恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2基因克隆及其在大肠杆菌中的表达
作者：陈志辉 管惟滨 吴少廷 缪为民 焦炳华
单位：
关键词：疟原虫，恶性；裂殖子表面蛋白2；基因克隆；原核表达
第二军医大学学报000407 【摘要】目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2全基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用PCR扩增恶性疟原虫FCC-1/HN株MSP2基因，克隆插入pUC19，并重组入表达质粒载体中，转化大肠杆菌，诱导重组质粒pBK-CMV/msp2表达MSP2蛋白，对表达产物进行SDS-PAGE，dot-ELISA和Western blot鉴定。结果：PCR扩增出824 bp DNA片段，经酶切鉴定和部分序列测定证实为MSP2基因序列；表达产物的相对分子质量为3.2×104，与MSP2的理论分子质量相符，用dot-ELISA和Western blot均证实表达产物具有恶性疟原虫抗原表位。但表达产物的量较低，约占菌体总蛋白量的10%。结论：恶性疟原虫MSP2基因可以在大肠杆菌中得到表达，但表达产物的产量有待进一步提高。
, 百拇医药
【中图分类号】Q 786 【文献标识码】 A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0322-04
Cloning of merozoite surface protein-2 gene of Plasmodium falciparum and its expression in E.coli
CHEN Zhi-Hui,GUAN Wei-Bin
(Department of Parasitology,Department of Basic Medicine,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
WU Shao-Ting
, 百拇医药
(Shenzhen Sanitary and Epidemic Disease Provention Station)
MIAO Wei-Min,JIAO Bin-Hua
(Department of Health Toxicology,Department of Basic Medicine,Second Military Medical University)
【ABSTRACT】Objective:To clone whole merozoite surface protein-2(MSP2) gene of Plasmodium falciparum and express it in E.coli.Methods:Whole MSP2 gene fragment was amplified from the genome DNA of Plasmodium falciparum FCC-1/HN strain by PCR and was inserted into plasmid pUC19 and then subcloned into the expressing plasmid.The recombinant vectors were transformed into E.coli.The transformed bacteria bearing pBK-CMV/msp2 plasmids were induced for the production of MSP2.The expressed product was analyzed with SDS-PAGE,dot-ELISA and Western blot.Results:A fragment sized 824 bp was amplified by PCR.It was confirmed by restriction site mapping and sequencing that the fragment was MSP2 gene.pBK-CMV/msp2 transformed bacteria produced the desired protein with a relative molecular mass of 3.2×104,presenting 10% of the total bacterial proteins.The expressed protein exhibited a strong reaction with anti-malarial antibodies as detected by dot-ELISA with serum obtained from patient with falciparum malaria.When the products were blotted with the same serum,specific bands of 3.2×104 representing MSP2 were identified.Conclusion:MSP2 gene of Plasmodium falciparum can be expressed in E.coli.But more efficient expression system for MSP2 should be established.
