试用ICAM-1相关小分子肽抑制角朊细胞介导的共刺激效应
作者：张 明 杨贵贞
单位：白求恩医科大学基础医学院免疫学教研室，长春130021
关键词：噬菌体展示技术；细胞间粘附分子-1；超抗原；中毒性休克综合征毒素-1；角朊细胞
中国免疫学杂志990907 摘 要 目的：探讨ICAM-1相关肽抑制角朊细胞将超抗原TSST-1递呈给T淋巴细胞。方法：应用鼠抗人CD54单克隆抗体筛选噬菌体随机十五肽库，经4轮筛选后，挑取20个克隆进行测序，利用含保守序列的阳性克隆噬菌体对角朊细胞递呈超抗原TSST-1给T细胞进行阻断试验。结果：得到保守序列为ITRSFQSSMEPGPPG，所筛选的阳性噬菌体克隆与野生型噬菌体相比具有明显的阻断效应(P<0.01)。结论：ICAM-1相关小分子肽可望降低超抗原介导的皮肤炎症反应。
中国图书号分类号 Q7 R392.12
, 百拇医药
Inhibiting the co-stimulating effect of keratinocyte using ICAM-1 related peptide
ZHANG Ming,YANG Gui-Zhen.
Department of Immunology,Norman Bethune University of
Medical Sciences,Changchun 130021
Abstract Objective:To explore the inhibiting effect of ICAM-1 related sequences peptide on keratinocytes which present superantigen TSST-1 to T cells.Methods:Used mouse anti-human CD54 McAb to screen phage display 15-mer peptide random library.After 4 round selections chose 20 clones at random and analyzed the DNA sequences.Used the phage contained conservative sequences to block that keratinocytes present superantigen TSST-1 to T cells.Results:The conservative amino acid sequence is ITRSFQSSMEPGPPG.The blocking effect of positive colonal phage is significantly stronger compared with that of wild type phage(P<0.01).Conclusion:ICAM-1 related small peptide could reduce skin inflammation mediated by superantigens.
, 百拇医药
Key words Phage display Superantigen Intercellular adhesion molecule-1 Toxic Shock syndrome toxin-1 Keratinocytes
细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一种表达于多种细胞表面的跨膜糖蛋白，是最早发现的免疫球蛋白的超家族粘附分子之一。通过与其相应的配体整合素家族成员之一的LFA-1相互作用，在介导细胞的信号转导与活化、炎症反应及创伤愈合等一系列重要的生理和病理过程中发挥重要作用[1]。正常情况下，人表皮角朊细胞(keratinocytes，KC)不表达ICAM-1，但在许多炎症性皮肤病病损处，KC可表达ICAM-1[2]，体外试验表明，经IFN-γ处理培养中的人类KC可表达MHC Ⅱ类分子及ICAM-1[3，4]；免疫组化研究表明表达ICAM-1r KCgn LFA-1阳性T细胞可同时集中于某一部位，表明ICAM-1在皮肤炎症过程中发挥着重要作用。因此，寻找一种ICAM-1的拮抗物来阻断ICAM-1-LFA-1介导的细胞粘附将有助于缓解炎症反应的发生。本文应用噬菌体展示技术(Phage display)钓取ICAM-1的相关序列并对其在KC辅助超抗原介导的T细胞增殖中的封闭效应进行了研究。
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1 材料与方法
1.1 材料 K91菌株，野生型噬菌体Fusel，测序引物均为美国密苏里大学Smiths博士惠赠；T7 DNA聚合酶测序试剂盒购自Promega公司，32P-dATP购自北京亚辉公司；鼠抗入CD54、HLA-DR单抗购自北京中山生物技术有限公司；TSST-1、人基因工程重组IFN-γ购自军事医学科学院。
1.2 噬菌体十五肽库的筛选[5] 链亲合素包被聚苯乙烯培养皿[5]，4℃过夜，2% BSA封闭37℃ 1 h，TBS洗3遍，加入生物素化抗ICAM-1抗体4℃过夜，次日洗去未结合的噬菌体，测滴度用于下一轮筛选。共进行4轮筛选，回收率稳定。
1.3 阳性克隆噬菌体单链的制备 取4轮筛选物测滴度，随机挑取40个单克隆经扩增、PEG沉淀回收噬菌体，200 μl TBS溶解测滴度，留100 μl备用，另100 μl经酚：氯仿/异戍醇抽提、乙醇沉淀后经琼脂糖电泳证实。
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1.4 阳性噬菌体克隆DNA序列分析 用Sanger双脱氧末端终止法对所提单链进行测序，测序方法参照Promega公司T7DNA聚合酶测序试剂盒说明书。电压2 200 V，预电泳30～40 min，正式电泳3～4 h。
