRNA in glial cells play an important role in mediating the process of morphine dependence and may be account for the long-term neuro-adaptation associated with morphine dependence, but also suggest that muscarinic receptor, NMDA receptor and nitric oxide pathways may be involved in the expression of GDNF and GDNF receptor genes during morphine withdrawal.
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【Key words】 Addiction morphine; Receptor, neurotransmitter; Gene expression
神经营养因子在吗啡依赖所引起的神经元可塑性改变中具有潜在的作用， 在已分化的神经元中，神经营养因子调节信号传导和神经元的存活。有报道在伏隔核直接注射脑源性神经营养因子(BDNF)可以阻止吗啡所引起神经元的萎缩和一些生化改变[1]。于1993年发现的胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF)[2]通过多种受体复合物来介导生长和信息转导，受体结合主要由糖基磷脂酰肌醇锚蛋白类型的GDNF受体GDNFR-α介导，而细胞内活性由GDNF受体GDNFR-β基因产物酪氨酸激酶介导[3，4]。GDNF能促进多种外周和中枢神经元的存活，减少多巴胺神经元损伤，延长多巴胺神经元的存活等[5]，对培养的胆碱能神经元有保护作用，增加运动神经元的胆碱脂酶活性[6]，表明GDNF对多巴胺和胆碱能神经元有特异性作用，提示胶质细胞表达的GDNF在维持神经元的表型中起重要作用。吗啡慢性处理引起神经元的适应被认为是吗啡依赖的神经生物学基础[7]。我们采用RT-PCR方法检测吗啡戒断时大鼠脊髓、&127;脑干和前脑皮层GDNF和GDNF 受体GDNFR-α和GDNF-β mRNA的表达以及毒蕈碱乙酰胆碱(M)受体、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂或一氧化氮合酶(NOS)抑制剂处理后对它们表达的影响；并观察GDNF反义寡核苷酸侧脑室注射后对吗啡戒断反应的影响。
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材料和方法
一、试剂
吗啡系沈阳制药厂产品(批号970701)。纳洛酮、MK801、哌拉唑嗪(pirenzepine )、甲基东莨菪碱和L-N-Nitro-arginine methylester(L-NAME)等系美国Sigma公司产品，lipofectAMINE 系美国GIBCOBRL产品。总RNA提取试剂盒和RNA逆转录试剂盒均为美国Promega公司产品。PCR试剂盒、琼脂糖、PCR Marker系华美公司产品。DEPC系美国Fluka公司产品。其它试剂均为分析纯。
二、动物分组
雄性SD大鼠由上海动物中心提供，体重250 g±20 g，分9组，每组3只。参照文献[8]，大鼠皮下注射吗啡，首日10 mg/kg，每日2次，隔日每次增加10 mg/kg，至第6日末次注射50 mg/kg，建立吗啡依赖模型。此组动物为吗啡依赖组，注射生理盐水者为正常对照组。吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮4 mg/kg后1、2和4 h处死的大鼠分别为吗啡戒断1 h组，戒断2 h组和戒断4 h组。在纳洛酮激发前30 min腹腔分别注射MK-801(0.125 mg/kg)、哌拉唑嗪(10 mg/kg)、甲基东莨菪碱(0.5 mg/kg)或L-NAME(10 mg/kg)，纳洛酮注射激发戒断症状1 h后处死的大鼠为各药物处理组。
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三、总RNA抽提
大鼠断头处死，迅速分离取出颈椎和胸椎脊髓(约1.5 cm)、脑干(小脑正中下)和大脑前脑皮层组织各50 mg，按试剂盒说明操作，得到RNA沉淀，用20 μl无RNAase的水溶解，紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260 nm/A280 nm为1.8～2.0，并用甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量。提取总RNA置于-70℃保存。