, 百拇医药
【KEY WORDS】Plasmodium falciparum；merozoite surface protein-2；gene cloning；prokaryotic expression
恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2 (merozoite surface protein-2，MSP2)是恶性疟原虫红细胞期重要的保护性抗原之一，MSP2分子位于裂殖子表面，抗MSP2的单克隆抗体和免疫血清在体外能有效地阻断裂殖子侵入红细胞和抑制疟原虫生长[1,2]， 用恶性疟原虫MSP2免疫小鼠能保护小鼠抵抗夏氏疟原虫感染[3,4]。为了进一步研究MSP2及其基因的免疫学特性及生物学特点，我们克隆出恶性疟原虫FCC-1/HN株MSP2全基因，并且在大肠杆菌内得到了表达。
1 材料和方法
1.1 主要材料和试剂 恶性疟原虫FCC-1/HN株由广东药学院惠赠，深圳市卫生防疫站体外培养冻存。DNA合成全套试剂为美国ABI公司产品，Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶和T4 DNA 连接酶均为Promega公司产品。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)均为Serva公司产品。HRP标记羊抗人IgG抗体为华顺生物试剂公司进口美国产品分装。
, 百拇医药
1.2 方 法
1.2.1 恶性疟原虫MSP2基因的扩增及初步酶切鉴定 采用PCR方法扩增MSP2基因序列，根据恶性疟原虫MSP2基因序列借助PCGENE和GOLDKEY核酸蛋白质计算机分析软件(瑞士；中国人民解放军军事医学科学院)自行设计并合成一对引物，P1： 5′- CTCGTCGACTGTCAAAATGAAGGTAA-3′,P2： 5′- CAGGATCCGAGAATTATATGAATATGGCA-3′，在391-05型DNA/RNA合成仪(美国PE公司)上合成，采用OPC柱纯化。提取恶性疟原虫基因组DNA作为PCR反应的模板，在9600型PCR扩增仪( PE公司)上反应，基本反应程序，95℃预变性2 min,94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min,循环30次。取PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后置凝胶分析系统中观察，拍照记录。PCR产物采用Wizard PCR Preps DNA纯化系统试剂盒纯化，取纯化产物用限制性内切酶XbaⅠ 酶切，酶切产物作3%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。
, 百拇医药
1.2.2 MSP2基因的克隆及重组质粒的鉴定 取经纯化的PCR MSP2基因产物和质粒pUC19，分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物经纯化，T4 DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌JM103，平板培养转化菌，挑取白色菌落，液体培养，小量制备质粒，用限制性内切酶酶切鉴定。采用Abi Prism377型DNA测序仪，应用M13正向通用引物对克隆的MSP2基因进行序列测定(美国Cybersyn公司)。重组质粒命名为pUC19/msp2。
1.2.3 MSP2全基因在大肠杆菌中的表达 重组表达质粒pBK-CMV/msp2的构建，取质粒pUC19/ msp2用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ 双酶切回收MSP2，与经相应酶切的表达载体pBK-CMV(STRATA-GENE公司，美国)连接，常规筛选重组子，并采用PCR和酶切鉴定。重组质粒在大肠杆菌中的表达，取经鉴定的重组表达质粒pBK-CMV/msp2和载体质粒pBK-CMV转化的大肠杆菌DH5α，分别接种含100 μg/ml卡那霉素的LB细菌培养液3 ml，37℃振荡培养过夜。取40 μl菌液接种含100 μg/ml卡那霉素的LB细菌培养基4 ml，37℃振荡培养4 h，加IPTG使终浓度为1 mmol/L，继续37℃振荡培养4 h。表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。表达蛋白按文献方法进行Western blot鉴定[5]，恶性疟患者血清工作浓度为1∶100，酶标羊抗人IgG工作浓度为1∶1 000。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 恶性疟原虫MSP2基因的扩增及酶切鉴定 采用PCR方法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出824 bp的片段(图1)；PCR产物用XbaⅠ酶切得到632和192 bp两个片段(图2)，均与理论值大小一致。
图 1 PCR扩增恶性疟原虫基因组中的MSP2基因
Fig 1 MSP2 gene amplified by PCR from genomic
DNA of P.falciparum
Lane 1：Molecular mass marker (pBR322/BstN I);
, 百拇医药
