丝裂原活化蛋白激酶参与胰岛素对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞的增殖研究
作者：王旭开 王燕 何作云 刘光耀 杨成明 李民
单位：王旭开 刘光耀 杨成明 李民(第三军医大学大坪医院心血管内科， 重庆 400042)；王燕(第三军医大学分子生物教研室，重庆 400038)；何作云(新桥医院心内科，重庆 400037)
关键词：胰岛素；高血压；肌，平滑，血管；蛋白激酶类
中国病理生理杂志000706 [摘 要] 目的：探讨高血压血管平滑肌细胞(VSMC)在胰岛素作用下胞内信号转导途径之一丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的影响，及其与VSMC增殖的关系。方法：选用6周龄自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠，无菌分离主动脉，体外纯化培养VSMC至6～8代，加胰岛素干预和蛋白激酶C(PKC)抑制剂，采用胶内髓磷脂碱性蛋白原位磷酸化法测定VSMC中MAPK活性，并用Western Blot检测VSMC中MAPK的含量，[3H]-TdR测定VSMC的DNA合成量。结果：胰岛素作用后，SHR组的DNA合成量显著增加，MAPK活性及蛋白含量也显著增加，PKC抑制剂可明显降低MAPK活性。结论：SHR体外培养的VSMC增殖与MAPK活性增加有关，胰岛素可影响其活性，并且可能存在胰岛素-PKC-MAPK轴。
, 百拇医药
[中图分类号] Q253 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0596-04
Effects of insulin on mitogen-activited protein kinase of
vascular smooth muscle cells in spontaneously hypertensive rat
WANG Xu-kai,LIU Guang-yao, YANG Cheng-ming, LI Min
(Department of Cardiology, Daping Hospital, The 3rd Military Medical University, Chongqing 400042, China)
, 百拇医药
WANG Yan
(Department of Molecular Biology, The 3rd Military Medical University, Chongqing 400038, China)
HE Zuo-yun
(Department of Cardiology, Xingqiao Hospital, The 3rd Military Medical University, Chongqing 400037, China)
[Abstract] AIM:To explose the possible existing pathway of intracellular signaling transduction in hypertensive induced by insulin in rat vascular smooth muscle cells proliferation which involved mitogen-activated protein kinase. METHODS:Male spontaneously hypertensive rat (SHR) aorta and WKY(6 weeks old) were isolated and then cultured to make the purified vascular smooth muscle cells.6-8th generation of VSMC were interfered with insulin in vitro. MAPK activity was determined by myelin basic protein method and its volume was measured with Western Blot. And [3 H]-TdR was used to measure DNA synthesis in VSMC proliferation. RESULTS: After the interfered with insulin the DNA synthesis was increased obviously in SHR group. MAPK activity and its contains in SHR were increased more than the control group. Protein kinase C inhibitor decreased MAPK activity induced by insulin. CONCLUSION:Proliferation of SHR VSMC in vitro was correlated with increased activity of MAPK. Insulin can affect MAPK induced activity. So an insulin-PKC-MAPK axis may exist in hypertensive VSMC.