1.5 含有保守序列的阳性克隆噬菌体的阻断活性检测
1.5.1 经尼龙毛柱法分离T淋巴细胞 流式细胞仪检测T细胞纯度为94.2%，台盼蓝排除试验，细胞活力在98%以上。调细胞浓度1×106/ml。
1.5.2 角朊细胞培养参照文献[6] 取培养1 w的角朊细胞经IFN-γ(500 U/ml)处理48 h，取少量细胞置Cytospin制片，应用免疫细胞化学染色法检测ICAM-1及HLA-DR，剩余细胞调成浓度1×106/ml备用。
1.5.3 经扩增的单克隆噬菌体及野生型噬菌体 Fusel经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌测滴度为1×107/ml备用。
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1.5.4 T细胞增殖阻断试验 于96孔细胞培养板内加入1×105/孔 IFN-γ处理的KC，加丝裂霉素(终浓度25 μg/ml)37℃水浴30 min后弃上清，实验组加入含保守序列的阳性克隆噬菌体，对照组加入空载体Fuse-1，共设106、105、104、103、0共5个梯度，最后各孔均加含TSST-1(终浓度10 μg/ml)的T淋巴细胞悬液100 μl(含1×105细胞)37℃ 5%CO2培养48 h后，用MTT法检测。
2 结 果
2.1 筛选及单链提取 经4轮筛选回收率稳定在10-5～10-6，所提单链DNA分子量位于9 000 bp(图1)。
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图1 阳性克隆单链DNA琼脂糖电泳
Fig.1 Electrophoretic analysis of positive phageclonal ssDNA
2.2 测序结果 共得到12个可读序列，保守序列为5’-ATTACTCGCAGTTTTGAGTCTAGTATGGAGCCTGGTCCGCCTGGT-3’(图2),经推断其氨基酸序列为Ile-Thr-Arg-Ser-Phe-Glu-Ser-Ser-Met-Glu-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly即ITRSFQSSMEPGPPG。
图2 阳性克隆的保守核苷酸序列
Fig.2 Conservative nucleotide sequence of positive phage clone
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2.3 KC表达HLA-DR及ICAM-1免疫细胞化学染色 结果表明IFN-γ处理的KC可表达HLA-DR分子及ICAM-1阳性反应细胞膜呈棕褐色物质沉着，而IFN-γ未处理的角朊细胞不着色(图3、图4)。
图3 免疫组织化学染色检测KC表达HLA-DR(A)和ICAM-1(B)
Fig.3 Observation of HlA-DR(A) or ICAM-1(B)expressed on the surface of KC;by immunohistochemistry staining
Note:a.IFN-γ-untreated KC；b.IFN-γ-treated KC
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图4 阳性克隆对KC递呈超抗原TSST-1给T细胞的阻断作用
Fig.4 The blocking effect of positive phage clone on kerationocytes which present superantigen TSST-1 to T cells
Note:①compared with wild type phage(P<0.01)
2.4 阻断试验 结果表明所筛选的克隆噬菌体在106及105滴度的情况下对KC辅佐超抗原活化T细胞增殖具有显著的阻断作用，而应用野生型噬菌体无此作用(P<0.01)，说明所筛选阳性克隆噬菌体所表达的短肽在此发挥了作用，尽管本实验未观察到阳性克隆噬菌体的最大封闭效应所具备的滴度，但在所设的滴度范围内，其封闭作用与噬菌体的滴度呈正比(图4)。
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3 讨 论
噬菌体展现技术(Phage display techniques， PDT)是由美国Smith博士于1985年首次提出并建立和发展起来的利用丝状噬菌体在体外表达外源基因的一项新技术，其要点是，以经过改建的噬菌体为载体，将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因P Ⅲ或P Ⅷ区，从而使表达的外源短肽或蛋白质表达在噬菌体表面，并使表达产物保持良好的空间构象并发挥良好的生物学活性，从噬菌体肽库中筛选目的短肽是研究蛋白质分子之间相互作用的一个有效工具[5，7]。根据上述原理我们利用鼠抗人ICAM-1 McAb从随机十五肽库中筛选出可与抗ICAM-1 McAb结合的噬菌体，从理论上讲，该噬菌体表面表达的随机小肽(十五肽)即为ICAM-序列中的某一段或与其高度同源的相关序列。近年来研究表明，在超抗原介导的炎症性皮肤疾病中，角朊细胞可以作为抗原递呈细胞，辅佐超抗原活化T淋巴细胞[8]，角朊细胞成为APC的前提条件是在IFN-γ作用下表达MHC Ⅱ类分子及ICAM-1，ICAM-1与T细胞表面的LFA-1相结合，LFA-1应用抗ICAM-1及单克隆抗体可以阻断二者的结合[9，10]。我们的实验结果表明IFN-γ处理的KC具有辅助超抗原TSST-1诱导T细胞增殖，进一步应用抗ICAM-1单抗筛选出的阳性克隆噬菌体具有阻断角朊细胞辅助超抗原TSST-1引起的T细胞增殖，推测所筛选的阳性克隆噬菌体表面表达的短肽可能与含有LFA-1结合有关的序列，因而可以与位于细胞表面的ICAM-1共同竞争与T细胞表面的LFA-1相结合，从而在一定程度上减少了ICAM-1-LFA-1介导的细胞粘附，即降低了角朊细胞递呈超抗原给T细胞时ICAM-1所提供的共刺激效应，在上述情况下，超抗原TSST-1不能或不足以引起T细胞的活化。由于对照组采用了不含外源插入基因的野生型噬菌体，从而保证了这种封闭效应是来源于插入小肽序列而非噬菌体本身。可以推测，根据已知序列人工合成ICAM-1相关的小分子肽可望成为缓解超抗原介导乃至其他免疫相关的皮肤炎症反应的一种新的手段。
