模板DNA制备方法对结核分枝杆菌基因扩增微孔板杂交法的影响
作者：杨正林 杜琼 林桂芳 李瑞琦 杨瑞馥 郭兆彪 张敏丽
单位：杨正林(四川省人民医院，成都，610072)； 杜琼(四川省人民医院，成都，610072)； 林桂芳(成都铁路结核病医院，成都，610072)； 李瑞琦(成都铁路结核病医院，成都，610072)； 杨瑞馥(中国军事医学科学院，北京，100071)； 郭兆彪(中国军事医学科学院，北京，100071)； 张敏丽(中国军事医学科学院，北京，100071)
关键词：
华西医学000170
分类号：R378.9+1；R446.61 文献标识码：D
文章编号：1002-0179(2000)01-0096-02▲
, 百拇医药 使用聚合酶链反应微孔板杂交对结核病的诊断具有独特之处，但是临床标本处理后供扩增处理液的优劣大大影响了扩增检出灵敏度和特异性标本中结核杆菌的游析和浓缩，结核杆菌裂解程度，释放的DNA的回收和质量，临床标本中的抑制因素的消除是保证灵敏度和特异性的关键因素，因此，选择合适的结核杆菌DNA模板提取、纯化方法是非常重要的〔1〕。为此，我们对10种国内外现较引人注目的DNA提取、纯化方法在结核中应用情况进行了比较分析。
1 材料与方法
1.1 实验标本 菌株：结核杆菌临床分离株系成都铁路结核病医院按常规分离、鉴定，并在罗琼氏培养基培养增菌，将培养菌按KolK等方法制成乳状悬液，用TBT液〔0.1%Tween-80，0.5mgBSA，20mMTriHCl，(pH7.6)〕稀释乳化菌悬液，在420nm测定其光密度，根据其光密度计算出每毫升培养液中结核杆菌数(O.D为0.15时，对应菌数为108个/ml)，进一步用萋纳氏抗酸染色后，用盖氏计数池计数结核杆菌数，将细菌用TBT液稀释至所需不同浓度，4℃保存备用〔2〕。
, 百拇医药
1.2 标本准备 从四川省人民医院收集非结核病人的痰，所有痰均经培养和PCR证实无结核杆菌复合物的存在，痰经由乙酰半胱氨酸—氢氧化钠(NALC—NaOH)处理液化后，按3ml支-20℃存放。水经由BAXTER水净化器净化(BAXTER公司)。
1.3 实验样本设计 按每份样本200μl体积，分别设计无结核杆菌水、含不同结核杆菌数水(102/ml；103/ml；104/ml)；无结核杆菌痰，含不同结核杆菌数痰(102/ml；103/ml；104/ml)，将准备好的标本立即置-20℃，保存备用〔1，3〕。
2 实验方法
2.1 不同方法制备结核杆菌DNA模板：所有标本先行12000rpm离心10分钟集菌，然后分别用下列方法处理：
, 百拇医药
经典酶裂解、酚：氯仿抽提法：将集菌沉淀用STE(0.01MTris—HCl，0.1m NaCl—1mMEDTA)洗涤，12000rpm，离心10分钟，沉淀物悬游于400μl STE中，加溶菌酶(25mg/ml)20μl，37℃1.5小时，加蛋白酶K液(5mg/ml)20μl，10%SDS 50μl，65℃10小时，然后行酚：氯仿抽取DNA，具体操作按《分子克隆操作指南》进行〔4〕。
经典碱—SDS裂解，酚—氯仿提取法：将集菌沉淀物加入50μl，0.1NaOH-2MNaCl-0.5%SDS，95℃15分钟，0.4ml 0.1MTris-HCl(pH7)，酚：氯仿提取2次，乙醇沉淀，溶于50μl 10mMTris-HCl(pH8.0)，0.1mMEDTA作为结核DNA模板〔4〕。
碱裂解煮沸法：沉淀加入裂解液(2%SDS，20μg/ml蛋白酶K，10mmlo/L Tris*Cl(pH8.0)，8mmol/LEDTA(pH8.0)，56℃3小时，100℃沸水浴10分钟，10000rpm离心5分钟，上清液作待测DNA模板。
, 百拇医药
冻融法：沉淀物加入2%Trition X-100，放-20℃3分钟，90℃水浴3分钟，反复冻融5次，沸水浴10分钟，10000rpm离心5分钟，上清作扩增模板。
超声波裂解法：沉淀物加20μl超纯水，超声水浴60μ/3500HZ 12分钟10000rpm离心5分钟，上清即可作扩增模板〔2〕。
微波法：沉淀物悬游于10 μlTE液中，50μl 10% SDS，65℃30分钟，10000rpm离心5分钟，沉淀用微波处理750W1分钟×3，加入40μl水，充分混匀后，10000rpm离心5分钟，上清液即可用于扩增。
氯仿直接提取法：集菌沉淀加入50μl超纯水，充分混匀后，加50μl氯仿，剧烈振荡3分钟，12000rpm，离心5分钟，上层液即可作扩增用。