Lane 2：P.falciparum FCC-1/HN
图 2 MSP2基因PCR扩增产物XbaⅠ酶切鉴定
Fig 2 Identification of MSP2 gene by Xba Ⅰ digestion
Lane 1：Molecular mass marker(pBR322/Msp I)；
Lane 2：MSP2 gene digested with Xba Ⅰ
2.2 重组克隆质粒的构建及鉴定 MSP2基因重组克隆质粒pUC 19/msp2的大小为3 487 bp，采用MSP2基因两端引物，质粒作为模板进行PCR扩增，得到与插入片段大小一致(824 bp)的DNA；质粒用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，得到与质粒载体和插入基因片段大小一致的两段DNA。
, 百拇医药
2.3 克隆MSP2基因的序列测定 3′端部分(第296～795位碱基)序列的测定结果通过GOLDKEY核酸蛋白质分析软件比较分析，其序列与国内李明等[6]的测序结果一致。
2.4 MSP2基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE分析及Western blot鉴定 质粒pBK-CMV/msp2在大肠杆菌DH5α中的表达产物经SDS-PAGE分析，与载体质粒转化菌比较，含MSP2基因转化菌电泳凝胶上出现新的蛋白条带，为相对分子质量约3.2×104的蛋白(图3)，加IPTG诱导4 h表达量最高，该条带所含蛋白量约占菌体蛋白总量的10%。将质粒转化菌菌体蛋白转移到混合纤维素滤膜上，用恶性疟原虫患者血清进行Westernblot分析，在相当于3.2×104处出现与患者血清反应的特异染色区带，而不带MSP2基因的载体转化菌未见特异染色带(图4)。
, http://www.100md.com
图 3 质粒pBK-CMV/msp2表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 3 SDS-PAGE analysis of the proteins expressed
by E.coli bearing pBK-CMV/msp2
Lane 1： Molecular mass marker； Lane 2： pBK-CMV/DH5α after induction with 1 mmol/L IPTG； Lane 3,4： pBK-CMV/msp2/DH5α
expressing MSP2 after induction for 3 or 4 h
with 1 mmol/L IPTG,respectively
, 百拇医药
图 4 pBK-CMV/msp2表达产物的Western blot鉴定
Fig 4 Expressed product of pBK-CMV/msp2 was
identified by Western blotLane 1：Molecular mass marker； Lane 2：pBK-CMV/DH5α after
induction with 1 mmol/L IPTG； Lane 3：pBK-CMV/msp2/DH5α
expressing MSP2 afterinduction with 1 mmol/L IPTG；
Lane 4：pBK-CMV/msp2/DH5α expressing MSP2
, 百拇医药
reacted with normal serum
3 讨 论
MSP2是恶性疟原虫红细胞期重要的保护性抗原之一，相对分子质量3.5×104～5.5×104[7]， 但是其基因编码序列的全长为795 bp，编码264个氨基酸 [8]。根据恶性疟原虫不同地理分离株MSP2基因序列的分析表明，MSP2具有两种不同的等位基因型，不同虫株基因序列和抗原表位有较大差异 [6，8～10]，我国虫株(包括FCC-1/HN与FC-27株)高度同源[6]。
过去对MSP2基因的多态性研究较多，但对它作为疫苗候选物的研究还不够深入，恶性疟原虫完整MSP2基因体外表达国内尚未见报道。本研究根据基因库中恶性疟原虫FC-27株的MSP2基因序列设计引物，从我国FCC-1/HN株恶性疟原虫基因组中扩增出大小约824 bp的DNA产物，经限制性内切酶片段分析及对克隆质粒MSP2基因3′端部分序列测定结果与国内报道的序列一致，表明所得到的克隆质粒含恶性疟原虫MSP2基因序列。克隆的基因进一步重组插入质粒pBK-CMV，在大肠杆菌内表达出相对分子质量约为3.2×104的蛋白，与理论值一致，经Western blot证实该蛋白含恶性疟原虫抗原决定簇，表明恶性疟原虫MSP2基因得到了表达，但其表达效率较低，根据表达蛋白在电泳中条带的浓度估计表达蛋白量不到细菌菌体总蛋白量的10%。我们曾采用质粒pProEX HTb作为载体对MSP2基因进行表达，表达量也不超过菌体总蛋白量的10%。
, 百拇医药
【参考文献】
[1]Epping RJ,Goldstone SD,Ingram LT,et al.An epitope recognised by inhibitory monoclonal antibodies that react with a 51 kilodalton merozoite surface antigen in Plasmodium falciparum[J].Mol Biochem Parasitol,1988,28(1):1-10.