四、逆转录反应
取2 μg总RNA于65℃变性3 min后，依次加入10×Buffer、10 mmol/L dNTP混合物、Oilgo(dT)、RNA酶抑制剂和AMV逆转录酶，总反应体积20 μl。42℃反应90 min，95℃ 5 min终止反应，加水稀释至100 μl。
五、PCR反应
GDNF引物参照文献[2]，两条引物序列分别为：上游引物为5'TCACCACATAAACAAGCGGCG-GCACT3'，下游引物为5'GTCAGATACATCCAC-ACCGTTTAG3'，扩增长度为404 bp的cDNA片段，GDNFR-α的引物[3]为:上游引物为 5'GACTCCCAACTACGTAGACTC3'，下游为5'GAGTCTACGTAGTTGGGAGTC3'，扩增长度为552 bp cDNA 片段。GDNFR-β的引物[9]为:上游引物为5'GTGCAATTGTCGTGGCAGT3'，下游引物为5'ACTGCCACGACAATT-GCAC3'，扩增长度为661 bp cDNA 片段。经检验引物与基因库之间无特异性同源区域。内参照的β-actin 两条引物序列分别为：上游引物为5'TCATGAAGTGTGACGTTGACATCC-GTAAAG3'，下游引物为5'CCTAGAAGCATTT-GCGGTGCACGATGGAGG3'，扩增长度为409 bp。所有引物由上海生工生物工程公司合成。
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取逆转录反应液20 μl，分别进行GDNF、GDNFR-α、GDNFR-β和β-actin基因的PCR扩增。PCR反应液总体积为50 μl，包含Tris-HCl 10 mmol/L，pH 8.3，KCl 50 mmol/L，质量分数为0.1%的TritonX-100，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，DTT 5 mmol/L，上、下游引物各50 pmol，94℃变性10 min，加Taq DNA聚合酶2.5 U，再覆盖石蜡油50 μl，94℃变性2 min后进行PCR循环(美国AMPLITRON公司PCR仪)，条件为：94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，完成35个循环后，72℃再延伸10 min，置冰浴中。取15 μl GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的PCR产物和5 μl β-actin 的PCR产物在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，5 V/cm，45 min，用自动成像仪(美国FOTODYNE公司)观察拍照。重复实验的电泳图谱用STORM860荧光扫描分析仪(美国DYNAMIC 公司)分析，相对表达量根据各电泳区带的面积与内对照β-actin的面积之比来计算。
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六、立体定位和侧脑室注GDNF反义寡核苷酸
40只大鼠巴比妥钠麻醉后，置立体定位仪(ASI小动物立体定位仪)，根据de Groot鼠立体定位图谱，侧脑室的立体定标为AP-1.0 mm、RL -1.5 mm和DV-4.0 mm。9号注射针(长度4 mm)插入左侧侧脑室，埋管用牙托粉固定在头颅上。动物恢复后注射吗啡建立吗啡依赖模型。20只动物在纳洛酮催促实验前24 h和12 h侧脑室微量注射(美国BAS微量注射泵)质量浓度为0.3 nmol的反义寡核苷酸、有义链寡核苷酸和错义寡核苷酸溶液，其中包括质量分数为20% Lipofectin AMINE，对照组注射同体积的20% Lipofectin AMINE。另20只动物在纳洛酮注射前6 h微量注射寡核苷酸，分组和处理与24 h组相同。戒断症状评分参见动物分组处理。GDNF特异性的反义寡核苷酸根据GDNF的基因结构，针对翻译起始密码ATG的-11到+7的碱基设计，反义(antisense)寡核苷酸的序列为5'-ACTTCATCTTAGTGTCCC-3'，有义(sense)寡核苷酸为5'-GGGACTCTAAGATGAAGT-3'和错义(mismatch)的反义寡核苷酸5'-ACATCAACTAAGAGTCGA-3'作为阴性对照，寡核苷酸由上海生工生物工程公司合成。
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七、应用组间t检验方法进行统计学处理。
结果
一、吗啡戒断大鼠脊髓GDNF和GDNFR-α和GDNFR-β mRNA 的表达
