创伤性轴索损伤中细胞骨架的研究进展
作者：张相彤 武俏丽 戴钦舜 刘恩重
单位：张相彤(哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科，黑龙江 哈尔滨 150001)； 武俏丽(哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科，黑龙江 哈尔滨 150001)； 戴钦舜(哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科，黑龙江 哈尔滨 150001)； 刘恩重(哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科，黑龙江 哈尔滨 150001)
关键词：创伤性；轴索损伤；细胞骨架
哈尔滨医科大学学报000137 分类号：R651.1+5 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0077-02▲
轴索损伤是创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)一个共同特征[1]。传统观念认为脑创伤同时撕裂轴索，使之收缩或排出轴浆形成反应性轴索肿胀，称为收缩球(retraction ball)。最近的研究表明在大多数轴索损伤中，轴索断裂不是立即发生，而是一个延迟过程，大约伤后4～24h之间发生。这个过程被称为继发性轴索断裂(secondary axotomy)，是轴索损伤的主要形式。目前对这一过程病理机制尚不清楚。有人认为是局部轴膜功能障碍导致离子内流，激发轴浆细胞骨架降解是关键所在，也有人认为创伤直接引起轴索内细胞骨架损伤，从而使轴浆运输障碍。因此本文着重介绍目前对微管(microtubule)、神经微丝(neurofilament,NF)在轴索损伤中的研究进展，同时对轴索损伤可能机制进行探讨，以便寻找轴索损伤治疗策略。
, 百拇医药
1 轴索的结构与功能
轴索形态决定轴索功能，轴索形态大小直接取决于细胞骨架系统。轴索的细胞骨架是由微管、神经微丝及连同轴索质膜下的带状微丝网一起构成。微管为轴内运输提供通道；微丝主要协助膜蛋白定位；神经微丝决定轴索直径和强度。轴浆运输是由膜性囊泡(membranous vesicle)来完成，沿着有极性的微管进行。可见这一骨架网络与轴索形态的维持和轴浆运输有密切关系[2]。
2 微管
最近人们获得创伤性轴索损伤后轴索内微管丧失的形态学依据，同时发现在正常对照组微管数量超过神经微丝，其比例为3∶1[3]。在猫的轴索损伤模型中，微管丧失可延至伤后6h。而在荷兰猪视神经损伤模型中[6]，Ranvier结节处微管丧失最显著，并可延至伤后24h。若损伤程度较轻，示踪剂并没有显示轴膜通透性改变，且无微管丧失，只是排列紊乱。Maxwell认为轴索内微管丧失与轴索损伤后Ca2+内流有关[4]。轴索内Ca2+浓度升高既可阻止微管组装，又引起其在形成多聚体前迅速降解。Imaizumi在轴索损伤模型中发现轴浆内Ca2+增多[5]，有力支持创伤后Ca2+内流这一假说。可见微管丧失必然导致轴浆膜性囊泡快速运输障碍，从而加剧特征性轴索肿胀，形成Ranvier结节。
, 百拇医药
3 神经微丝
神经微丝在继发性轴索损伤中研究结果表明，轻中度创伤后轴索局部神经微丝和微管排列紊乱，但没有微管丧失[4，6]。而中重度创伤有致密区出现，也就是相邻神经微丝之间空间缩小，从而导致轴浆内神经微丝密度增加[7]。当 前越来越多实验结果证实这一变化，且减少空间范围变化很大[9]。这可能因为不同大小轴索，对不同牵拉反应方式不同，也可能因为神经微丝之间具体生化联系不同或在不同大小轴索内神经微丝数目不同。神经微丝致密(neurofilament compaction)形成发生在伤后5min内，可持续6h[8]。然而目前并没有观察到继发性轴索损伤这种致密形成的预后结果。这种神经微丝致密可能与轴膜典型内陷、髓鞘脱离、轴周围间隙形成也有一定关系。然而令人惊奇的是神经微丝改变在伤后5min～6h之间并没有变化，而伤后6～24h后可检测出已降解的神经微丝[9]。
, 百拇医药
