雌激素对老年雄性大鼠植入骨新骨形成的影响
作者：张聪 林嘉滨 金燕宁 汪耀 金世鑫 朱建民 William E. Huffer
单位：林嘉滨(卫生部北京医院内科 100730)；金燕宁(卫生部北京医院内科 100730)；汪耀(卫生部北京医院内科 100730)；金世鑫(卫生部北京医院内科 100730)；张聪(现在中日友好医院肾内科，北京，100029)；朱建民(美国Colorado大学医学中心代谢性骨病研究室)；William E.Huffer(美国Colorado大学医学中心代谢性骨病研究室)
关键词：性激素类；骨和骨组织
中华内科杂志001011 【摘要】 目的 研究雌激素对老年雄性哺乳动物的植入骨的新生骨骨面积及对全身骨代谢的影响。 方法 骨基质骨片植入老年雄性大鼠，观察注射雌激素组、雄激素组和对照组骨组织计量学、骨生物力学、尿脱氧吡啶啉/肌酐(Dpd/Cr)比值，以及血和尿的钙、磷等的变化。 结果(1)新生骨骨面积：雌激素组和雄激素组均比对照组明显增高(P<0.05)，雌激素组和雄激素组之间差异无显著性。(2)破骨细胞数：雌激素组(55±3) 个/ mm2和雄激素组(53±3)个/ mm2均显著高于对照组(40±3)个/mm2(P≤0.002)，雌激素组和雄激素组之间差异无显著性。(3)尿Dpd/Cr 比值(mmol/mol)：注药后5周，对照组(注射溶剂)比注药前明显升高(198±20 vs 104±7)，雌激素组(114±16)和雄激素组(118±19)均比对照组(198±20)明显减低，与注药前无明显差异，雌激素和雄激素组之间差异无显著性。 结论 雌激素和雄激素不仅能刺激老年雄性大白鼠植入骨的新生骨骨面积增加，也能抑制全身骨骼的骨吸收速率。本实验条件下，这两方面的影响，雌激素和雄激素组之间未见明显差异。
, 百拇医药
The effect of estrogen on new bone formation in the implanted bone matrix in aged male rats
ZHANG Cong LIN Jiabin JIN Yanning
(Department of Nephrology, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029)
JIN Shixin
(Department of Endocrinology, Beijing Hospital, Beijing 100730，China)
【Abstract】 Objective To study the effect of estrogen on new bone formation in the implanted bone matrix in aged male rats and on general bone metabolism. Methods The aged male rats were implanted with slices of bone matrix and subcutenously injected with estrogen, androgen or the solvent for five weeks. The changes in bone histomorphometry, bio-mechanical parameters and urine deoxypyridinoline (Dpd) levels were observed as indexes of bone reabsorption. Calcium, organic phosphate, and alkalphophatase levels in serum and urine were also studied. Results (1) The areas of new bone formation were significantly larger in estrogen and androgen groups than in the control but without difference between estrogen and androgen groups. (2) The number of osteoclasts was higher in estrogen and androgen groups than in the control (P≤0.002) but without difference between estrogen and androgen groups. (3) Urine Dpd/Cr ratio was lower in estrogen and androgen groups than in the control and higher in the control than that obtained 5 weeks ago but without difference between estrogen and androgen groups. Conclusion Estrogen and androgen are able to stimulate new bone formation in the implanted bone matrix and inhibit the reabsorption rate of systemic bones in aged male rats, but there was no difference between estrogen and androgen in these two respects under the conditions of this experiment.