, 百拇医药
[MeSH] Insulin; Hypertension; Muscle, smooth, vascular; Protein kinases
高血压的发病机制十分复杂，其主要病理改变是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增生、肥大，造成血管壁肥厚，管腔狭窄。胰岛素在VSMC增殖中的作用日益引起人们的关注。在先前的研究中已证实胰岛素对VSMC增殖及DNA合成有促进作用[1]。引起VSMC增殖是通过激活PKC途径[2]。丝裂原活化蛋白激酶家族是与细胞增殖调控关系最为密切的细胞内信号转导蛋白激酶，是细胞外信号与细胞核之间信息传递的共同通路[3]。本工作在体外培养的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和WKY大鼠主动脉VSMC上观察胰岛素对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的影响，以及对VSMC增殖在SHR和WKY的不同特点，以寻找可能存在的信号转导途径。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、材料
SHR 和WKY大鼠由北京阜外医院动物所提供；佛波脂(phorbol12-myristate13-acetate， PMA)、髓磷脂基质蛋白(myelin basic protein， MBP)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)-inhibitor (bisindolymaleimide)、抗MAPK多克隆抗体购自Sigma公司; leupeptin、insulin、PMSF购自Boehringer Mannhem公司; 胎牛血清和DMEM购自GIBCO公司; 羊抗兔抗体购自中山公司；[γ-32P]-ATP购自北京亚辉原子能研究所；[3H]-TdR购自中国医学科学院原子能研究所。
二、SHR和WKY大鼠的VSMC培养
, 百拇医药 选用6周龄的大鼠，按参考文献[4]方法分离和传代培养VSMC，细胞鉴定后于第4周开始转种传代，细胞于第6～8代用于本实验。
三、[3H]-TdR掺入法测VSMC DNA合成量
制备2×105 cells/mL悬液接种于24孔培养板，孵育24 h，贴壁后换无血清DMEM培养液24 h，然后每孔分别加入(对照组不加)PKC抑制剂2 μg/mL，孵育24 h后再加入insulin 10-7 mol/L和PMA 1 nmol/L, 孵育16 h后每孔内加入[3H]-Thymidine 3.7×104Bq/mL, 孵育8h,加入冷PBS液终止反应，在Milliper上经微孔滤膜收集细胞，并用10%三氯醋酸处理，滤膜烘干后置闪烁瓶中，加入闪烁液在液闪计数仪上测定[3H]的放射性。
, 百拇医药
四、MAPK免疫印迹及活性测定
按Arnods等[5]的方法改进。接种1×106 cells/mL于24孔培养板，孵育24 h后移至无血清培养液培养24 h。分别加和不加PKC抑制剂2 μg/mL，孵育24 h后再加入insulin 10-7 mol/L和PMA 1 nmol/L, 孵育10 min，用冷PBS液洗涤细胞后换MAPK提取缓冲液在冰上孵育30 min，14000 r/min 4℃ 30 min取上清，用10%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度；另调蛋白浓度至200 μg/mL 以备测量MAPK活性。MAPK免疫印迹：取20 μg/mL蛋白样品行10%SDS-PAGE电泳，按参考文献[5]方法进行电转运于硝酸纤维膜，抗MAPK抗体浓度为1∶5000，4℃过夜，PBST洗5 min×3次，按SP试剂盒说明书进行酶显色反应。MAPK活性测定：采用胶内髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein， MBP)原位磷酸化法[5]测定VSMC中MAPK活性，取20 μg/mL蛋白样品，行10%SDS-PAGE电泳，凝胶经充分洗脱、酶变性和复性处理，复性后的凝胶与[γ-32P]-ATP 18.5×104Bq/mL共同孵育，再用含1%焦磷酸钠的5%(W/V)三氯乙酸溶液洗脱凝胶，然后行干胶放射自显影。将相对应的凝胶切下，置于液闪液中进行计数，测定[32P]掺入的放射活性。MAPK活性用pmol[32P]/min蛋白表示，各组均为复管测定，同一实验重复5次。
, 百拇医药
五、统计方法
结果以均数±标准差(
±s)表示，Microsoft Excel统计程序进行差异显著性分析。
结 果
一、胰岛素对SHR的VSMC增殖的影响
胰岛素刺激组的SHR和WKY大鼠[3H]-TdR掺入量明显高于空白对照(空白组增加34%，SHR组增加了126%，WKY组增加了105%)，SHR的VSMC对胰岛素刺激后的DNA合成较WKY显著增多，而加入PKC抑制剂作用24 h后,再用胰岛素和PMA作用，其细胞生成增加与空白对照组比较差异不显著，图1。
二、胰岛素对VSMC内MAPK含量及活性的影响
, 百拇医药