有关神经微丝空间改变的机制目前仅仅是推测。在荷兰猪视神经牵拉伤实验中发现轴膜Ca-ATPase活性改变和Ca2+内流，并认为神经微丝致密位置与轴膜障碍密切相关。轴浆Ca2+升高可以激活calpain(μmol/L calpain and mmol/L calpain)[10]，μmol/L calpain激活可以导致145kb神经微丝蛋白翻译减少，因此，μmol/L calpain只涉及到轴索内神经微丝网状轮廓形成，而不涉及神经微丝降解；另一方面mmol/L calpain激活需要至少0.2mmol/L Ca2+浓度[11]，在这种情况下神经微丝降解丧失才可观察到。伤后应用calpain抑制剂明显减轻神经微丝(HF-L)丧失[10]。可见离子内稳态失衡引起神经微丝侧臂(neurofilament sidearm)丢失和神经微丝致密形成。Povlishok应用Ca2+清除剂BAPTA-AM，没有证明其对神经微丝改变起任何明显作用。侧臂丢失并不是神经微丝致密形成唯一机制。正常轴索内神经微丝侧臂是由磷酸化的NF-M和NF-H的细胞末端形成的[13]。这种状态处于磷酸酶(phosphatase)和蛋白激酶(protein kinase,PK)的相互作用动态平衡中。当去磷酸化时导致神经微丝塌陷[14]。因此，可以推测：①创伤后神经微丝致密形成是由于蛋白激酶和磷酸酶相互的改变，从而引起去磷酸化所致。机械性所致侧臂塌陷的神经微丝改变还没有确定。②轴索内Ca+水平升高，从而使μmol/L calpain激活导致神经微丝侧臂降解。③当轴索内Ca2+升高激活mmol/L calpain时，神经微丝整体蛋白分解，而这很可能是轴膜完整性丧失所致。
, http://www.100md.com
4 轴索断裂
无论在人类还是在动物模型中均有确凿证据支持继发性轴索损伤在其长轴某一局部发生轴索断裂这一观点。有关轴索断裂快速过程的解释也只取决于显微镜照像的收集[3，6，15]。轴索损伤后局部性管径调节功能丧失，轴索渐进性膨大，在肿胀部分内收缩，并形成小分叶状(lobulated swelling)，从而导致进侧端肿胀形成，从远侧端分离，最终形成收缩球。目前任何轴索损伤动物模型中还没有提供详细解释来证明在分叶状膨胀中轴索狭窄处什么时候形成和断裂。很显然，这个过程不是轴索迅速破裂和再愈合，就是轴膜的一小部分融合，从而导致轴索肿胀的两部分机械性分离，形成轴索球。在脊椎动物轴索损伤研究中证实[16]，牵断轴索5～40min之间轴膜可再愈合，而这种轴膜再愈合有温度依赖性，且不受细胞骨架的影响，特别准许Ca2+进入轴浆内，从而磷脂酶A2(PLA2)的激活对轴膜再愈合起关键性作用。这种再愈合局部活动并不依赖于胞体，因此，异常膜再愈合很可能通过受伤且断裂轴膜脂质双层融合形成。
, 百拇医药
综上所述，我们可以做出以下结论：①除GCS低分者外，许多轴索断裂也可发生在脑创伤受损神经纤维。②脑挫裂伤存在轴索受损及创伤早期轴索断裂。③所有受伤轴索形成肿胀在伤后4～24h内。④轴索断裂反应是由于离子内稳态失调所激发，轴索内Ca2+积聚是离子内稳态失调主要成份，Ca2+积聚升高是轴膜的Ca-ATPase活性改变的结果[17]。因此我们认为轴索断裂的关键启动因素是轴膜及细胞骨架完整性破坏，从而使其功能改变。⑤整个轴索细胞骨架创伤后迅速分解这一假说是错误的。轴浆微管迅速丢失及神经微丝侧臂的丢失，破坏正常相邻神经微丝之间关系，而神经微丝直到伤后6h仍保持其纤维状结构。⑥人类创伤性轴索损伤中，轻度创伤能诱导继发性轴索损伤，导致延迟性轴索断裂，只表现为神经微丝排列紊乱，这种排列紊乱可能与轴浆运输障碍有关。中重度创伤微管丧失，神经微丝致密形成。⑦继发性轴索损伤病理过程发展需数小时，这为我们治疗提供可能性。一旦我们更好了解创伤性轴索损伤机制，可使其减轻病理损害，改善预后。■
, 百拇医药
作者简介：张相彤(1967-)，男，主治医师，博士
参考文献：
[1]Zemlan FP,Rosenberg WS,Luebbe PA,et al.Quantification of axonal damage in traumatic brain injury:affinity purification and characterization of cerebrospinal fluid tau protein[J].J Neurochem,1999,72(2):241.