裂解液裂解玻璃粉—硅吸附提纯法：用自行研制的玻璃粉—硅DNA提纯系统：菌沉淀中加入超纯水40μl，混匀后，加溶液Ⅰ(主要含玻璃粉—硅)1滴，充分混匀后，煮沸10分钟，静置5分钟，6000rpm离心3分钟，去上清，加入溶液Ⅱ(主要为70%酒精)6滴、混匀6000rpm离心3分钟，去上清，沉淀37℃干燥10分钟，加入溶液Ⅲ(DNA洗脱液)，混匀，离心，上清即可作为模板〔5〕。
, 百拇医药
Chelex-100一步法：沉淀加入5倍体积15%chelex-100水悬液，100℃煮沸15分钟，12000rpm离心10分钟，上清作扩增模板〔6〕。
异硫氰酸胍法：按Sambrook等〔4〕所述方法进行。
2.2 基因扩增微孔板杂交 按杨正林等〔7〕所述方法进行，用不同方法制备的结核杆菌DNA模板分别用5′端标记生物素的引物进行聚合酶链扩增反应，将扩增产物与微孔板上包被的结核克隆靶基因杂交，用酶标链霉亲和素和酶底物进行显色反应，测定光密度，以光密度大于0.1作为阳性结果。在整个实验过程中设立强阳性、弱阳性和阴性对照。
3 结果
实验设立强阳性、弱阳性、阴性对照均能达到预期结果。
, 百拇医药 不同结核杆菌DNA提取，纯化方法，能使基因扩增微孔板杂交法具有不同的特异性和灵敏度。具体结果见表1。
表1.结核杆菌DNA不同提纯方法基因扩增杂交结果 方 法
水中结核杆菌数
痰中结核杆菌数
0(20)
102(20)
103(20)
104(20)
0(20)
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103(20)
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经典酶酚：氯仿
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经典碱—SDS裂解
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碱裂解煮沸
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冻融法
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超声裂解
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微波裂解
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氯仿直接提取
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玻璃粉—硅吸附
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异硫氰酸胍
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注：括号内为实验样品数
4 讨论
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在基因扩增微孔板杂交试验中，待扩增模板DNA的制备是非常重要的，直接影响整个实验的灵敏度和特异性，尤其是结核杆菌的基因扩增前处理更为麻烦，因为结核杆菌的胞壁较厚不易破碎，加之检测结核杆菌的临床标本多为痰、胸腹水、脑脊液、小便等，这些标本的复杂成分对结核杆菌DNA的提取，纯化有极大影响〔1，2〕。从实验结果可以看出，经典的酚：氯仿抽提法，使实验结果具有高特异性，但是其灵敏度受影响，因为反复酚：氯仿提抽会损失DNA，两种经典方法中，碱—SDS裂解比酶裂解效果好些，如果两种方法联合应用效果更好〔1〕，这与结核杆菌胞壁成分有关，经典法在临床应用受限。另一主要原因是其整个操作过程费时、麻烦。微波裂解法虽比冻融法好些，但两者均不易使结核杆菌胞壁完全破坏，同时，也未去除Taq酶抑制因子，故影响了整个实验的灵敏度和特异性。异硫氰酸胍法在提取其他DNA时效果不错，但在提取结核杆菌DNA时，同样不能使结核杆菌充分裂解，实验效果要差些。我们实验结果显示Chelex-100一步法效果最差，主要是灵敏度低或假阴性多，这与有些报道不一致，此法可能用于从组织、血液、粪便中提取DNA效果较好〔8〕。