, 百拇医药
【Key words】 Sex hormones; Bone and bones
近年发现, 雌激素对雄性哺乳动物的骨代谢有重要影响，有时起主导作用。有报道由雌激素受体基因突变而引起的男性骨质疏松患者，补充雌激素不见骨密度改善[1]。但由芳香化酶基因突变所致的男性骨质疏松(雌激素减少引起)者，补充雌激素则疗效显著[2]。也有老年男性骨折组患者血中雌激素水平明显低于非骨折组的报道。目前关于雌激素对老年雄性哺乳动物植入骨的新骨形成的影响知之甚少，我们应用老年雄性大白鼠做植入骨的研究。
材料和方法
一、 植入骨的制备方法
见文献[3]。
二、实验动物分组
, 百拇医药
全部实验动物均购自中国医学科学院动物室，均为雄性Wistar 大白鼠，满12 月龄，日龄差异17 d，体重240～280 g，随机分布于各组。5周实验的第一天处死者称实验前组 ( 6只，取血6只，留尿成功4 只)。实验组3个：对照组：16 只，注植物油(溶剂)；雌激素组：16 只，按1倍于人工月经周期剂量(20μg.kg-1.d-1)皮下注射17-β雌二醇(E2， 美国Sigma公司)；雄激素组：16 只，按5倍于人内源性雄激素替代剂量( 1 250 μg.kg-1.d-1 ) 丙酸睾丸素(国产)皮下注射。因中途死亡, 至5周末实验终点时，上述3组分别剩下 13、16、15只大白鼠供取血。3个实验组的实验前成功留尿分别为6、7、6只，连同“实验前组”留尿的4 只，共有23只大白鼠的实验前留尿。3个实验组大白鼠实验终点的成功留尿分别为7、8、7只。留尿未成功的原因是尿收集笼数量不足、杂物污染尿、中途死亡。
, http://www.100md.com
三、 骨的种植
骨片种植于大白鼠腹部，立即每天颈部皮下注射相关激素或溶剂。第5周末处死。 处死前10 d和前3 d分别腹腔注射 1% calcein 20 mg/kg。
四、 标本保存和测定
所有治疗前后的血、尿标本均-20 ℃冻存，骨标本于无水乙醇中-4℃保存，同一批测定。
五、 测定方法
血钙、磷、碱性磷酸酶和尿钙、肌酐(Cr)经自动生化分析仪(日立7170 全自动生化分析仪)测定。 脱氧吡啶啉(Dpd)，美国Metra Biosystems Inc. 药盒, 以ELISA方法测定。血睾酮(TTT) 和E2测定为ELISA法(法国PIBG公司)。尿Dpd，血TTT和E2的测定，由于全部样本冻存和一次测定，不存在批间差异。三者的批内变异系数分别为7.8 % 、 5.4% 和4.3%。 不脱钙骨的骨组织切片厚度、染色等与文献[3]相同，计量学检查由美国Colorado大学医学中心代谢性骨病研究室朱建民教授完成。处死前10 d和前3 d分别腹腔注射 1% calcein 20 mg/kg，所显示四环素标记可以见到，但未能显示2条线，故不能测矿化率。血骨钙素因未能购到鼠骨钙素药盒故未进行测定。
, 百拇医药
六、 统计学处理
选用SPLM软件完成，计数资料符合正态分布，作t 检验。
结果
一、 植入骨的骨组织计量学检查
股骨的组织计量学指标3个实验组间差异无显著性；但种植骨之间差异有显著性(表1)：(1)新生骨面积： 雌激素组和雄激素组明显高于对照组( P值均<0.001), 但雌激素组和雄激素组间差异无显著性。(2)破骨细胞数：雌激素组和雄激素组明显高于对照组(P值均为0.002)，但雌激素组和雄激素组之间差异无显著性。(3)成骨细胞数: 雌激素组明显高于对照组(P=0.01)，雄激素组明显低于对照组(P=0.001)，雌激素组明显高于雄激素组(P<0.001)。四环素标记可以见到，但未能显示二条线，故不能测矿化率。
表1 新生骨的骨组织计量学结果(
±s) 组别
, 百拇医药
只数
新生骨面积与标本面积比
(%)
破骨细胞数
(个/mm2)
成骨细胞数
(个/mm2)
对照组
16
3.15±0.31
40±3
25±2△
, 百拇医药
雌激素组
16
6.38±0.42**
55±3**
32±2*
雄激素组
14
5.75±0.56**
53±3**
16±2**#
注：△检测了15只大鼠；与对照组比较，*P<0.05；**P≤0.002；与雌激素组比较，#P<0.001 二、 血和尿的化学指标(表2)
, 百拇医药
1. 尿Dpd/Cr： 对照组注射溶剂5周后明显大
表2 血和尿的化学指标测定结果(±s)
尿Dpd/Cr(mmol/mol)
尿钙/Cr
血钙(mmol/L)
血磷(mmol/L)
血碱性磷酸酶(U/L)
注药前
104±7(23)
, http://www.100md.com
0.09±0.02(23)
2.75±0.05(6)
2.25±0.06(6)
187±12(6)
注药后5周
对照组
198±20(7)△△
0.12±0.03(7)
2.63±0.03(13)△