胰岛素可促SHR及WKY大鼠的VSMC内MAPK含量增加，如图2A所示；发现在胰岛素作用后SHR和WKY两种大鼠的MAPK活性均增高，差异显著(P<0.05)。胰岛素对两种大鼠的VSMC内MAPK活性均有激活效应，SHR组中胰岛素vs空白为492.8 vs 121.1; WKY 组中胰岛素vs空白组是389.6 vs 105.7 pmol[32P]/min pro P<0.01。然而若给予PKC抑制剂处理24 h，可使胰岛素对MAPK的促活作用明显受到抑制，SHR组：胰岛素+PKC抑制剂vs胰岛素是118.2 vs 492.8 ; WKY组：胰岛素+PKC抑制剂vs胰岛素是 115.3 vs 389.6 pmol[32P]/min pro P<0.01，如图2B所示。
Fig 1 The effects of various agents on [3H]-TdR incorporation of VSMC
, 百拇医药
(Control=blank group;PMA=VSMC preincubated with PMA;Insulin=VSMC preincubated with insulin;PKC inhibitor+PMA=VSMC preincubated with inhibitor and PMA; PKC inhibitor+insulin=VSMC preincubated with control and PKC inhibitor)
**P<0.01，vs control and PKC inhibitor；
*P<0.05，SHR vs WKY (
±s, n=5)
图1 不同因素对VSMC[3H]-TdR掺入实验的影响
, http://www.100md.com
Fig 2A Effects of various agents on the contains of MAPK in VSMC (Immunolblot assay)
SHR:1.Control；2.PMA；3.Insulin；4.PKC inhibitor+PMA；5.PKC inhibitor+insulin
WKY:6.PMA；7.Insulin；8.PKC inhibitor+PMA；9.PKC inhibitor+insulin；10.Control(Control=blank group;PMA=VSMC preincubated with PMA;Insulin=VSMC preincubated with insulin;PKC inhibitor+PMA=VSMC preincubated with inhibitor and PMA; PKC inhibitor+insulin=VSMC preincubated with control and PKC inhibitor)
, 百拇医药
图2A 不同因素对VSMC所含的MAPK两种亚型的影响(免疫印迹法)
Fig 2B Effects of various agents on MAPK protein determine and
activity of VSMC (Immunolblot assay)
(Control=blank group;PMA=VSMC preincubated with PMA;Insulin= VSMC preincubated with insulin;PKC inhibitor+PMA=VSMC preincubated with inhibitor and PMA; PKC inhibitor+insulin=VSMC preincubated with control and PKC inhibitor)
, 百拇医药
* *P<0.01，vs control and PKC inhibitor；
*P<0.05，SHR vs WKY (±s, n=5)
图2B 不同因素对VSMC内MAPK活性的影响
讨 论
胰岛素是多肽激素，在我们先前的研究中证实胰岛素引起的人血管平滑肌细胞增殖与PKC有关[1，2]。胰岛素是通过位于VSMC膜上的胰岛素受体结合，使细胞内PKC活化，促使胞浆中PKC向膜上转位。我们曾报道胰岛素可促进VSMC增生与激活癌基因-c-fos有关[6]。然而，胰岛素通过PKC引起VSMC增殖的细胞内机制尚不清楚。最近，Morinelli等[7]分别在VSMC和心肌细胞上发现MAPK是与生长有关的刺激信号细胞内信息传递的最后共同通路。其家族成员包括ERK，JNK和P38/RK。认为无论是酪氨酸激酶或是G蛋白的偶联受体激活第二信使系统，都可导致MAPK磷酸化而激活MAPK，后者又可磷酸化而激活多种转录因子(如AP-1等)，启动初级和次级应答基因转录和翻译，从而介导外界刺激的细胞增生效应。本研究表明胰岛素可激活MAPK，我们用了PKC激动剂PMA作为阳性对照，结果表明，用PKC抑制剂预处理VSMC 24 h可使PKC活性受到抑制，在抑制了PKC活性后，结果显示胰岛素和PMA对VSMC的DNA3H-TdR掺入量减少及对MAPK的激活作用消失，表明胰岛素对MAPK的激活作用是依赖其上游的PKC活化信号，同时我们在实验中选用了自发性高血压大鼠SHR与WKY比较了两种鼠之间胰岛素对VSMC的作用，结果显示胰岛素均能对两种鼠VSMC的MAPK有激活作用，但在量上有显著差异，提示高血压大鼠的VSMC对胰岛素反应在PKC-MAPK上有不同。本实验表明胰岛素的促VSMC增生是通过PKC介导的，与激活MAPK的效应有关，提示高血压VSMC内可能存在胰岛素-PKC-MAPK轴的关系。