图1所示，扩增产物电泳后经扫描分析，吗啡依赖时脊髓GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的扩增产物均增加，重复实验的各相对表达量较正常对照组差异有显著意义(P均<0.01,n=3)。吗啡依赖大鼠注射纳洛酮1 h后GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的相对表达量较依赖组减少，2 h后明显增加, 4 h后接近正常对照。在纳洛酮注射前30 min腹腔注射NOS抑制剂L-NAME处理后，GDNF的相对表达量由戒断1 h组的0.58±0.04减少到0.08±0.02(t=19.4,P<0.01,n=3)；而GDNFR-α的相对表达由戒断组的1.04±0.05减少到0.84±0.04(t=5.41,P<0.01)；GDNFR-β的相对表达量由0.75±0.05减少到0.14±0.02(P<0.01,n=3)，而NMDA受体拮抗剂MK801、M受体拮抗剂甲基东莨菪碱和M1受体选择性拮抗剂哌拉唑嗪处理后，对脊髓GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的表达没有明显影响。
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O：PCR DNA分子量参照物：A：吗啡依赖组；B：对照组；C：戒断1 h组；D：戒断2 h组；E：戒断4 h组；F：MK801处理组；G：哌拉唑嗪处理组；H：东莨菪碱处理组；I：L-NAME处理组
图1 脊髓组织中GDNF、GDNF-α受体、GDNF-β受体和
β-actin mRNA经PCR扩增特异产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
二、吗啡戒断大鼠脑干GDNF和GDNFR-α和GDNFR-β mRNA 的表达
从图2显示，当吗啡依赖时，脑干GDNF扩增产物明显增加，相对表达量由正常的0.91±0.05增加到1.14±0.05(t=5.63,P<0.01)，而GDNFR-α和GDNFR-β的扩增产物较正常对照组差异无显著意义。 吗啡依赖大鼠注射纳洛酮1h后脑干的GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的扩增产物较依赖组减少，2h和 4h后GDNF、GDNFR-α和GDNFR-β的相对表达增加。甲基东莨菪碱处理后脑干GDNF的相对表达量由戒断1 h的0.59±0.05减少到0.1±0.02(P<0.01),而GDNFR-α和GDNFR-β的相对表达与戒断组差异无显著意义；哌拉唑嗪和L-NAME处理后脑干GDNF、 GDNFR-α和GDNFR-β的相对表达较戒断组明显升高。
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图2 脑干组织中GDNF、GDNF-α受体、GDNF-β受体和
β-actin mRNA经PCR扩增特异产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
三、吗啡戒断大鼠前脑皮层GDNF和GDNFR-α及GDNFR-β mRNA 的表达
图3显示,正常大鼠前脑皮层GDNF和GDNFR-α基础表达量极少，而GDNFR-β基础表达较高。吗啡依赖大鼠皮层GDNF较正常对照组稍高，GDNFR-α增加，而GDNFR-β的表达则减少。吗啡依赖大鼠注射纳洛酮1 h、2 h和4 h后GDNF相对表达分别为依赖组的290%，448%和460%；GDNFR-α相对表达量分别为依赖组的118%、125%和137%；GDNFR-β的相对表达分别为依赖组的125%、139%和113%。在纳洛酮注射前30 min腹腔注射MK801和甲基东莨菪碱&127;GDNF的相对表达由戒断1 h组的0.21±0.02分别减少为0.11±0.02(t=6.12,P<0.01)和0.16±0.02(t=3.06,P<0.05)，而哌拉唑嗪和L-NAME处理后GDNF的表达增加，分别为戒断组的109%和129%；MK801、哌拉唑嗪和L-NAME处理后GDNFR-α则明显降低(P均<0.01);甲基东莨菪碱和L-NAME处理后GDNFR-β明显降低，分别为戒断1 h组的60%和40%。
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图3 前脑皮层组织中GDNF、GDNF-α受体、GDNF-β受体和
β-actin mRNA经PCR扩增特异产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
四、侧脑室注射GDNF反义寡核苷酸对吗啡戒断症状的影响