1.94±0.06(13)△
141±12(13)△
, http://www.100md.com
雌激素组
114±16(8)**
0.19±0.03(8)△
2.70±0.03(16)
2.03±0.09(16)
134±11(16)△
雄激素组
118±19(7)*
0.08±0.01(7)#
2.55±0.03(15)(△△)/(*##)
, 百拇医药
1.87±0.06(15)△△
189±22(15)#
注：括号内数字为只数；与注药前比较，△P<0.05;△△P≤0.005;与对照组比较，*P<0.05，**P≤0.005;与雌激素组比较：#P<0.05；##P<0.05
于注药前 (P<0.001)；雌激素组和雄激素组明显低于对照组( P值分别为0.005和0.012)，而且雌激素组、雄激素组与注药前差异无显著性 (P值分别为0.56和0.44)，雌激素与雄激素组间差异无显著性 (P=0.87)。
2. 血碱性磷酸酶(ALP)：组间基本无明显差异(由于血ALP的标准误大，P=0.04难于肯定有明显差异)。
, http://www.100md.com
3. 血钙和尿钙：雄激素组均比雌激素组低(P值分别<0.001和0.028)。
三、血睾酮和雌二醇的测定结果(表3)
表3 血TTT和E2水平(±s)
TTT(nmol/L)
E2
(pmol/L)
睾丸体积
实验前组
, 百拇医药
5.14±0.73
(6)
181.3±12.8
(6)
注药5周后
对照组
5.38±0.76
(13)
197.4±20.6
(13)
作为1
雌激素组
1.35±0.28
, 百拇医药
(16)(△△)/(**)
172.1±15.1
(16)
大多数鼠为0.5左右
雄激素组
17.2±2.81
(15)(△△**)/(##)
163.7±11.0
(15)
仍为1
注：括号内为只数；与实验前组比较，△P<0.05；△△P≤0.005；与对照组比较，*P<0.05；**P≤0.005；与雌激素组比较，#P<0.05;##P<0.05
, 百拇医药
1. 血雄激素水平： (1)雄激素组明显高于实验前组、对照组和雌激素组(P值分别为0.004，<0.001，<0.001)；(2)雌激素组明显低于实验前组(P<0.001)和对照组(P<0.001)。
2.血雌激素水平：在实验前组、对照组、雌激素组、雄激素组4组任意2组间差异均无显著性。但雌激素组大多数鼠的睾丸体积仅为对照组的约1/2。
四、其他
以下测定已完成，但未发现任何两组间差异有显著性，包括: (1) 朱建民等[3]描述的股骨的骨组织计量学各指标。(2)骨生物力学指标: 骨结构力学的最大载荷、最大桡度、弹性载荷、弹性桡度；骨材料力学的截面惯性距、最大应力、弹性模量、 刚性系数、弹性应变。
讨论
一、雌激素能刺激种植骨的新骨生成
, 百拇医药
破骨细胞和成骨细胞均存在雌激素受体。种植骨的骨生成过程是：破骨细胞吸收残余骨基质(bone matrix), 成骨细胞生成新的类骨质(osteoid), 继而成骨细胞使新生类骨质钙化成为新骨。本研究显示，种植骨的新生骨骨量，雌激素组和雄激素组明显高于对照组，但雌激素组和雄激素组之间差异无显著性，提示雌激素对老年雄性大白鼠的骨再建有重要刺激作用。 种植骨的破骨细胞数与新生骨的骨面积正相关(表1)。
雌激素受体在人成骨样细胞[4]和鸟破骨细胞的存在均已证实。在成骨细胞培养基中，由成骨细胞所产生的白细胞介素(IL)-1和IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNFα)等能够诱导单核破骨细胞前体分化为具有强大骨吸收功能的多核破骨细胞。成骨细胞的IL-1、IL-6等成骨细胞因子和成熟破骨细胞数量呈正相关。 若在成骨细胞培养基中加入雌激素，则能抑制IL-1和IL-6的分泌。雌激素抑制破骨细胞的骨吸收作用，途径有二： (1)雌激素能作用于破骨细胞的雌激素受体直接发挥抑制作用， (2)雌激素又能作用于成骨细胞的雌激素受体，使它所分泌的IL-1、IL-6 等成骨细胞因子减少，IL-1、IL-6 等成骨细胞因子所诱导的破骨细胞的分化成熟过程减慢。因此，雌激素直接作用于成骨细胞之后，间接使破骨细胞数减少。 本研究雌激素组的尿Dpd/Cr比值明显低于对照组，表明破骨细胞功能明显受到抑制。
, 百拇医药