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作者简介：张 明，男，34岁，博士研究生，主要从事细胞及分子免疫学研究，现在白求恩医科大学附属二院皮肤科T细胞增殖中的封闭效应进行了研究。
4 参考文献
1 金伯泉主编.细胞和分子免疫学.西安：世界图书出版公司.1995：31～61
2 Singer K H,Debbi T,Tuck B S et al.Epidermal keratinocytes express the adhesion molecule intercellular adhesion molecule-1 in inflammatory dermatoses.J Invest Dermatol.1989;92:746～750
3 Winiski A P,Foster C A.ICAM-1 expression in spontaneously transferred human keratinocyte cell line:Characterization by a single cell-ELISA assay.J Invest Dermatol，1992；99：48～52
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4 Basham T Y,Nickoloff B J,Meriagan T C et al.Recombinant gamma interferon induces HLA-DR expression on cultured human keratinocytes.J Invest Dermatol，1984;83:88～90
5 Stephen F P,Smith G P.Antibody-selectable filamontous of phagevectors:affinity purification of target genes.Gene.1988;73(2):305
6 Prinz J C,Grob B,Vollmer S et al.T cell clones from psoriasis skin lesions can promote keratinocyte proliferation in vitro via secreted products.Eur J Immuno,1994;24:593
, 百拇医药
7 鲍永利，富 宁，杨贵贞.噬菌体表达短肽模拟脂多糖类脂A表位的研究.中国免疫学杂志，1999；15(2)：593
8 Skov L,Baadsgaard O.Superantigens:Do they have a role in skin disease.Arch Dermatol,1995;131:829
9 Nickoloff B J,Mitra R S,Green J et al.Accessory cell frnction of keratinocy tes for superantigens.J Immunol,1993;150(6):2198
10 Strange P,Shov L,Bassdsgaard O.Interferon gamma-treated keratinocytes activate T cells in the presence of superantigens:Involvement of major histocompatibility comples class Ⅱ molecules.J Invest Dermaatol,1994;102:150
〔收稿日期：1999-05-20 修稿日期：1999-06-05〕, 百拇医药
单位：白求恩医科大学基础医学院免疫学教研室，长春130021
关键词：噬菌体展示技术；细胞间粘附分子-1；超抗原；中毒性休克综合征毒素-1；角朊细胞
中国免疫学杂志990907 摘 要 目的：探讨ICAM-1相关肽抑制角朊细胞将超抗原TSST-1递呈给T淋巴细胞。方法：应用鼠抗人CD54单克隆抗体筛选噬菌体随机十五肽库，经4轮筛选后，挑取20个克隆进行测序，利用含保守序列的阳性克隆噬菌体对角朊细胞递呈超抗原TSST-1给T细胞进行阻断试验。结果：得到保守序列为ITRSFQSSMEPGPPG，所筛选的阳性噬菌体克隆与野生型噬菌体相比具有明显的阻断效应(P<0.01)。结论：ICAM-1相关小分子肽可望降低超抗原介导的皮肤炎症反应。
中国图书号分类号 Q7 R392.12
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Inhibiting the co-stimulating effect of keratinocyte using ICAM-1 related peptide
ZHANG Ming,YANG Gui-Zhen.