[2]Clark JT,Donachie S,Anand R,et al.46-53 kilodalton glycoprotein from the surface of Plasmodium falciparum merozoites[J].Mol Biochem Parasitol,1989,32(1):15-24.
, http://www.100md.com [3]Saul A,Lord R,Jones GL,et al.Protective immunization with invariant peptides of the Plasmodium falciparum antigen MSA2[J].J Immunol,1992,148(1):208-211.
[4]Lougovskoi AA,Okoyeh NJ,Chauhan VS.Mice immunised with synthetic peptide from N-terminal conserved region of merozoite surface antigen-2 of human malaria parasite Plasmodium falciparum can control infection induced by Plasmodium yoelii 265BY strain[J].Vaccine,1999,18(9-10):920-930.
, 百拇医药
[5]Hawkes R.Identification of concanavalin A-binding proteins after sodium dodecyl sulphate-gel electrophoresis and protein blotting[J].Anal Biochem，1982，123(1):143-145.
[6]李 明,谢 毅,李英杰,等.恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA2基因的克隆和序列分析[J].第一军医大学学报,1995,15(2):94-96.
[7]Fenton B,Clark JT,Wilson CF,et al.Polymorphism of a 35～48 kDa Plasmodium falciparum merozoite surface antigen [J].Mol Biochem Parasitol,1989,34(1):79-86.
, http://www.100md.com
[8]Smythe JA,Coppel RL,Day KP,et al.Structural diversity in the Plasmodium falciparum merozoite surface antigen [J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(5):1751-1755.
[9]Thomas AW,Carr DA,Carter JM,et al.Sequence comparison of allelic forms of the Plasmodium falciparum merozoite surface antigen [J].Mol Biochem Parasitol,1990,43(2):211-220.
[10]Smythe JA,Peterson MG,Coppel RL,et al.Structural diversity in the 45-kilodalton merozoite surface antigen of Plasmodium falciparum[J].Mol Biochem Parasitol,1990,39(2):227-234.
【收稿日期】1999-11-13
【修回日期】2000-02-25, 百拇医药
单位：
关键词：疟原虫，恶性；裂殖子表面蛋白2；基因克隆；原核表达
第二军医大学学报000407 【摘要】目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2全基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用PCR扩增恶性疟原虫FCC-1/HN株MSP2基因，克隆插入pUC19，并重组入表达质粒载体中，转化大肠杆菌，诱导重组质粒pBK-CMV/msp2表达MSP2蛋白，对表达产物进行SDS-PAGE，dot-ELISA和Western blot鉴定。结果：PCR扩增出824 bp DNA片段，经酶切鉴定和部分序列测定证实为MSP2基因序列；表达产物的相对分子质量为3.2×104，与MSP2的理论分子质量相符，用dot-ELISA和Western blot均证实表达产物具有恶性疟原虫抗原表位。但表达产物的量较低，约占菌体总蛋白量的10%。结论：恶性疟原虫MSP2基因可以在大肠杆菌中得到表达，但表达产物的产量有待进一步提高。
, 百拇医药
【中图分类号】Q 786 【文献标识码】 A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0322-04
Cloning of merozoite surface protein-2 gene of Plasmodium falciparum and its expression in E.coli
CHEN Zhi-Hui,GUAN Wei-Bin
(Department of Parasitology,Department of Basic Medicine,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
WU Shao-Ting
, 百拇医药
(Shenzhen Sanitary and Epidemic Disease Provention Station)
MIAO Wei-Min,JIAO Bin-Hua
(Department of Health Toxicology,Department of Basic Medicine,Second Military Medical University)
【ABSTRACT】Objective:To clone whole merozoite surface protein-2(MSP2) gene of Plasmodium falciparum and express it in E.coli.Methods:Whole MSP2 gene fragment was amplified from the genome DNA of Plasmodium falciparum FCC-1/HN strain by PCR and was inserted into plasmid pUC19 and then subcloned into the expressing plasmid.The recombinant vectors were transformed into E.coli.The transformed bacteria bearing pBK-CMV/msp2 plasmids were induced for the production of MSP2.The expressed product was analyzed with SDS-PAGE,dot-ELISA and Western blot.Results:A fragment sized 824 bp was amplified by PCR.It was confirmed by restriction site mapping and sequencing that the fragment was MSP2 gene.pBK-CMV/msp2 transformed bacteria produced the desired protein with a relative molecular mass of 3.2×104,presenting 10% of the total bacterial proteins.The expressed protein exhibited a strong reaction with anti-malarial antibodies as detected by dot-ELISA with serum obtained from patient with falciparum malaria.When the products were blotted with the same serum,specific bands of 3.2×104 representing MSP2 were identified.Conclusion:MSP2 gene of Plasmodium falciparum can be expressed in E.coli.But more efficient expression system for MSP2 should be established.