雄激素受体确实存在于成骨细胞上，但受体密度甚低，须高浓度雄激素和受体结合才能刺激成骨细胞功能。至今尚未证明雄激素受体存在于破骨细胞上。雄激素作用于骨有两种方式：(1)直接作用于成骨细胞的雄激素受体；(2)雄激素经芳香化酶作用转变为雌激素，再作用雌激素受体。尽管雄激素可阻止男性性功能低下者骨质进一步丢失，但不能充分恢复骨量,须有雌激素的充分作用。 性激素相关的成骨细胞功能由3个因素决定：成骨细胞数量、雌激素水平和雄激素水平。由表3可知，雌激素水平在雌激素组和雄激素组之间差异并无显著性。雄激素组成骨细胞数仅为雌激素组的一半(表1)，同时雄激素组的血清雄激素水平比雌激素组升高12倍(表3)。3个因素综合的成骨细胞功能， 雌激素组和雄激素组差异可以无显著性。近似的成骨细胞功能表现为：(1)成骨细胞的骨基质分泌功能和矿化功能近似，结果是新生骨的骨面积在雌激素和雄激素组之间差异可以无显著性。(2)IL-1、IL-6 等成骨细胞因子的分泌量，雌激素和雄激素组之间可以无明显差异，其结果是分化成熟的破骨细胞的数量可以无明显差异(见表1的破骨细胞)。 由于雄激素不能直接作用于破骨细胞，或许由此能解释雄激素组比雌激素组12倍增高的血清雄激素水平并未引起破骨细胞数增多。
, http://www.100md.com
Riggs等[5] 认为，(1)无论女性和男性，雌激素缺乏必然增加骨吸收率，也可能损害代偿性骨形成增加。(2)雌激素缺乏必然促成老年男性骨质疏松。骨再建、维持终生骨健康，主要依靠雌激素的刺激作用。
二、雌激素对老年雄性大白鼠全身骨骼(非种植骨)代谢具有重要作用
作为骨吸收指标的尿Dpd/Cr, 雌激素组和雄激素组均显示能抵抗5周衰老所致尿Dpd/Cr升高(表2)。作为骨生成指标的血清碱性磷酸酶，4个组之间差异基本无显著性。可能的解释是：老年退化性骨质丢失过程中，骨吸收率的增高程度明显大于代偿性骨生成率的增高程度。本该存在的骨生成率轻度代偿性增高，本实验未能由碱性磷酸酶表现出来，若测定骨钙素等敏感指标或许有所发现。由骨吸收指标尿Dpd/Cr和骨生成指标血清碱性磷酸酶表现的大白鼠全身骨骼(非种植骨)骨质丢失的积累，由于仅5周，时间太短，故各实验组之间的股骨形态计量学指标和股骨骨生物力学各指标尚未出现显著差异。
, http://www.100md.com
三、 雌激素在老年雄性大白鼠的骨再建网络中仍有重要作用
全身激素,如甲状旁腺激素(PTH)、 降钙素(CT)、 维生素D (Vit.D)、前列腺素E2 (PGE2)等局部细胞因子,包括转移生长因子-β (TGFβ)、 成骨蛋白(BMPs)、 各种胰岛素样生长因子 (IGFs)、 各种前列腺素(PGs)、 各种白细胞介素、TNFα等，钙、磷代谢靶器官(肾、骨、肠等)，以及骨代谢靶细胞(破骨细胞和成骨细胞)等，可构成骨吸收和骨形成的骨再建网络。老年雄性大白鼠的骨再塑网络诸多因素均经受衰老，显然不同于非老年雄性大白鼠。但本实验证明，雌激素作用于老年雄性大白鼠的骨再建网络，仍然能增加种植的骨片(骨基质)的新生骨骨量。雄激素治疗老年男性骨质疏松受到前列腺肥大和前列腺癌并发症的限制；雌激素治疗老年女性骨质疏松受到子宫内膜癌和乳腺癌等并发症的限制, 应用于男性则损害正常的男性性征。新的选择性雌激素受体调节剂(SERM)能选择对骨的有益作用，并可避免上述并发症，已在绝经后骨质疏松妇女试用，人们正期待新的SERM应用于老年男性骨质疏松症。
, 百拇医药
参考文献
1，Smith EP, Boyd J, Frank GR,et al . Estrogen resistance caused by a mutation in estrogen receptor gene in a man. N Engl J Med, 1994, 331: 1056-1061.
2，Carani C, Qin K, Simoni M, et al. Effect of testosterone and estrodial in a man with aromatase deficiency. N Engl J Med, 1997, 337: 91-95.
3，朱建民， Huffer W, Alfrey AC. 铝中毒骨病发病机理的实验研究. 中华内科杂志，1990, 29：485-488.
, http://www.100md.com
4，Eriksen EF, Colvard DS, Berg NJ, et al. Evidence of estrogen receptors in normal human osteoblastic-like cells. Science, 1988, 241: 84-86.
5，Riggs BL, Khosla S, Melton J. A unitary model for involutional osteoporosis: estrogen deficiency causes type 1 and type 2 osteoporosis in postmenopausal women and contributes to bone loss in aging men. J Bone Miner Res, 1998, 13:763-773.