Department of Immunology,Norman Bethune University of
Medical Sciences,Changchun 130021
Abstract Objective:To explore the inhibiting effect of ICAM-1 related sequences peptide on keratinocytes which present superantigen TSST-1 to T cells.Methods:Used mouse anti-human CD54 McAb to screen phage display 15-mer peptide random library.After 4 round selections chose 20 clones at random and analyzed the DNA sequences.Used the phage contained conservative sequences to block that keratinocytes present superantigen TSST-1 to T cells.Results:The conservative amino acid sequence is ITRSFQSSMEPGPPG.The blocking effect of positive colonal phage is significantly stronger compared with that of wild type phage(P<0.01).Conclusion:ICAM-1 related small peptide could reduce skin inflammation mediated by superantigens.
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Key words Phage display Superantigen Intercellular adhesion molecule-1 Toxic Shock syndrome toxin-1 Keratinocytes
细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一种表达于多种细胞表面的跨膜糖蛋白，是最早发现的免疫球蛋白的超家族粘附分子之一。通过与其相应的配体整合素家族成员之一的LFA-1相互作用，在介导细胞的信号转导与活化、炎症反应及创伤愈合等一系列重要的生理和病理过程中发挥重要作用[1]。正常情况下，人表皮角朊细胞(keratinocytes，KC)不表达ICAM-1，但在许多炎症性皮肤病病损处，KC可表达ICAM-1[2]，体外试验表明，经IFN-γ处理培养中的人类KC可表达MHC Ⅱ类分子及ICAM-1[3，4]；免疫组化研究表明表达ICAM-1r KCgn LFA-1阳性T细胞可同时集中于某一部位，表明ICAM-1在皮肤炎症过程中发挥着重要作用。因此，寻找一种ICAM-1的拮抗物来阻断ICAM-1-LFA-1介导的细胞粘附将有助于缓解炎症反应的发生。本文应用噬菌体展示技术(Phage display)钓取ICAM-1的相关序列并对其在KC辅助超抗原介导的T细胞增殖中的封闭效应进行了研究。
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1 材料与方法
1.1 材料 K91菌株，野生型噬菌体Fusel，测序引物均为美国密苏里大学Smiths博士惠赠；T7 DNA聚合酶测序试剂盒购自Promega公司，32P-dATP购自北京亚辉公司；鼠抗入CD54、HLA-DR单抗购自北京中山生物技术有限公司；TSST-1、人基因工程重组IFN-γ购自军事医学科学院。
1.2 噬菌体十五肽库的筛选[5] 链亲合素包被聚苯乙烯培养皿[5]，4℃过夜，2% BSA封闭37℃ 1 h，TBS洗3遍，加入生物素化抗ICAM-1抗体4℃过夜，次日洗去未结合的噬菌体，测滴度用于下一轮筛选。共进行4轮筛选，回收率稳定。
1.3 阳性克隆噬菌体单链的制备 取4轮筛选物测滴度，随机挑取40个单克隆经扩增、PEG沉淀回收噬菌体，200 μl TBS溶解测滴度，留100 μl备用，另100 μl经酚：氯仿/异戍醇抽提、乙醇沉淀后经琼脂糖电泳证实。
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1.4 阳性噬菌体克隆DNA序列分析 用Sanger双脱氧末端终止法对所提单链进行测序，测序方法参照Promega公司T7DNA聚合酶测序试剂盒说明书。电压2 200 V，预电泳30～40 min，正式电泳3～4 h。
1.5 含有保守序列的阳性克隆噬菌体的阻断活性检测
1.5.1 经尼龙毛柱法分离T淋巴细胞 流式细胞仪检测T细胞纯度为94.2%，台盼蓝排除试验，细胞活力在98%以上。调细胞浓度1×106/ml。