碱裂解直接煮沸法，是现临床上较常用的方法，简便、价廉、灵敏度高是其特点，也有多篇论文报道了该法的优点，有人认为用NP40取代SDS或Tritox-X-100，Tween20，效果更佳，但该法出现了假阳性结果，同时未去除抑制因子，也会出现假阴性〔9〕，故我们认为不是临床首选方法。玻璃粉—硅吸附法、超声法、氯仿直接提取法提取、纯化结核杆菌DNA更适合于结核杆菌基因扩增微孔板杂交法，三种方法均能使整个检测结果具有高特异性和灵敏度，由于超声法需要超声破碎仪，故另两种方法更适合临床应用，尤其是玻璃粉—硅吸附法，在国外也是推崇的方法，国外很多效果不错的试剂盒多有采用此方法的原理。另外，有报道用蔗糖进行梯度离心或氯化铯提纯结核杆菌DNA显示较好效果。
, 百拇医药
当然，由于结核杆菌簇样存在，精确比较各种方法裂解、纯化效果，精确比较各种方法的特异性和灵敏度是困难的，但在进行基因扩增微孔板杂交前选择简便、特异、灵敏、价廉的结核杆菌提取、纯化方法是至关重要的。〔10〕■
参考文献：
[1] Perera J，Chandrasekharan NV，Kara-unanayake EH PCR based detection of Mycobacterium tuberculosis：effect of sample preparation Southeast.Asian.J.Trop.Med.Public.Health 1994；25(4)∶693～697.
[2] Liedtke W，Opalka B，Zimmermann CW，et al.Different methods of sample preparation influence sensitivity of mcobacterium tuberculosis and Borrelia burgdorferi PCR PCR Method.Application 1994；5∶301～304.
, 百拇医药
[3] Noordheok GT，Kolk AH，Bjne G，et al Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis∶a blind comparison study among seven laboratories.J.Clin.Microbilo 1994；32(2)277～284.
[4] Sambrook J，Fritsh EF，Maniatis Molecular cloning∶A laboratory manual 2nd ed Coldsopring Habor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York 1989.
[5] Boom RC， Sol CJ， Salimans CC，et al.Rapid and Simple method for purification of nucleic acids J Clin Microbiol，1990；28(3)∶495～500.
, http://www.100md.com
[6] Vignoli C，Lamballerie XD，Zandottic et al. Advantage of rapid extraction method of DNA suitable for PCR Res.Virol 1995；146∶159～162.
[7] 杨正林，杨瑞馥，杜琼，等：PCR 微孔板杂交法用于结核分枝杆菌的检测。中华医学检验杂志 1998；5∶287～291。
[8] Sepp K，Szabo I，Uda U，et al ，Rapid techniques for DNA extraction from toutinely processed archival tissue for use in PCR J.Clin.Pathol 1994；47∶318～323.
[9] Kocagoz T，Yilmaz E，Ozkara S，et al.Detection of M ycobacterium tuberculosis in sputum sample by polymerase chain reaction using a simplified procedure J.Clin.Microbiol 1993；31(6)∶1435～1438.