, 百拇医药
许多生长因子tyrosine激酶受体激活一种传递途径—包括生长因 子受体结合蛋白2(growth factor receptor-bound protein-2,GRB-2)和ras-GTP与激活有关的GRB-2上的src-同源簇2(SH2)的交换分子SOS-磷酸化受体。这些事件进一步导致未被激活的ras-GDP转变为激活的ras-GDP，激活raf、有丝分裂原激活蛋白激酶激酶(MAP kinase kinase)、有丝分裂原蛋白激酶(MAP kinase)、转录因子、最终DNA合成、增殖和分化[10]。胰岛素受体似乎不直接与GRB-2结合，但是受体的激活引起胰岛素受体底物(IRS-1或2) —它们与各种各样的SH2蛋白结合[11]。这样胰岛素受体可能激活MAP kinase瀑布，至少部份通过对IRS磷酸化、继而与GRB-2结合，激活SOS、 ras和下游的多种酶[11]。胰岛素唤醒了人VSMC MAPK kinase以及MAPK (Erk1和Erk2) ,并诱导这些细胞的MAPK kinase瀑布的激活 。对于VSMCs来说胰岛素激活MAP Kinase能力的可能原因目前尚未鉴别出来。
, http://www.100md.com
[基金项目]国家自然科学基金资助(No.39670321)
[参 考 文 献]
[1] 王 梅，王旭开，刘光耀，等.胰岛素对人血管平滑肌细胞增殖的影响[J].第三军医大学学报，1998，20(1)：21～22.
[2] 王旭开,王梅，刘光耀,等; 胰岛素对蛋白激酶C在人动脉平滑肌细胞中分布和含量的影响[J].第三军医大学学报，1998,20(2):118～120.
[3] Hill CS, Treisman R. Transcriptional regulation by extracellular signals: mechanism and specificity[J]. Cell, 1995，80:199～211.
[4] 赵三妹.动脉平滑肌细胞的培养方法及其应用[J].中华病理学杂志，1987，16(4)：105～106.
, 百拇医药
[5] Arnolds B, Bradford C B. Differential activation of mitogen-activated protein kinases by H2O2 and O 2 in vascular smooth muscle cells[J]. 1995,77(1):29～36.
[6] 王旭开,王梅，刘光耀,等; 胰岛素对体外培养的高血压病人血管平滑肌细胞表达的影响[J].中华心血管病杂志，1998，26(5)：350～351.
[7] Morinelli TA, Zhang LM, Newman WH, et al. Thrombexanel A2/prostaglandin H2 stimulated mitogenesis of coronary artery smooth muscle cells involves activation of mitogen-activated protein kinase and S6 kinase[J]. J Biol Chem， 1994， 269:5693～5698.
, 百拇医药
[8] Thorbum J， Thorbum A. The throsinekinase inhibitor, genistein,prevents alpha-adrenergic induced cardiac muscle cell hypertrophy by inhibiting activation of the Ras MAPkinase signalling pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1994,202:1586～1591.
[9] Davies RJ. The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway[J]. J Biol Chem， 1993，268:14553.
[10] Berra E, Dz Meco MT, Lozano J, et al. Evidence for a role of MEK and MAPK during signal transduction by protein kinase C zeta[J]. EMBO J, 1995, 14(24): 6157.
[11] Schwasser DC, Marais RM, Marshall CJ， et al. Activation of the mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase pathway by conventional, novel, and atypical protein kinase C isotypes[J]. Mol Cell Biol, 1998, 18(2): 790.