1.5.2 角朊细胞培养参照文献[6] 取培养1 w的角朊细胞经IFN-γ(500 U/ml)处理48 h，取少量细胞置Cytospin制片，应用免疫细胞化学染色法检测ICAM-1及HLA-DR，剩余细胞调成浓度1×106/ml备用。
1.5.3 经扩增的单克隆噬菌体及野生型噬菌体 Fusel经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌测滴度为1×107/ml备用。
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1.5.4 T细胞增殖阻断试验 于96孔细胞培养板内加入1×105/孔 IFN-γ处理的KC，加丝裂霉素(终浓度25 μg/ml)37℃水浴30 min后弃上清，实验组加入含保守序列的阳性克隆噬菌体，对照组加入空载体Fuse-1，共设106、105、104、103、0共5个梯度，最后各孔均加含TSST-1(终浓度10 μg/ml)的T淋巴细胞悬液100 μl(含1×105细胞)37℃ 5%CO2培养48 h后，用MTT法检测。
2 结 果
2.1 筛选及单链提取 经4轮筛选回收率稳定在10-5～10-6，所提单链DNA分子量位于9 000 bp(图1)。
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图1 阳性克隆单链DNA琼脂糖电泳
Fig.1 Electrophoretic analysis of positive phageclonal ssDNA
2.2 测序结果 共得到12个可读序列，保守序列为5’-ATTACTCGCAGTTTTGAGTCTAGTATGGAGCCTGGTCCGCCTGGT-3’(图2),经推断其氨基酸序列为Ile-Thr-Arg-Ser-Phe-Glu-Ser-Ser-Met-Glu-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly即ITRSFQSSMEPGPPG。
图2 阳性克隆的保守核苷酸序列
Fig.2 Conservative nucleotide sequence of positive phage clone
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2.3 KC表达HLA-DR及ICAM-1免疫细胞化学染色 结果表明IFN-γ处理的KC可表达HLA-DR分子及ICAM-1阳性反应细胞膜呈棕褐色物质沉着，而IFN-γ未处理的角朊细胞不着色(图3、图4)。
图3 免疫组织化学染色检测KC表达HLA-DR(A)和ICAM-1(B)
Fig.3 Observation of HlA-DR(A) or ICAM-1(B)expressed on the surface of KC;by immunohistochemistry staining
Note:a.IFN-γ-untreated KC；b.IFN-γ-treated KC
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图4 阳性克隆对KC递呈超抗原TSST-1给T细胞的阻断作用
Fig.4 The blocking effect of positive phage clone on kerationocytes which present superantigen TSST-1 to T cells
Note:①compared with wild type phage(P<0.01)
2.4 阻断试验 结果表明所筛选的克隆噬菌体在106及105滴度的情况下对KC辅佐超抗原活化T细胞增殖具有显著的阻断作用，而应用野生型噬菌体无此作用(P<0.01)，说明所筛选阳性克隆噬菌体所表达的短肽在此发挥了作用，尽管本实验未观察到阳性克隆噬菌体的最大封闭效应所具备的滴度，但在所设的滴度范围内，其封闭作用与噬菌体的滴度呈正比(图4)。
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3 讨 论
噬菌体展现技术(Phage display techniques， PDT)是由美国Smith博士于1985年首次提出并建立和发展起来的利用丝状噬菌体在体外表达外源基因的一项新技术，其要点是，以经过改建的噬菌体为载体，将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因P Ⅲ或P Ⅷ区，从而使表达的外源短肽或蛋白质表达在噬菌体表面，并使表达产物保持良好的空间构象并发挥良好的生物学活性，从噬菌体肽库中筛选目的短肽是研究蛋白质分子之间相互作用的一个有效工具[5，7]。根据上述原理我们利用鼠抗人ICAM-1 McAb从随机十五肽库中筛选出可与抗ICAM-1 McAb结合的噬菌体，从理论上讲，该噬菌体表面表达的随机小肽(十五肽)即为ICAM-序列中的某一段或与其高度同源的相关序列。