收稿日期：1999-12-23, 百拇医药
单位：林嘉滨(卫生部北京医院内科 100730)；金燕宁(卫生部北京医院内科 100730)；汪耀(卫生部北京医院内科 100730)；金世鑫(卫生部北京医院内科 100730)；张聪(现在中日友好医院肾内科，北京，100029)；朱建民(美国Colorado大学医学中心代谢性骨病研究室)；William E.Huffer(美国Colorado大学医学中心代谢性骨病研究室)
关键词：性激素类；骨和骨组织
中华内科杂志001011 【摘要】 目的 研究雌激素对老年雄性哺乳动物的植入骨的新生骨骨面积及对全身骨代谢的影响。 方法 骨基质骨片植入老年雄性大鼠，观察注射雌激素组、雄激素组和对照组骨组织计量学、骨生物力学、尿脱氧吡啶啉/肌酐(Dpd/Cr)比值，以及血和尿的钙、磷等的变化。 结果(1)新生骨骨面积：雌激素组和雄激素组均比对照组明显增高(P<0.05)，雌激素组和雄激素组之间差异无显著性。(2)破骨细胞数：雌激素组(55±3) 个/ mm2和雄激素组(53±3)个/ mm2均显著高于对照组(40±3)个/mm2(P≤0.002)，雌激素组和雄激素组之间差异无显著性。(3)尿Dpd/Cr 比值(mmol/mol)：注药后5周，对照组(注射溶剂)比注药前明显升高(198±20 vs 104±7)，雌激素组(114±16)和雄激素组(118±19)均比对照组(198±20)明显减低，与注药前无明显差异，雌激素和雄激素组之间差异无显著性。 结论 雌激素和雄激素不仅能刺激老年雄性大白鼠植入骨的新生骨骨面积增加，也能抑制全身骨骼的骨吸收速率。本实验条件下，这两方面的影响，雌激素和雄激素组之间未见明显差异。
, 百拇医药
The effect of estrogen on new bone formation in the implanted bone matrix in aged male rats
ZHANG Cong LIN Jiabin JIN Yanning
(Department of Nephrology, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029)
JIN Shixin
(Department of Endocrinology, Beijing Hospital, Beijing 100730，China)
【Abstract】 Objective To study the effect of estrogen on new bone formation in the implanted bone matrix in aged male rats and on general bone metabolism. Methods The aged male rats were implanted with slices of bone matrix and subcutenously injected with estrogen, androgen or the solvent for five weeks. The changes in bone histomorphometry, bio-mechanical parameters and urine deoxypyridinoline (Dpd) levels were observed as indexes of bone reabsorption. Calcium, organic phosphate, and alkalphophatase levels in serum and urine were also studied. Results (1) The areas of new bone formation were significantly larger in estrogen and androgen groups than in the control but without difference between estrogen and androgen groups. (2) The number of osteoclasts was higher in estrogen and androgen groups than in the control (P≤0.002) but without difference between estrogen and androgen groups. (3) Urine Dpd/Cr ratio was lower in estrogen and androgen groups than in the control and higher in the control than that obtained 5 weeks ago but without difference between estrogen and androgen groups. Conclusion Estrogen and androgen are able to stimulate new bone formation in the implanted bone matrix and inhibit the reabsorption rate of systemic bones in aged male rats, but there was no difference between estrogen and androgen in these two respects under the conditions of this experiment.