[10] Buck GE， O hara LC.Summersgill JJ Rapid simple method for treating clinical specimens containing Mycobacterium tuberculosis by polynerse chain reaction J.Clin.Microbiol 1992；30(6)∶1514～1517.
收稿日期：1999-06-28, 百拇医药
单位：杨正林(四川省人民医院，成都，610072)； 杜琼(四川省人民医院，成都，610072)； 林桂芳(成都铁路结核病医院，成都，610072)； 李瑞琦(成都铁路结核病医院，成都，610072)； 杨瑞馥(中国军事医学科学院，北京，100071)； 郭兆彪(中国军事医学科学院，北京，100071)； 张敏丽(中国军事医学科学院，北京，100071)
关键词：
华西医学000170
分类号：R378.9+1；R446.61 文献标识码：D
文章编号：1002-0179(2000)01-0096-02▲
, 百拇医药 使用聚合酶链反应微孔板杂交对结核病的诊断具有独特之处，但是临床标本处理后供扩增处理液的优劣大大影响了扩增检出灵敏度和特异性标本中结核杆菌的游析和浓缩，结核杆菌裂解程度，释放的DNA的回收和质量，临床标本中的抑制因素的消除是保证灵敏度和特异性的关键因素，因此，选择合适的结核杆菌DNA模板提取、纯化方法是非常重要的〔1〕。为此，我们对10种国内外现较引人注目的DNA提取、纯化方法在结核中应用情况进行了比较分析。
1 材料与方法
1.1 实验标本 菌株：结核杆菌临床分离株系成都铁路结核病医院按常规分离、鉴定，并在罗琼氏培养基培养增菌，将培养菌按KolK等方法制成乳状悬液，用TBT液〔0.1%Tween-80，0.5mgBSA，20mMTriHCl，(pH7.6)〕稀释乳化菌悬液，在420nm测定其光密度，根据其光密度计算出每毫升培养液中结核杆菌数(O.D为0.15时，对应菌数为108个/ml)，进一步用萋纳氏抗酸染色后，用盖氏计数池计数结核杆菌数，将细菌用TBT液稀释至所需不同浓度，4℃保存备用〔2〕。
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1.2 标本准备 从四川省人民医院收集非结核病人的痰，所有痰均经培养和PCR证实无结核杆菌复合物的存在，痰经由乙酰半胱氨酸—氢氧化钠(NALC—NaOH)处理液化后，按3ml支-20℃存放。水经由BAXTER水净化器净化(BAXTER公司)。
1.3 实验样本设计 按每份样本200μl体积，分别设计无结核杆菌水、含不同结核杆菌数水(102/ml；103/ml；104/ml)；无结核杆菌痰，含不同结核杆菌数痰(102/ml；103/ml；104/ml)，将准备好的标本立即置-20℃，保存备用〔1，3〕。
2 实验方法
2.1 不同方法制备结核杆菌DNA模板：所有标本先行12000rpm离心10分钟集菌，然后分别用下列方法处理：
, 百拇医药
经典酶裂解、酚：氯仿抽提法：将集菌沉淀用STE(0.01MTris—HCl，0.1m NaCl—1mMEDTA)洗涤，12000rpm，离心10分钟，沉淀物悬游于400μl STE中，加溶菌酶(25mg/ml)20μl，37℃1.5小时，加蛋白酶K液(5mg/ml)20μl，10%SDS 50μl，65℃10小时，然后行酚：氯仿抽取DNA，具体操作按《分子克隆操作指南》进行〔4〕。
经典碱—SDS裂解，酚—氯仿提取法：将集菌沉淀物加入50μl，0.1NaOH-2MNaCl-0.5%SDS，95℃15分钟，0.4ml 0.1MTris-HCl(pH7)，酚：氯仿提取2次，乙醇沉淀，溶于50μl 10mMTris-HCl(pH8.0)，0.1mMEDTA作为结核DNA模板〔4〕。
碱裂解煮沸法：沉淀加入裂解液(2%SDS，20μg/ml蛋白酶K，10mmlo/L Tris*Cl(pH8.0)，8mmol/LEDTA(pH8.0)，56℃3小时，100℃沸水浴10分钟，10000rpm离心5分钟，上清液作待测DNA模板。
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冻融法：沉淀物加入2%Trition X-100，放-20℃3分钟，90℃水浴3分钟，反复冻融5次，沸水浴10分钟，10000rpm离心5分钟，上清作扩增模板。