近年来研究表明，在超抗原介导的炎症性皮肤疾病中，角朊细胞可以作为抗原递呈细胞，辅佐超抗原活化T淋巴细胞[8]，角朊细胞成为APC的前提条件是在IFN-γ作用下表达MHC Ⅱ类分子及ICAM-1，ICAM-1与T细胞表面的LFA-1相结合，LFA-1应用抗ICAM-1及单克隆抗体可以阻断二者的结合[9，10]。我们的实验结果表明IFN-γ处理的KC具有辅助超抗原TSST-1诱导T细胞增殖，进一步应用抗ICAM-1单抗筛选出的阳性克隆噬菌体具有阻断角朊细胞辅助超抗原TSST-1引起的T细胞增殖，推测所筛选的阳性克隆噬菌体表面表达的短肽可能与含有LFA-1结合有关的序列，因而可以与位于细胞表面的ICAM-1共同竞争与T细胞表面的LFA-1相结合，从而在一定程度上减少了ICAM-1-LFA-1介导的细胞粘附，即降低了角朊细胞递呈超抗原给T细胞时ICAM-1所提供的共刺激效应，在上述情况下，超抗原TSST-1不能或不足以引起T细胞的活化。由于对照组采用了不含外源插入基因的野生型噬菌体，从而保证了这种封闭效应是来源于插入小肽序列而非噬菌体本身。可以推测，根据已知序列人工合成ICAM-1相关的小分子肽可望成为缓解超抗原介导乃至其他免疫相关的皮肤炎症反应的一种新的手段。
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作者简介：张 明，男，34岁，博士研究生，主要从事细胞及分子免疫学研究，现在白求恩医科大学附属二院皮肤科T细胞增殖中的封闭效应进行了研究。
4 参考文献
1 金伯泉主编.细胞和分子免疫学.西安：世界图书出版公司.1995：31～61
2 Singer K H,Debbi T,Tuck B S et al.Epidermal keratinocytes express the adhesion molecule intercellular adhesion molecule-1 in inflammatory dermatoses.J Invest Dermatol.1989;92:746～750
3 Winiski A P,Foster C A.ICAM-1 expression in spontaneously transferred human keratinocyte cell line:Characterization by a single cell-ELISA assay.J Invest Dermatol，1992；99：48～52
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4 Basham T Y,Nickoloff B J,Meriagan T C et al.Recombinant gamma interferon induces HLA-DR expression on cultured human keratinocytes.J Invest Dermatol，1984;83:88～90
5 Stephen F P,Smith G P.Antibody-selectable filamontous of phagevectors:affinity purification of target genes.Gene.1988;73(2):305
6 Prinz J C,Grob B,Vollmer S et al.T cell clones from psoriasis skin lesions can promote keratinocyte proliferation in vitro via secreted products.Eur J Immuno,1994;24:593
, 百拇医药
7 鲍永利，富 宁，杨贵贞.噬菌体表达短肽模拟脂多糖类脂A表位的研究.中国免疫学杂志，1999；15(2)：593
8 Skov L,Baadsgaard O.Superantigens:Do they have a role in skin disease.Arch Dermatol,1995;131:829
9 Nickoloff B J,Mitra R S,Green J et al.Accessory cell frnction of keratinocy tes for superantigens.J Immunol,1993;150(6):2198
10 Strange P,Shov L,Bassdsgaard O.Interferon gamma-treated keratinocytes activate T cells in the presence of superantigens:Involvement of major histocompatibility comples class Ⅱ molecules.J Invest Dermaatol,1994;102:150
〔收稿日期：1999-05-20 修稿日期：1999-06-05〕, 百拇医药