[2]Hisanaga S,Gonada Y,Inagaki M,et al.Effect of phosphrylation of the neurofilament protein on filamentous structures[J].Cell Reg,1990,1:237.
, 百拇医药
[3]Maxwell WL,Povlishock JT,Graham DL,et al.A mechanistic analysis of nondisruptive axonal injury[J].J Neurotrauma,1997,14(7):419.
[4]Maxwell W,Graham DI.Loss of axonal microtubules and neurofilaments after stuetch-injury to guinea pig optic nerve fibers[J].J Neurotrauma,1997,14(9):603.
[5]Imaizumi T,Kocsis JD,Waxman SG,et al.The role of voltage-gated Ca2+ channels in anoxic injury of spinal cord whiter matter[J].Brain Res,1999,817(1-2):84.
, 百拇医药
[6]Jafari SS,Nielson M,Graham DI,et al.Axonal cytoskeletal changes after nondisruptive axonal injury.Ⅱ.Intermediate sized axons[J].J Neurotrauma,1998,15(11):955.
[7]Okonkwo DD,Pettus EH,Moroi J,et al.Alteration of the neurofilament sidearm and its relation to neurofilament compaction occurring with traumatic axonal injury[J].Brain Res,1998,784(1-2):1.
[8]Pettus EH,Povlishock JT.Characterisation of a distinct set of intra-axonal ultrastructural changes associated with traumatically induced alteration in axolemmal permeability[J].Brain Res,1996,722:1.
, http://www.100md.com
[9]Kanayama G,Takeda M,Morihara T,et al.Temporal and regional profiles of cytoskeletal protein accumulation in the rat brain following traumatic brain injury[J].Psychiatry Clin Neurosci,1997,51(3):157.
[10]Ziv NE,Spira ME.Induction of growth cone formation by transient and localized increases of intracellular proteolytic activity[J].J Cell Biol,1998,140(1):223.
[11]Glass JD,Schryer BL,Griffin JW,et al.Calcium-mediated degeneration of the axonal cytoskeleton in the ola mouse[J].J Neurochem,1994,62:2472.
, http://www.100md.com
[12]Posmantur R,Kampfl A,Siman R,et al.A calpain inhibitor attenuates cortical protein loss after experimental traumatic brain injury in the rat[J].Neuroscience,1997,77(3):875.
[13]Povlishock JT,Pettus EH.Traumatically induced axonal damage:evidence for enduring changes in axolemmal permeability with associated cytoskeletal change[J].Acta Neurochir,1996[suppl],66:81.
[14]Hall GF,Kosik KS.Axotomy-induced neurofilament phosphorylation is inhibited in situ by microinjection of PKA and PKC inhibitor into identified lamprey neurons[J].Neuron,1993,10:613.
, 百拇医药
[15]Jafari SS,Maxwell WL,Neilson M,et al.Axonal cytoskeletal changes after non-disruptive axonal injury[J].J Neurocytol,1997,26:207.
[16]Eddleman CS,Ballinger ML,Smyers ME,et al.Endocytotic formation of vesicle and other membranous structures induced by Ca2+ and axolemmal injury[J].J Neurosci,1998,18:4029.
[17]Maxwell WL,Mcrwath BJ.Cytochemical evidence for redistributin of membrane pump calcium-ATPase and ecto Ca2+-ATP activity and calcium influx in myelinated nerve fibres of the optic nerve after stretch injury[J].J Neurocytol,1995,24:925.