, 百拇医药
【Key words】 Sex hormones; Bone and bones
近年发现, 雌激素对雄性哺乳动物的骨代谢有重要影响，有时起主导作用。有报道由雌激素受体基因突变而引起的男性骨质疏松患者，补充雌激素不见骨密度改善[1]。但由芳香化酶基因突变所致的男性骨质疏松(雌激素减少引起)者，补充雌激素则疗效显著[2]。也有老年男性骨折组患者血中雌激素水平明显低于非骨折组的报道。目前关于雌激素对老年雄性哺乳动物植入骨的新骨形成的影响知之甚少，我们应用老年雄性大白鼠做植入骨的研究。
材料和方法
一、 植入骨的制备方法
见文献[3]。
二、实验动物分组
, 百拇医药
全部实验动物均购自中国医学科学院动物室，均为雄性Wistar 大白鼠，满12 月龄，日龄差异17 d，体重240～280 g，随机分布于各组。5周实验的第一天处死者称实验前组 ( 6只，取血6只，留尿成功4 只)。实验组3个：对照组：16 只，注植物油(溶剂)；雌激素组：16 只，按1倍于人工月经周期剂量(20μg.kg-1.d-1)皮下注射17-β雌二醇(E2， 美国Sigma公司)；雄激素组：16 只，按5倍于人内源性雄激素替代剂量( 1 250 μg.kg-1.d-1 ) 丙酸睾丸素(国产)皮下注射。因中途死亡, 至5周末实验终点时，上述3组分别剩下 13、16、15只大白鼠供取血。3个实验组的实验前成功留尿分别为6、7、6只，连同“实验前组”留尿的4 只，共有23只大白鼠的实验前留尿。3个实验组大白鼠实验终点的成功留尿分别为7、8、7只。留尿未成功的原因是尿收集笼数量不足、杂物污染尿、中途死亡。
, http://www.100md.com
三、 骨的种植
骨片种植于大白鼠腹部，立即每天颈部皮下注射相关激素或溶剂。第5周末处死。 处死前10 d和前3 d分别腹腔注射 1% calcein 20 mg/kg。
四、 标本保存和测定
所有治疗前后的血、尿标本均-20 ℃冻存，骨标本于无水乙醇中-4℃保存，同一批测定。
五、 测定方法
血钙、磷、碱性磷酸酶和尿钙、肌酐(Cr)经自动生化分析仪(日立7170 全自动生化分析仪)测定。 脱氧吡啶啉(Dpd)，美国Metra Biosystems Inc. 药盒, 以ELISA方法测定。血睾酮(TTT) 和E2测定为ELISA法(法国PIBG公司)。尿Dpd，血TTT和E2的测定，由于全部样本冻存和一次测定，不存在批间差异。三者的批内变异系数分别为7.8 % 、 5.4% 和4.3%。 不脱钙骨的骨组织切片厚度、染色等与文献[3]相同，计量学检查由美国Colorado大学医学中心代谢性骨病研究室朱建民教授完成。处死前10 d和前3 d分别腹腔注射 1% calcein 20 mg/kg，所显示四环素标记可以见到，但未能显示2条线，故不能测矿化率。血骨钙素因未能购到鼠骨钙素药盒故未进行测定。
, 百拇医药
六、 统计学处理
选用SPLM软件完成，计数资料符合正态分布，作t 检验。
结果
一、 植入骨的骨组织计量学检查
股骨的组织计量学指标3个实验组间差异无显著性；但种植骨之间差异有显著性(表1)：(1)新生骨面积： 雌激素组和雄激素组明显高于对照组( P值均<0.001), 但雌激素组和雄激素组间差异无显著性。(2)破骨细胞数：雌激素组和雄激素组明显高于对照组(P值均为0.002)，但雌激素组和雄激素组之间差异无显著性。(3)成骨细胞数: 雌激素组明显高于对照组(P=0.01)，雄激素组明显低于对照组(P=0.001)，雌激素组明显高于雄激素组(P<0.001)。四环素标记可以见到，但未能显示二条线，故不能测矿化率。
表1 新生骨的骨组织计量学结果(
±s) 组别, 百拇医药
只数
新生骨面积与标本面积比
(%)
破骨细胞数
(个/mm2)
成骨细胞数
(个/mm2)
对照组
16
3.15±0.31
40±3
25±2△
, 百拇医药
雌激素组
16
6.38±0.42**
55±3**
32±2*
雄激素组
14
5.75±0.56**
53±3**
16±2**#
注：△检测了15只大鼠；与对照组比较，*P<0.05；**P≤0.002；与雌激素组比较，#P<0.001 二、 血和尿的化学指标(表2)
, 百拇医药
1. 尿Dpd/Cr： 对照组注射溶剂5周后明显大
表2 血和尿的化学指标测定结果(
±s)尿Dpd/Cr(mmol/mol)
尿钙/Cr
血钙(mmol/L)
血磷(mmol/L)
血碱性磷酸酶(U/L)
注药前
104±7(23)
, http://www.100md.com
0.09±0.02(23)
2.75±0.05(6)
2.25±0.06(6)
187±12(6)
注药后5周
对照组
198±20(7)△△
0.12±0.03(7)
2.63±0.03(13)△