图4显示在纳洛酮激发前24 h侧脑室注射GDNF反义寡核苷酸(与对照组相比,t=3.74，P<0.01,n=5)和GDNF有义寡核苷酸(与对照组相比,t=3.27,P<0.05，n=5)可以明显地抑制体重减轻、腹泻、湿狗摇动、激惹、扭体和异常姿势等吗啡戒断症状，而错义寡核苷酸组的戒断症状评分与对照组差异无显著意义。在纳洛酮激发前6 h注射GDNF反义寡核苷酸动物其戒断症状评分值较对照组明显减少(与对照组相比,t=3.16,P<0.05,n=5)、GDNF有义寡核苷酸和错义寡核苷酸处理组较对照组差异无显著意义。
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图4 侧脑室注射GDNF反义寡核苷酸对吗啡戒断症状的影响
讨论 文献报道在吗啡大鼠蓝板核中注射CREB的反义寡核苷酸可以减少吗啡戒断症状[10]，在吗啡依赖大鼠注射纳洛酮可引起大脑皮层、脊髓和脑干的c-fos的大量表达[11]。因此，在中枢神经GDNF所介导的细胞转导信号可能通过直接或间接的方式参与吗啡依赖过程。纳洛酮系短效阿片受体拮抗剂，激发戒断反应的峰值时间约30 min。我们发现在吗啡依赖和戒断后脊髓和脑干GDNF表达增加，受体结合活性和细胞内转导活性均增加；前脑皮层GDNF 基因戒断后持续表达，受体结合和细胞内活性均明显增加，同时神经元组成性表达如β-actin基因表达没有明显变化，因此，在吗啡依赖和戒断引起GDNF和它的受体基因持续表达。当吗啡依赖大鼠在纳洛酮激发前6 h(考虑到前脑皮层GDNF的表达在注射纳洛酮后6 h后降低，提示GDNF mRNA的半衰期不超过6 h)侧脑室内注射GDNF反义寡核苷酸能有意义地抑制吗啡戒断症状，而有义和错义寡核苷酸没有作用，在纳洛酮激发前24 h侧脑室内注射GDNF反义寡核苷酸和有义寡核苷酸可明显减少吗啡戒断症状, 而有义寡核苷酸24 h处理组结果可能抑制GDNF的转录有关。结果直接证实了GDNF参与吗啡的依赖和戒断过程。
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由于GDNF主要由胶质细胞合成和分泌，而GDNF受体复合物在神经元有广泛分布，GDNF可能通过逆行和顺行转运的方式相对特异地作用于神经元,因此,在吗啡依赖过程中,胶质细胞和神经元共同参与了吗啡的依赖戒断过程。 吗啡慢性处理可以引起神经元的适应性改变是造成吗啡依赖的神经生物学基础，其特征是一旦停止使用吗啡或使用阿片受体拮抗剂，将出现吗啡躯体性和精神性戒断症状[7]。现已证实BDNF能阻止吗啡慢性处理引起的神经元萎缩[1]，GDNF对多巴胺神经元和胆碱能神经元作用特异性更强。因此，吗啡戒断反应中GDNF的持续表达可影响神经元的可塑性或适应性改变，为吗啡戒断反应引起神经元可塑性调节以及长程适应提供了证据。
前脑皮层是中脑多巴胺神经元的主要投射区，它是介导吗啡精神依赖的主要部位，而脑干和脊髓是介导吗啡身体依赖的重要部位。吗啡的精神强化作用如欣快感和吗啡依赖过程中的戒断反应作为负性强化因素共同造成吗啡依赖的发生和发展，药理学实验证实mAch受体、NMDA受体或一氧化氮生成系统参与吗啡耐受和依赖过程[8，12]。来自大脑皮层的谷氨酸能神经对中脑介导吗啡精神依赖的多巴胺通路有调节作用，而东莨菪碱慢性处理可减少猕猴自身给药淬灭后的复吸。有报道发现神经元的兴奋引起了GDNF 基因的表达，注射海人酸可使海马或齿状回GDNF的基因表达增加，用高剂量的MK801处理后不仅阻止海人酸引起的惊厥，而且可阻止GDNF的表达，提示兴奋性氨基酸参与了GDNF 的调节，也有报道GDNF 可以减少脑缺血引起的NO的生成，GDNF对胆碱能神经元有保护作用，增加运动神经元的胆碱脂酶活性[6]。本研究发现NOS抑制剂L-NAME 抑制纳洛酮引起的前脑皮层中GDNFR-α和GDNFR-β基因的表达；MK801抑制纳洛酮引起的前脑皮层GDNF和GDNFR-α基因表达；甲基东莨菪碱则抑制纳洛酮引起的前脑皮层中GDNF和GDNFR-β基因表达。由于兴奋性氨基酸、mAch受体与NO的生成系统相偶联，因此，GDNF及受体偶联的信号转导系统与mAch受体、NMDA受体的信号转导途径以及NO的生成系统存在着相互调节，其确切机制需要进一步探索。L-NAME、MK801、东莨菪碱以及哌拉唑嗪对GDNF以及受体GDNFR-α和GDNFR-β基因表达有一定程度调节作用,这些作用可能是它们参与吗啡依赖过程的机制之一。
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基金项目：浙江省医药卫生科研基金资助项目(98A093)
参 考 文 献
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收稿日期：1999-02-04, 百拇医药