, 百拇医药
【KEY WORDS】Plasmodium falciparum；merozoite surface protein-2；gene cloning；prokaryotic expression
恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2 (merozoite surface protein-2，MSP2)是恶性疟原虫红细胞期重要的保护性抗原之一，MSP2分子位于裂殖子表面，抗MSP2的单克隆抗体和免疫血清在体外能有效地阻断裂殖子侵入红细胞和抑制疟原虫生长[1,2]， 用恶性疟原虫MSP2免疫小鼠能保护小鼠抵抗夏氏疟原虫感染[3,4]。为了进一步研究MSP2及其基因的免疫学特性及生物学特点，我们克隆出恶性疟原虫FCC-1/HN株MSP2全基因，并且在大肠杆菌内得到了表达。
1 材料和方法
1.1 主要材料和试剂 恶性疟原虫FCC-1/HN株由广东药学院惠赠，深圳市卫生防疫站体外培养冻存。DNA合成全套试剂为美国ABI公司产品，Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶和T4 DNA 连接酶均为Promega公司产品。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)均为Serva公司产品。HRP标记羊抗人IgG抗体为华顺生物试剂公司进口美国产品分装。
, 百拇医药
1.2 方 法
1.2.1 恶性疟原虫MSP2基因的扩增及初步酶切鉴定 采用PCR方法扩增MSP2基因序列，根据恶性疟原虫MSP2基因序列借助PCGENE和GOLDKEY核酸蛋白质计算机分析软件(瑞士；中国人民解放军军事医学科学院)自行设计并合成一对引物，P1： 5′- CTCGTCGACTGTCAAAATGAAGGTAA-3′,P2： 5′- CAGGATCCGAGAATTATATGAATATGGCA-3′，在391-05型DNA/RNA合成仪(美国PE公司)上合成，采用OPC柱纯化。提取恶性疟原虫基因组DNA作为PCR反应的模板，在9600型PCR扩增仪( PE公司)上反应，基本反应程序，95℃预变性2 min,94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min,循环30次。取PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后置凝胶分析系统中观察，拍照记录。PCR产物采用Wizard PCR Preps DNA纯化系统试剂盒纯化，取纯化产物用限制性内切酶XbaⅠ 酶切，酶切产物作3%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。
, 百拇医药
1.2.2 MSP2基因的克隆及重组质粒的鉴定 取经纯化的PCR MSP2基因产物和质粒pUC19，分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物经纯化，T4 DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌JM103，平板培养转化菌，挑取白色菌落，液体培养，小量制备质粒，用限制性内切酶酶切鉴定。采用Abi Prism377型DNA测序仪，应用M13正向通用引物对克隆的MSP2基因进行序列测定(美国Cybersyn公司)。重组质粒命名为pUC19/msp2。
1.2.3 MSP2全基因在大肠杆菌中的表达 重组表达质粒pBK-CMV/msp2的构建，取质粒pUC19/ msp2用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ 双酶切回收MSP2，与经相应酶切的表达载体pBK-CMV(STRATA-GENE公司，美国)连接，常规筛选重组子，并采用PCR和酶切鉴定。重组质粒在大肠杆菌中的表达，取经鉴定的重组表达质粒pBK-CMV/msp2和载体质粒pBK-CMV转化的大肠杆菌DH5α，分别接种含100 μg/ml卡那霉素的LB细菌培养液3 ml，37℃振荡培养过夜。取40 μl菌液接种含100 μg/ml卡那霉素的LB细菌培养基4 ml，37℃振荡培养4 h，加IPTG使终浓度为1 mmol/L，继续37℃振荡培养4 h。表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。表达蛋白按文献方法进行Western blot鉴定[5]，恶性疟患者血清工作浓度为1∶100，酶标羊抗人IgG工作浓度为1∶1 000。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 恶性疟原虫MSP2基因的扩增及酶切鉴定 采用PCR方法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出824 bp的片段(图1)；PCR产物用XbaⅠ酶切得到632和192 bp两个片段(图2)，均与理论值大小一致。