收稿日期：1999-03-31, http://www.100md.com
单位：张相彤(哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科，黑龙江 哈尔滨 150001)； 武俏丽(哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科，黑龙江 哈尔滨 150001)； 戴钦舜(哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科，黑龙江 哈尔滨 150001)； 刘恩重(哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科，黑龙江 哈尔滨 150001)
关键词：创伤性；轴索损伤；细胞骨架
哈尔滨医科大学学报000137 分类号：R651.1+5 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0077-02▲
轴索损伤是创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)一个共同特征[1]。传统观念认为脑创伤同时撕裂轴索，使之收缩或排出轴浆形成反应性轴索肿胀，称为收缩球(retraction ball)。最近的研究表明在大多数轴索损伤中，轴索断裂不是立即发生，而是一个延迟过程，大约伤后4～24h之间发生。这个过程被称为继发性轴索断裂(secondary axotomy)，是轴索损伤的主要形式。目前对这一过程病理机制尚不清楚。有人认为是局部轴膜功能障碍导致离子内流，激发轴浆细胞骨架降解是关键所在，也有人认为创伤直接引起轴索内细胞骨架损伤，从而使轴浆运输障碍。因此本文着重介绍目前对微管(microtubule)、神经微丝(neurofilament,NF)在轴索损伤中的研究进展，同时对轴索损伤可能机制进行探讨，以便寻找轴索损伤治疗策略。
, 百拇医药
1 轴索的结构与功能
轴索形态决定轴索功能，轴索形态大小直接取决于细胞骨架系统。轴索的细胞骨架是由微管、神经微丝及连同轴索质膜下的带状微丝网一起构成。微管为轴内运输提供通道；微丝主要协助膜蛋白定位；神经微丝决定轴索直径和强度。轴浆运输是由膜性囊泡(membranous vesicle)来完成，沿着有极性的微管进行。可见这一骨架网络与轴索形态的维持和轴浆运输有密切关系[2]。
2 微管
最近人们获得创伤性轴索损伤后轴索内微管丧失的形态学依据，同时发现在正常对照组微管数量超过神经微丝，其比例为3∶1[3]。在猫的轴索损伤模型中，微管丧失可延至伤后6h。而在荷兰猪视神经损伤模型中[6]，Ranvier结节处微管丧失最显著，并可延至伤后24h。若损伤程度较轻，示踪剂并没有显示轴膜通透性改变，且无微管丧失，只是排列紊乱。Maxwell认为轴索内微管丧失与轴索损伤后Ca2+内流有关[4]。轴索内Ca2+浓度升高既可阻止微管组装，又引起其在形成多聚体前迅速降解。Imaizumi在轴索损伤模型中发现轴浆内Ca2+增多[5]，有力支持创伤后Ca2+内流这一假说。可见微管丧失必然导致轴浆膜性囊泡快速运输障碍，从而加剧特征性轴索肿胀，形成Ranvier结节。
, 百拇医药
3 神经微丝
神经微丝在继发性轴索损伤中研究结果表明，轻中度创伤后轴索局部神经微丝和微管排列紊乱，但没有微管丧失[4，6]。而中重度创伤有致密区出现，也就是相邻神经微丝之间空间缩小，从而导致轴浆内神经微丝密度增加[7]。当 前越来越多实验结果证实这一变化，且减少空间范围变化很大[9]。这可能因为不同大小轴索，对不同牵拉反应方式不同，也可能因为神经微丝之间具体生化联系不同或在不同大小轴索内神经微丝数目不同。神经微丝致密(neurofilament compaction)形成发生在伤后5min内，可持续6h[8]。然而目前并没有观察到继发性轴索损伤这种致密形成的预后结果。这种神经微丝致密可能与轴膜典型内陷、髓鞘脱离、轴周围间隙形成也有一定关系。然而令人惊奇的是神经微丝改变在伤后5min～6h之间并没有变化，而伤后6～24h后可检测出已降解的神经微丝[9]。
, 百拇医药