[收稿日期]1999-03-17
[修回日期]1999-08-13, http://www.100md.com
单位：王旭开 刘光耀 杨成明 李民(第三军医大学大坪医院心血管内科， 重庆 400042)；王燕(第三军医大学分子生物教研室，重庆 400038)；何作云(新桥医院心内科，重庆 400037)
关键词：胰岛素；高血压；肌，平滑，血管；蛋白激酶类
中国病理生理杂志000706 [摘 要] 目的：探讨高血压血管平滑肌细胞(VSMC)在胰岛素作用下胞内信号转导途径之一丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的影响，及其与VSMC增殖的关系。方法：选用6周龄自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠，无菌分离主动脉，体外纯化培养VSMC至6～8代，加胰岛素干预和蛋白激酶C(PKC)抑制剂，采用胶内髓磷脂碱性蛋白原位磷酸化法测定VSMC中MAPK活性，并用Western Blot检测VSMC中MAPK的含量，[3H]-TdR测定VSMC的DNA合成量。结果：胰岛素作用后，SHR组的DNA合成量显著增加，MAPK活性及蛋白含量也显著增加，PKC抑制剂可明显降低MAPK活性。结论：SHR体外培养的VSMC增殖与MAPK活性增加有关，胰岛素可影响其活性，并且可能存在胰岛素-PKC-MAPK轴。
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[中图分类号] Q253 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0596-04
Effects of insulin on mitogen-activited protein kinase of
vascular smooth muscle cells in spontaneously hypertensive rat
WANG Xu-kai,LIU Guang-yao, YANG Cheng-ming, LI Min
(Department of Cardiology, Daping Hospital, The 3rd Military Medical University, Chongqing 400042, China)
, 百拇医药
WANG Yan
(Department of Molecular Biology, The 3rd Military Medical University, Chongqing 400038, China)
HE Zuo-yun
(Department of Cardiology, Xingqiao Hospital, The 3rd Military Medical University, Chongqing 400037, China)
[Abstract] AIM:To explose the possible existing pathway of intracellular signaling transduction in hypertensive induced by insulin in rat vascular smooth muscle cells proliferation which involved mitogen-activated protein kinase. METHODS:Male spontaneously hypertensive rat (SHR) aorta and WKY(6 weeks old) were isolated and then cultured to make the purified vascular smooth muscle cells.6-8th generation of VSMC were interfered with insulin in vitro. MAPK activity was determined by myelin basic protein method and its volume was measured with Western Blot. And [3 H]-TdR was used to measure DNA synthesis in VSMC proliferation. RESULTS: After the interfered with insulin the DNA synthesis was increased obviously in SHR group. MAPK activity and its contains in SHR were increased more than the control group. Protein kinase C inhibitor decreased MAPK activity induced by insulin. CONCLUSION:Proliferation of SHR VSMC in vitro was correlated with increased activity of MAPK. Insulin can affect MAPK induced activity. So an insulin-PKC-MAPK axis may exist in hypertensive VSMC.
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[MeSH] Insulin; Hypertension; Muscle, smooth, vascular; Protein kinases
高血压的发病机制十分复杂，其主要病理改变是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增生、肥大，造成血管壁肥厚，管腔狭窄。胰岛素在VSMC增殖中的作用日益引起人们的关注。在先前的研究中已证实胰岛素对VSMC增殖及DNA合成有促进作用[1]。引起VSMC增殖是通过激活PKC途径[2]。丝裂原活化蛋白激酶家族是与细胞增殖调控关系最为密切的细胞内信号转导蛋白激酶，是细胞外信号与细胞核之间信息传递的共同通路[3]。本工作在体外培养的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和WKY大鼠主动脉VSMC上观察胰岛素对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的影响，以及对VSMC增殖在SHR和WKY的不同特点，以寻找可能存在的信号转导途径。