图 1 PCR扩增恶性疟原虫基因组中的MSP2基因
Fig 1 MSP2 gene amplified by PCR from genomic
DNA of P.falciparum
Lane 1：Molecular mass marker (pBR322/BstN I);
, 百拇医药
Lane 2：P.falciparum FCC-1/HN
图 2 MSP2基因PCR扩增产物XbaⅠ酶切鉴定
Fig 2 Identification of MSP2 gene by Xba Ⅰ digestion
Lane 1：Molecular mass marker(pBR322/Msp I)；
Lane 2：MSP2 gene digested with Xba Ⅰ
2.2 重组克隆质粒的构建及鉴定 MSP2基因重组克隆质粒pUC 19/msp2的大小为3 487 bp，采用MSP2基因两端引物，质粒作为模板进行PCR扩增，得到与插入片段大小一致(824 bp)的DNA；质粒用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，得到与质粒载体和插入基因片段大小一致的两段DNA。
, 百拇医药
2.3 克隆MSP2基因的序列测定 3′端部分(第296～795位碱基)序列的测定结果通过GOLDKEY核酸蛋白质分析软件比较分析，其序列与国内李明等[6]的测序结果一致。
2.4 MSP2基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE分析及Western blot鉴定 质粒pBK-CMV/msp2在大肠杆菌DH5α中的表达产物经SDS-PAGE分析，与载体质粒转化菌比较，含MSP2基因转化菌电泳凝胶上出现新的蛋白条带，为相对分子质量约3.2×104的蛋白(图3)，加IPTG诱导4 h表达量最高，该条带所含蛋白量约占菌体蛋白总量的10%。将质粒转化菌菌体蛋白转移到混合纤维素滤膜上，用恶性疟原虫患者血清进行Westernblot分析，在相当于3.2×104处出现与患者血清反应的特异染色区带，而不带MSP2基因的载体转化菌未见特异染色带(图4)。
, http://www.100md.com
图 3 质粒pBK-CMV/msp2表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 3 SDS-PAGE analysis of the proteins expressed
by E.coli bearing pBK-CMV/msp2
Lane 1： Molecular mass marker； Lane 2： pBK-CMV/DH5α after induction with 1 mmol/L IPTG； Lane 3,4： pBK-CMV/msp2/DH5α
expressing MSP2 after induction for 3 or 4 h
with 1 mmol/L IPTG,respectively
, 百拇医药
图 4 pBK-CMV/msp2表达产物的Western blot鉴定
Fig 4 Expressed product of pBK-CMV/msp2 was
identified by Western blotLane 1：Molecular mass marker； Lane 2：pBK-CMV/DH5α after
induction with 1 mmol/L IPTG； Lane 3：pBK-CMV/msp2/DH5α
expressing MSP2 afterinduction with 1 mmol/L IPTG；
Lane 4：pBK-CMV/msp2/DH5α expressing MSP2
, 百拇医药
reacted with normal serum
3 讨 论
MSP2是恶性疟原虫红细胞期重要的保护性抗原之一，相对分子质量3.5×104～5.5×104[7]， 但是其基因编码序列的全长为795 bp，编码264个氨基酸 [8]。根据恶性疟原虫不同地理分离株MSP2基因序列的分析表明，MSP2具有两种不同的等位基因型，不同虫株基因序列和抗原表位有较大差异 [6，8～10]，我国虫株(包括FCC-1/HN与FC-27株)高度同源[6]。