超声波裂解法：沉淀物加20μl超纯水，超声水浴60μ/3500HZ 12分钟10000rpm离心5分钟，上清即可作扩增模板〔2〕。
微波法：沉淀物悬游于10 μlTE液中，50μl 10% SDS，65℃30分钟，10000rpm离心5分钟，沉淀用微波处理750W1分钟×3，加入40μl水，充分混匀后，10000rpm离心5分钟，上清液即可用于扩增。
氯仿直接提取法：集菌沉淀加入50μl超纯水，充分混匀后，加50μl氯仿，剧烈振荡3分钟，12000rpm，离心5分钟，上层液即可作扩增用。
裂解液裂解玻璃粉—硅吸附提纯法：用自行研制的玻璃粉—硅DNA提纯系统：菌沉淀中加入超纯水40μl，混匀后，加溶液Ⅰ(主要含玻璃粉—硅)1滴，充分混匀后，煮沸10分钟，静置5分钟，6000rpm离心3分钟，去上清，加入溶液Ⅱ(主要为70%酒精)6滴、混匀6000rpm离心3分钟，去上清，沉淀37℃干燥10分钟，加入溶液Ⅲ(DNA洗脱液)，混匀，离心，上清即可作为模板〔5〕。
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Chelex-100一步法：沉淀加入5倍体积15%chelex-100水悬液，100℃煮沸15分钟，12000rpm离心10分钟，上清作扩增模板〔6〕。
异硫氰酸胍法：按Sambrook等〔4〕所述方法进行。
2.2 基因扩增微孔板杂交 按杨正林等〔7〕所述方法进行，用不同方法制备的结核杆菌DNA模板分别用5′端标记生物素的引物进行聚合酶链扩增反应，将扩增产物与微孔板上包被的结核克隆靶基因杂交，用酶标链霉亲和素和酶底物进行显色反应，测定光密度，以光密度大于0.1作为阳性结果。在整个实验过程中设立强阳性、弱阳性和阴性对照。
3 结果
实验设立强阳性、弱阳性、阴性对照均能达到预期结果。
, 百拇医药 不同结核杆菌DNA提取，纯化方法，能使基因扩增微孔板杂交法具有不同的特异性和灵敏度。具体结果见表1。
表1.结核杆菌DNA不同提纯方法基因扩增杂交结果 方 法
水中结核杆菌数
痰中结核杆菌数
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103(20)
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注：括号内为实验样品数
4 讨论
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在基因扩增微孔板杂交试验中，待扩增模板DNA的制备是非常重要的，直接影响整个实验的灵敏度和特异性，尤其是结核杆菌的基因扩增前处理更为麻烦，因为结核杆菌的胞壁较厚不易破碎，加之检测结核杆菌的临床标本多为痰、胸腹水、脑脊液、小便等，这些标本的复杂成分对结核杆菌DNA的提取，纯化有极大影响〔1，2〕。从实验结果可以看出，经典的酚：氯仿抽提法，使实验结果具有高特异性，但是其灵敏度受影响，因为反复酚：氯仿提抽会损失DNA，两种经典方法中，碱—SDS裂解比酶裂解效果好些，如果两种方法联合应用效果更好〔1〕，这与结核杆菌胞壁成分有关，经典法在临床应用受限。另一主要原因是其整个操作过程费时、麻烦。微波裂解法虽比冻融法好些，但两者均不易使结核杆菌胞壁完全破坏，同时，也未去除Taq酶抑制因子，故影响了整个实验的灵敏度和特异性。异硫氰酸胍法在提取其他DNA时效果不错，但在提取结核杆菌DNA时，同样不能使结核杆菌充分裂解，实验效果要差些。我们实验结果显示Chelex-100一步法效果最差，主要是灵敏度低或假阴性多，这与有些报道不一致，此法可能用于从组织、血液、粪便中提取DNA效果较好〔8〕。碱裂解直接煮沸法，是现临床上较常用的方法，简便、价廉、灵敏度高是其特点，也有多篇论文报道了该法的优点，有人认为用NP40取代SDS或Tritox-X-100，Tween20，效果更佳，但该法出现了假阳性结果，同时未去除抑制因子，也会出现假阴性〔9〕，故我们认为不是临床首选方法。玻璃粉—硅吸附法、超声法、氯仿直接提取法提取、纯化结核杆菌DNA更适合于结核杆菌基因扩增微孔板杂交法，三种方法均能使整个检测结果具有高特异性和灵敏度，由于超声法需要超声破碎仪，故另两种方法更适合临床应用，尤其是玻璃粉—硅吸附法，在国外也是推崇的方法，国外很多效果不错的试剂盒多有采用此方法的原理。另外，有报道用蔗糖进行梯度离心或氯化铯提纯结核杆菌DNA显示较好效果。