有关神经微丝空间改变的机制目前仅仅是推测。在荷兰猪视神经牵拉伤实验中发现轴膜Ca-ATPase活性改变和Ca2+内流，并认为神经微丝致密位置与轴膜障碍密切相关。轴浆Ca2+升高可以激活calpain(μmol/L calpain and mmol/L calpain)[10]，μmol/L calpain激活可以导致145kb神经微丝蛋白翻译减少，因此，μmol/L calpain只涉及到轴索内神经微丝网状轮廓形成，而不涉及神经微丝降解；另一方面mmol/L calpain激活需要至少0.2mmol/L Ca2+浓度[11]，在这种情况下神经微丝降解丧失才可观察到。伤后应用calpain抑制剂明显减轻神经微丝(HF-L)丧失[10]。可见离子内稳态失衡引起神经微丝侧臂(neurofilament sidearm)丢失和神经微丝致密形成。Povlishok应用Ca2+清除剂BAPTA-AM，没有证明其对神经微丝改变起任何明显作用。侧臂丢失并不是神经微丝致密形成唯一机制。正常轴索内神经微丝侧臂是由磷酸化的NF-M和NF-H的细胞末端形成的[13]。这种状态处于磷酸酶(phosphatase)和蛋白激酶(protein kinase,PK)的相互作用动态平衡中。当去磷酸化时导致神经微丝塌陷[14]。因此，可以推测：①创伤后神经微丝致密形成是由于蛋白激酶和磷酸酶相互的改变，从而引起去磷酸化所致。机械性所致侧臂塌陷的神经微丝改变还没有确定。②轴索内Ca+水平升高，从而使μmol/L calpain激活导致神经微丝侧臂降解。③当轴索内Ca2+升高激活mmol/L calpain时，神经微丝整体蛋白分解，而这很可能是轴膜完整性丧失所致。
, http://www.100md.com
4 轴索断裂
无论在人类还是在动物模型中均有确凿证据支持继发性轴索损伤在其长轴某一局部发生轴索断裂这一观点。有关轴索断裂快速过程的解释也只取决于显微镜照像的收集[3，6，15]。轴索损伤后局部性管径调节功能丧失，轴索渐进性膨大，在肿胀部分内收缩，并形成小分叶状(lobulated swelling)，从而导致进侧端肿胀形成，从远侧端分离，最终形成收缩球。目前任何轴索损伤动物模型中还没有提供详细解释来证明在分叶状膨胀中轴索狭窄处什么时候形成和断裂。很显然，这个过程不是轴索迅速破裂和再愈合，就是轴膜的一小部分融合，从而导致轴索肿胀的两部分机械性分离，形成轴索球。在脊椎动物轴索损伤研究中证实[16]，牵断轴索5～40min之间轴膜可再愈合，而这种轴膜再愈合有温度依赖性，且不受细胞骨架的影响，特别准许Ca2+进入轴浆内，从而磷脂酶A2(PLA2)的激活对轴膜再愈合起关键性作用。这种再愈合局部活动并不依赖于胞体，因此，异常膜再愈合很可能通过受伤且断裂轴膜脂质双层融合形成。
, 百拇医药
综上所述，我们可以做出以下结论：①除GCS低分者外，许多轴索断裂也可发生在脑创伤受损神经纤维。②脑挫裂伤存在轴索受损及创伤早期轴索断裂。③所有受伤轴索形成肿胀在伤后4～24h内。④轴索断裂反应是由于离子内稳态失调所激发，轴索内Ca2+积聚是离子内稳态失调主要成份，Ca2+积聚升高是轴膜的Ca-ATPase活性改变的结果[17]。因此我们认为轴索断裂的关键启动因素是轴膜及细胞骨架完整性破坏，从而使其功能改变。⑤整个轴索细胞骨架创伤后迅速分解这一假说是错误的。轴浆微管迅速丢失及神经微丝侧臂的丢失，破坏正常相邻神经微丝之间关系，而神经微丝直到伤后6h仍保持其纤维状结构。⑥人类创伤性轴索损伤中，轻度创伤能诱导继发性轴索损伤，导致延迟性轴索断裂，只表现为神经微丝排列紊乱，这种排列紊乱可能与轴浆运输障碍有关。中重度创伤微管丧失，神经微丝致密形成。⑦继发性轴索损伤病理过程发展需数小时，这为我们治疗提供可能性。一旦我们更好了解创伤性轴索损伤机制，可使其减轻病理损害，改善预后。■
, 百拇医药
作者简介：张相彤(1967-)，男，主治医师，博士
参考文献：
[1]Zemlan FP,Rosenberg WS,Luebbe PA,et al.Quantification of axonal damage in traumatic brain injury:affinity purification and characterization of cerebrospinal fluid tau protein[J].J Neurochem,1999,72(2):241.