过去对MSP2基因的多态性研究较多，但对它作为疫苗候选物的研究还不够深入，恶性疟原虫完整MSP2基因体外表达国内尚未见报道。本研究根据基因库中恶性疟原虫FC-27株的MSP2基因序列设计引物，从我国FCC-1/HN株恶性疟原虫基因组中扩增出大小约824 bp的DNA产物，经限制性内切酶片段分析及对克隆质粒MSP2基因3′端部分序列测定结果与国内报道的序列一致，表明所得到的克隆质粒含恶性疟原虫MSP2基因序列。克隆的基因进一步重组插入质粒pBK-CMV，在大肠杆菌内表达出相对分子质量约为3.2×104的蛋白，与理论值一致，经Western blot证实该蛋白含恶性疟原虫抗原决定簇，表明恶性疟原虫MSP2基因得到了表达，但其表达效率较低，根据表达蛋白在电泳中条带的浓度估计表达蛋白量不到细菌菌体总蛋白量的10%。我们曾采用质粒pProEX HTb作为载体对MSP2基因进行表达，表达量也不超过菌体总蛋白量的10%。
, 百拇医药
【参考文献】
[1]Epping RJ,Goldstone SD,Ingram LT,et al.An epitope recognised by inhibitory monoclonal antibodies that react with a 51 kilodalton merozoite surface antigen in Plasmodium falciparum[J].Mol Biochem Parasitol,1988,28(1):1-10.
[2]Clark JT,Donachie S,Anand R,et al.46-53 kilodalton glycoprotein from the surface of Plasmodium falciparum merozoites[J].Mol Biochem Parasitol,1989,32(1):15-24.
, http://www.100md.com [3]Saul A,Lord R,Jones GL,et al.Protective immunization with invariant peptides of the Plasmodium falciparum antigen MSA2[J].J Immunol,1992,148(1):208-211.
[4]Lougovskoi AA,Okoyeh NJ,Chauhan VS.Mice immunised with synthetic peptide from N-terminal conserved region of merozoite surface antigen-2 of human malaria parasite Plasmodium falciparum can control infection induced by Plasmodium yoelii 265BY strain[J].Vaccine,1999,18(9-10):920-930.
, 百拇医药
[5]Hawkes R.Identification of concanavalin A-binding proteins after sodium dodecyl sulphate-gel electrophoresis and protein blotting[J].Anal Biochem，1982，123(1):143-145.
[6]李 明,谢 毅,李英杰,等.恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA2基因的克隆和序列分析[J].第一军医大学学报,1995,15(2):94-96.
[7]Fenton B,Clark JT,Wilson CF,et al.Polymorphism of a 35～48 kDa Plasmodium falciparum merozoite surface antigen [J].Mol Biochem Parasitol,1989,34(1):79-86.
, http://www.100md.com
[8]Smythe JA,Coppel RL,Day KP,et al.Structural diversity in the Plasmodium falciparum merozoite surface antigen [J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(5):1751-1755.
[9]Thomas AW,Carr DA,Carter JM,et al.Sequence comparison of allelic forms of the Plasmodium falciparum merozoite surface antigen [J].Mol Biochem Parasitol,1990,43(2):211-220.
[10]Smythe JA,Peterson MG,Coppel RL,et al.Structural diversity in the 45-kilodalton merozoite surface antigen of Plasmodium falciparum[J].Mol Biochem Parasitol,1990,39(2):227-234.
【收稿日期】1999-11-13
【修回日期】2000-02-25, 百拇医药