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当然，由于结核杆菌簇样存在，精确比较各种方法裂解、纯化效果，精确比较各种方法的特异性和灵敏度是困难的，但在进行基因扩增微孔板杂交前选择简便、特异、灵敏、价廉的结核杆菌提取、纯化方法是至关重要的。〔10〕■
参考文献：
[1] Perera J，Chandrasekharan NV，Kara-unanayake EH PCR based detection of Mycobacterium tuberculosis：effect of sample preparation Southeast.Asian.J.Trop.Med.Public.Health 1994；25(4)∶693～697.
[2] Liedtke W，Opalka B，Zimmermann CW，et al.Different methods of sample preparation influence sensitivity of mcobacterium tuberculosis and Borrelia burgdorferi PCR PCR Method.Application 1994；5∶301～304.
, 百拇医药
[3] Noordheok GT，Kolk AH，Bjne G，et al Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis∶a blind comparison study among seven laboratories.J.Clin.Microbilo 1994；32(2)277～284.
[4] Sambrook J，Fritsh EF，Maniatis Molecular cloning∶A laboratory manual 2nd ed Coldsopring Habor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York 1989.
[5] Boom RC， Sol CJ， Salimans CC，et al.Rapid and Simple method for purification of nucleic acids J Clin Microbiol，1990；28(3)∶495～500.
, http://www.100md.com
[6] Vignoli C，Lamballerie XD，Zandottic et al. Advantage of rapid extraction method of DNA suitable for PCR Res.Virol 1995；146∶159～162.
[7] 杨正林，杨瑞馥，杜琼，等：PCR 微孔板杂交法用于结核分枝杆菌的检测。中华医学检验杂志 1998；5∶287～291。
[8] Sepp K，Szabo I，Uda U，et al ，Rapid techniques for DNA extraction from toutinely processed archival tissue for use in PCR J.Clin.Pathol 1994；47∶318～323.
[9] Kocagoz T，Yilmaz E，Ozkara S，et al.Detection of M ycobacterium tuberculosis in sputum sample by polymerase chain reaction using a simplified procedure J.Clin.Microbiol 1993；31(6)∶1435～1438.
[10] Buck GE， O hara LC.Summersgill JJ Rapid simple method for treating clinical specimens containing Mycobacterium tuberculosis by polynerse chain reaction J.Clin.Microbiol 1992；30(6)∶1514～1517.
收稿日期：1999-06-28, 百拇医药