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材 料 和 方 法
一、材料
SHR 和WKY大鼠由北京阜外医院动物所提供；佛波脂(phorbol12-myristate13-acetate， PMA)、髓磷脂基质蛋白(myelin basic protein， MBP)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)-inhibitor (bisindolymaleimide)、抗MAPK多克隆抗体购自Sigma公司; leupeptin、insulin、PMSF购自Boehringer Mannhem公司; 胎牛血清和DMEM购自GIBCO公司; 羊抗兔抗体购自中山公司；[γ-32P]-ATP购自北京亚辉原子能研究所；[3H]-TdR购自中国医学科学院原子能研究所。
二、SHR和WKY大鼠的VSMC培养
, 百拇医药 选用6周龄的大鼠，按参考文献[4]方法分离和传代培养VSMC，细胞鉴定后于第4周开始转种传代，细胞于第6～8代用于本实验。
三、[3H]-TdR掺入法测VSMC DNA合成量
制备2×105 cells/mL悬液接种于24孔培养板，孵育24 h，贴壁后换无血清DMEM培养液24 h，然后每孔分别加入(对照组不加)PKC抑制剂2 μg/mL，孵育24 h后再加入insulin 10-7 mol/L和PMA 1 nmol/L, 孵育16 h后每孔内加入[3H]-Thymidine 3.7×104Bq/mL, 孵育8h,加入冷PBS液终止反应，在Milliper上经微孔滤膜收集细胞，并用10%三氯醋酸处理，滤膜烘干后置闪烁瓶中，加入闪烁液在液闪计数仪上测定[3H]的放射性。
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四、MAPK免疫印迹及活性测定
按Arnods等[5]的方法改进。接种1×106 cells/mL于24孔培养板，孵育24 h后移至无血清培养液培养24 h。分别加和不加PKC抑制剂2 μg/mL，孵育24 h后再加入insulin 10-7 mol/L和PMA 1 nmol/L, 孵育10 min，用冷PBS液洗涤细胞后换MAPK提取缓冲液在冰上孵育30 min，14000 r/min 4℃ 30 min取上清，用10%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度；另调蛋白浓度至200 μg/mL 以备测量MAPK活性。MAPK免疫印迹：取20 μg/mL蛋白样品行10%SDS-PAGE电泳，按参考文献[5]方法进行电转运于硝酸纤维膜，抗MAPK抗体浓度为1∶5000，4℃过夜，PBST洗5 min×3次，按SP试剂盒说明书进行酶显色反应。MAPK活性测定：采用胶内髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein， MBP)原位磷酸化法[5]测定VSMC中MAPK活性，取20 μg/mL蛋白样品，行10%SDS-PAGE电泳，凝胶经充分洗脱、酶变性和复性处理，复性后的凝胶与[γ-32P]-ATP 18.5×104Bq/mL共同孵育，再用含1%焦磷酸钠的5%(W/V)三氯乙酸溶液洗脱凝胶，然后行干胶放射自显影。将相对应的凝胶切下，置于液闪液中进行计数，测定[32P]掺入的放射活性。MAPK活性用pmol[32P]/min蛋白表示，各组均为复管测定，同一实验重复5次。
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五、统计方法
结果以均数±标准差(
±s)表示，Microsoft Excel统计程序进行差异显著性分析。结 果
一、胰岛素对SHR的VSMC增殖的影响
胰岛素刺激组的SHR和WKY大鼠[3H]-TdR掺入量明显高于空白对照(空白组增加34%，SHR组增加了126%，WKY组增加了105%)，SHR的VSMC对胰岛素刺激后的DNA合成较WKY显著增多，而加入PKC抑制剂作用24 h后,再用胰岛素和PMA作用，其细胞生成增加与空白对照组比较差异不显著，图1。
二、胰岛素对VSMC内MAPK含量及活性的影响
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胰岛素可促SHR及WKY大鼠的VSMC内MAPK含量增加，如图2A所示；发现在胰岛素作用后SHR和WKY两种大鼠的MAPK活性均增高，差异显著(P<0.05)。胰岛素对两种大鼠的VSMC内MAPK活性均有激活效应，SHR组中胰岛素vs空白为492.8 vs 121.1; WKY 组中胰岛素vs空白组是389.6 vs 105.7 pmol[32P]/min pro P<0.01。然而若给予PKC抑制剂处理24 h，可使胰岛素对MAPK的促活作用明显受到抑制，SHR组：胰岛素+PKC抑制剂vs胰岛素是118.2 vs 492.8 ; WKY组：胰岛素+PKC抑制剂vs胰岛素是 115.3 vs 389.6 pmol[32P]/min pro P<0.01，如图2B所示。
Fig 1 The effects of various agents on [3H]-TdR incorporation of VSMC
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(Control=blank group;PMA=VSMC preincubated with PMA;Insulin=VSMC preincubated with insulin;PKC inhibitor+PMA=VSMC preincubated with inhibitor and PMA; PKC inhibitor+insulin=VSMC preincubated with control and PKC inhibitor)