1.94±0.06(13)△
141±12(13)△
, http://www.100md.com
雌激素组
114±16(8)**
0.19±0.03(8)△
2.70±0.03(16)
2.03±0.09(16)
134±11(16)△
雄激素组
118±19(7)*
0.08±0.01(7)#
2.55±0.03(15)(△△)/(*##)
, 百拇医药
1.87±0.06(15)△△
189±22(15)#
注：括号内数字为只数；与注药前比较，△P<0.05;△△P≤0.005;与对照组比较，*P<0.05，**P≤0.005;与雌激素组比较：#P<0.05；##P<0.05
于注药前 (P<0.001)；雌激素组和雄激素组明显低于对照组( P值分别为0.005和0.012)，而且雌激素组、雄激素组与注药前差异无显著性 (P值分别为0.56和0.44)，雌激素与雄激素组间差异无显著性 (P=0.87)。
2. 血碱性磷酸酶(ALP)：组间基本无明显差异(由于血ALP的标准误大，P=0.04难于肯定有明显差异)。
, http://www.100md.com
3. 血钙和尿钙：雄激素组均比雌激素组低(P值分别<0.001和0.028)。
三、血睾酮和雌二醇的测定结果(表3)
表3 血TTT和E2水平(
±s)TTT(nmol/L)
E2
(pmol/L)
睾丸体积
实验前组
, 百拇医药
5.14±0.73
(6)
181.3±12.8
(6)
注药5周后
对照组
5.38±0.76
(13)
197.4±20.6
(13)
作为1
雌激素组
1.35±0.28
, 百拇医药
(16)(△△)/(**)
172.1±15.1
(16)
大多数鼠为0.5左右
雄激素组
17.2±2.81
(15)(△△**)/(##)
163.7±11.0
(15)
仍为1
注：括号内为只数；与实验前组比较，△P<0.05；△△P≤0.005；与对照组比较，*P<0.05；**P≤0.005；与雌激素组比较，#P<0.05;##P<0.05
, 百拇医药
1. 血雄激素水平： (1)雄激素组明显高于实验前组、对照组和雌激素组(P值分别为0.004，<0.001，<0.001)；(2)雌激素组明显低于实验前组(P<0.001)和对照组(P<0.001)。
2.血雌激素水平：在实验前组、对照组、雌激素组、雄激素组4组任意2组间差异均无显著性。但雌激素组大多数鼠的睾丸体积仅为对照组的约1/2。
四、其他
以下测定已完成，但未发现任何两组间差异有显著性，包括: (1) 朱建民等[3]描述的股骨的骨组织计量学各指标。(2)骨生物力学指标: 骨结构力学的最大载荷、最大桡度、弹性载荷、弹性桡度；骨材料力学的截面惯性距、最大应力、弹性模量、 刚性系数、弹性应变。
讨论
一、雌激素能刺激种植骨的新骨生成
, 百拇医药
破骨细胞和成骨细胞均存在雌激素受体。种植骨的骨生成过程是：破骨细胞吸收残余骨基质(bone matrix), 成骨细胞生成新的类骨质(osteoid), 继而成骨细胞使新生类骨质钙化成为新骨。本研究显示，种植骨的新生骨骨量，雌激素组和雄激素组明显高于对照组，但雌激素组和雄激素组之间差异无显著性，提示雌激素对老年雄性大白鼠的骨再建有重要刺激作用。 种植骨的破骨细胞数与新生骨的骨面积正相关(表1)。
雌激素受体在人成骨样细胞[4]和鸟破骨细胞的存在均已证实。在成骨细胞培养基中，由成骨细胞所产生的白细胞介素(IL)-1和IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNFα)等能够诱导单核破骨细胞前体分化为具有强大骨吸收功能的多核破骨细胞。成骨细胞的IL-1、IL-6等成骨细胞因子和成熟破骨细胞数量呈正相关。 若在成骨细胞培养基中加入雌激素，则能抑制IL-1和IL-6的分泌。雌激素抑制破骨细胞的骨吸收作用，途径有二： (1)雌激素能作用于破骨细胞的雌激素受体直接发挥抑制作用， (2)雌激素又能作用于成骨细胞的雌激素受体，使它所分泌的IL-1、IL-6 等成骨细胞因子减少，IL-1、IL-6 等成骨细胞因子所诱导的破骨细胞的分化成熟过程减慢。因此，雌激素直接作用于成骨细胞之后，间接使破骨细胞数减少。 本研究雌激素组的尿Dpd/Cr比值明显低于对照组，表明破骨细胞功能明显受到抑制。
, 百拇医药