[2]Hisanaga S,Gonada Y,Inagaki M,et al.Effect of phosphrylation of the neurofilament protein on filamentous structures[J].Cell Reg,1990,1:237.
, 百拇医药
[3]Maxwell WL,Povlishock JT,Graham DL,et al.A mechanistic analysis of nondisruptive axonal injury[J].J Neurotrauma,1997,14(7):419.
[4]Maxwell W,Graham DI.Loss of axonal microtubules and neurofilaments after stuetch-injury to guinea pig optic nerve fibers[J].J Neurotrauma,1997,14(9):603.
[5]Imaizumi T,Kocsis JD,Waxman SG,et al.The role of voltage-gated Ca2+ channels in anoxic injury of spinal cord whiter matter[J].Brain Res,1999,817(1-2):84.
, 百拇医药
[6]Jafari SS,Nielson M,Graham DI,et al.Axonal cytoskeletal changes after nondisruptive axonal injury.Ⅱ.Intermediate sized axons[J].J Neurotrauma,1998,15(11):955.
[7]Okonkwo DD,Pettus EH,Moroi J,et al.Alteration of the neurofilament sidearm and its relation to neurofilament compaction occurring with traumatic axonal injury[J].Brain Res,1998,784(1-2):1.
[8]Pettus EH,Povlishock JT.Characterisation of a distinct set of intra-axonal ultrastructural changes associated with traumatically induced alteration in axolemmal permeability[J].Brain Res,1996,722:1.
, http://www.100md.com
[9]Kanayama G,Takeda M,Morihara T,et al.Temporal and regional profiles of cytoskeletal protein accumulation in the rat brain following traumatic brain injury[J].Psychiatry Clin Neurosci,1997,51(3):157.
[10]Ziv NE,Spira ME.Induction of growth cone formation by transient and localized increases of intracellular proteolytic activity[J].J Cell Biol,1998,140(1):223.
[11]Glass JD,Schryer BL,Griffin JW,et al.Calcium-mediated degeneration of the axonal cytoskeleton in the ola mouse[J].J Neurochem,1994,62:2472.
, http://www.100md.com
[12]Posmantur R,Kampfl A,Siman R,et al.A calpain inhibitor attenuates cortical protein loss after experimental traumatic brain injury in the rat[J].Neuroscience,1997,77(3):875.
[13]Povlishock JT,Pettus EH.Traumatically induced axonal damage:evidence for enduring changes in axolemmal permeability with associated cytoskeletal change[J].Acta Neurochir,1996[suppl],66:81.
[14]Hall GF,Kosik KS.Axotomy-induced neurofilament phosphorylation is inhibited in situ by microinjection of PKA and PKC inhibitor into identified lamprey neurons[J].Neuron,1993,10:613.
, 百拇医药
[15]Jafari SS,Maxwell WL,Neilson M,et al.Axonal cytoskeletal changes after non-disruptive axonal injury[J].J Neurocytol,1997,26:207.
[16]Eddleman CS,Ballinger ML,Smyers ME,et al.Endocytotic formation of vesicle and other membranous structures induced by Ca2+ and axolemmal injury[J].J Neurosci,1998,18:4029.
[17]Maxwell WL,Mcrwath BJ.Cytochemical evidence for redistributin of membrane pump calcium-ATPase and ecto Ca2+-ATP activity and calcium influx in myelinated nerve fibres of the optic nerve after stretch injury[J].J Neurocytol,1995,24:925.
收稿日期：1999-03-31, http://www.100md.com