**P<0.01，vs control and PKC inhibitor；
*P<0.05，SHR vs WKY (
±s, n=5)图1 不同因素对VSMC[3H]-TdR掺入实验的影响
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Fig 2A Effects of various agents on the contains of MAPK in VSMC (Immunolblot assay)
SHR:1.Control；2.PMA；3.Insulin；4.PKC inhibitor+PMA；5.PKC inhibitor+insulin
WKY:6.PMA；7.Insulin；8.PKC inhibitor+PMA；9.PKC inhibitor+insulin；10.Control(Control=blank group;PMA=VSMC preincubated with PMA;Insulin=VSMC preincubated with insulin;PKC inhibitor+PMA=VSMC preincubated with inhibitor and PMA; PKC inhibitor+insulin=VSMC preincubated with control and PKC inhibitor)
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图2A 不同因素对VSMC所含的MAPK两种亚型的影响(免疫印迹法)
Fig 2B Effects of various agents on MAPK protein determine and
activity of VSMC (Immunolblot assay)
(Control=blank group;PMA=VSMC preincubated with PMA;Insulin= VSMC preincubated with insulin;PKC inhibitor+PMA=VSMC preincubated with inhibitor and PMA; PKC inhibitor+insulin=VSMC preincubated with control and PKC inhibitor)
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* *P<0.01，vs control and PKC inhibitor；
*P<0.05，SHR vs WKY (
±s, n=5)图2B 不同因素对VSMC内MAPK活性的影响
讨 论
胰岛素是多肽激素，在我们先前的研究中证实胰岛素引起的人血管平滑肌细胞增殖与PKC有关[1，2]。胰岛素是通过位于VSMC膜上的胰岛素受体结合，使细胞内PKC活化，促使胞浆中PKC向膜上转位。我们曾报道胰岛素可促进VSMC增生与激活癌基因-c-fos有关[6]。然而，胰岛素通过PKC引起VSMC增殖的细胞内机制尚不清楚。最近，Morinelli等[7]分别在VSMC和心肌细胞上发现MAPK是与生长有关的刺激信号细胞内信息传递的最后共同通路。其家族成员包括ERK，JNK和P38/RK。认为无论是酪氨酸激酶或是G蛋白的偶联受体激活第二信使系统，都可导致MAPK磷酸化而激活MAPK，后者又可磷酸化而激活多种转录因子(如AP-1等)，启动初级和次级应答基因转录和翻译，从而介导外界刺激的细胞增生效应。本研究表明胰岛素可激活MAPK，我们用了PKC激动剂PMA作为阳性对照，结果表明，用PKC抑制剂预处理VSMC 24 h可使PKC活性受到抑制，在抑制了PKC活性后，结果显示胰岛素和PMA对VSMC的DNA3H-TdR掺入量减少及对MAPK的激活作用消失，表明胰岛素对MAPK的激活作用是依赖其上游的PKC活化信号，同时我们在实验中选用了自发性高血压大鼠SHR与WKY比较了两种鼠之间胰岛素对VSMC的作用，结果显示胰岛素均能对两种鼠VSMC的MAPK有激活作用，但在量上有显著差异，提示高血压大鼠的VSMC对胰岛素反应在PKC-MAPK上有不同。本实验表明胰岛素的促VSMC增生是通过PKC介导的，与激活MAPK的效应有关，提示高血压VSMC内可能存在胰岛素-PKC-MAPK轴的关系。
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许多生长因子tyrosine激酶受体激活一种传递途径—包括生长因 子受体结合蛋白2(growth factor receptor-bound protein-2,GRB-2)和ras-GTP与激活有关的GRB-2上的src-同源簇2(SH2)的交换分子SOS-磷酸化受体。这些事件进一步导致未被激活的ras-GDP转变为激活的ras-GDP，激活raf、有丝分裂原激活蛋白激酶激酶(MAP kinase kinase)、有丝分裂原蛋白激酶(MAP kinase)、转录因子、最终DNA合成、增殖和分化[10]。胰岛素受体似乎不直接与GRB-2结合，但是受体的激活引起胰岛素受体底物(IRS-1或2) —它们与各种各样的SH2蛋白结合[11]。这样胰岛素受体可能激活MAP kinase瀑布，至少部份通过对IRS磷酸化、继而与GRB-2结合，激活SOS、 ras和下游的多种酶[11]。胰岛素唤醒了人VSMC MAPK kinase以及MAPK (Erk1和Erk2) ,并诱导这些细胞的MAPK kinase瀑布的激活 。对于VSMCs来说胰岛素激活MAP Kinase能力的可能原因目前尚未鉴别出来。
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[基金项目]国家自然科学基金资助(No.39670321)
[参 考 文 献]
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[收稿日期]1999-03-17
[修回日期]1999-08-13, http://www.100md.com