雄激素受体确实存在于成骨细胞上，但受体密度甚低，须高浓度雄激素和受体结合才能刺激成骨细胞功能。至今尚未证明雄激素受体存在于破骨细胞上。雄激素作用于骨有两种方式：(1)直接作用于成骨细胞的雄激素受体；(2)雄激素经芳香化酶作用转变为雌激素，再作用雌激素受体。尽管雄激素可阻止男性性功能低下者骨质进一步丢失，但不能充分恢复骨量,须有雌激素的充分作用。 性激素相关的成骨细胞功能由3个因素决定：成骨细胞数量、雌激素水平和雄激素水平。由表3可知，雌激素水平在雌激素组和雄激素组之间差异并无显著性。雄激素组成骨细胞数仅为雌激素组的一半(表1)，同时雄激素组的血清雄激素水平比雌激素组升高12倍(表3)。3个因素综合的成骨细胞功能， 雌激素组和雄激素组差异可以无显著性。近似的成骨细胞功能表现为：(1)成骨细胞的骨基质分泌功能和矿化功能近似，结果是新生骨的骨面积在雌激素和雄激素组之间差异可以无显著性。(2)IL-1、IL-6 等成骨细胞因子的分泌量，雌激素和雄激素组之间可以无明显差异，其结果是分化成熟的破骨细胞的数量可以无明显差异(见表1的破骨细胞)。 由于雄激素不能直接作用于破骨细胞，或许由此能解释雄激素组比雌激素组12倍增高的血清雄激素水平并未引起破骨细胞数增多。
, http://www.100md.com
Riggs等[5] 认为，(1)无论女性和男性，雌激素缺乏必然增加骨吸收率，也可能损害代偿性骨形成增加。(2)雌激素缺乏必然促成老年男性骨质疏松。骨再建、维持终生骨健康，主要依靠雌激素的刺激作用。
二、雌激素对老年雄性大白鼠全身骨骼(非种植骨)代谢具有重要作用
作为骨吸收指标的尿Dpd/Cr, 雌激素组和雄激素组均显示能抵抗5周衰老所致尿Dpd/Cr升高(表2)。作为骨生成指标的血清碱性磷酸酶，4个组之间差异基本无显著性。可能的解释是：老年退化性骨质丢失过程中，骨吸收率的增高程度明显大于代偿性骨生成率的增高程度。本该存在的骨生成率轻度代偿性增高，本实验未能由碱性磷酸酶表现出来，若测定骨钙素等敏感指标或许有所发现。由骨吸收指标尿Dpd/Cr和骨生成指标血清碱性磷酸酶表现的大白鼠全身骨骼(非种植骨)骨质丢失的积累，由于仅5周，时间太短，故各实验组之间的股骨形态计量学指标和股骨骨生物力学各指标尚未出现显著差异。
, http://www.100md.com
三、 雌激素在老年雄性大白鼠的骨再建网络中仍有重要作用
全身激素,如甲状旁腺激素(PTH)、 降钙素(CT)、 维生素D (Vit.D)、前列腺素E2 (PGE2)等局部细胞因子,包括转移生长因子-β (TGFβ)、 成骨蛋白(BMPs)、 各种胰岛素样生长因子 (IGFs)、 各种前列腺素(PGs)、 各种白细胞介素、TNFα等，钙、磷代谢靶器官(肾、骨、肠等)，以及骨代谢靶细胞(破骨细胞和成骨细胞)等，可构成骨吸收和骨形成的骨再建网络。老年雄性大白鼠的骨再塑网络诸多因素均经受衰老，显然不同于非老年雄性大白鼠。但本实验证明，雌激素作用于老年雄性大白鼠的骨再建网络，仍然能增加种植的骨片(骨基质)的新生骨骨量。雄激素治疗老年男性骨质疏松受到前列腺肥大和前列腺癌并发症的限制；雌激素治疗老年女性骨质疏松受到子宫内膜癌和乳腺癌等并发症的限制, 应用于男性则损害正常的男性性征。新的选择性雌激素受体调节剂(SERM)能选择对骨的有益作用，并可避免上述并发症，已在绝经后骨质疏松妇女试用，人们正期待新的SERM应用于老年男性骨质疏松症。
, 百拇医药
参考文献
1，Smith EP, Boyd J, Frank GR,et al . Estrogen resistance caused by a mutation in estrogen receptor gene in a man. N Engl J Med, 1994, 331: 1056-1061.
2，Carani C, Qin K, Simoni M, et al. Effect of testosterone and estrodial in a man with aromatase deficiency. N Engl J Med, 1997, 337: 91-95.
3，朱建民， Huffer W, Alfrey AC. 铝中毒骨病发病机理的实验研究. 中华内科杂志，1990, 29：485-488.
, http://www.100md.com
4，Eriksen EF, Colvard DS, Berg NJ, et al. Evidence of estrogen receptors in normal human osteoblastic-like cells. Science, 1988, 241: 84-86.
5，Riggs BL, Khosla S, Melton J. A unitary model for involutional osteoporosis: estrogen deficiency causes type 1 and type 2 osteoporosis in postmenopausal women and contributes to bone loss in aging men. J Bone Miner Res, 1998, 13:763-773.
收稿日期：1999-12-23, 百拇医药