胚胎期受辐射对子鼠造血基质细胞功能的影响
作者：高颖 齐淑玲 杨凤桐 张宇光 王映兰 刘杰文
单位：高颖(300020 天津，中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所)；齐淑玲(300020 天津，中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所)；杨凤桐(中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所)；张宇光(中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所)；王映兰(中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所)刘杰文(300020 天津，中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所)
关键词：辐射远期影响；骨髓基质细胞；粒单系集落刺激因子；干细胞因子；粒单细胞系祖细胞集落形成单位
中华放射医学与防护杂志000507 【摘要】 目的 研究胚胎期2.0 Gy 137Cs γ射线照射后对子鼠造血基质细胞的远期影响。方法 建立胚胎期受辐射小鼠模型；以细胞计数检测股骨骨髓有核细胞(BMNCs)数；用免疫组化ABC法检测基质细胞粒单系集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞因子(SCF)的表达；用体外小鼠骨髓细胞培养法以粒单细胞系祖细胞集落形成单位(CFU-GM)为指标观察基质细胞对正常骨髓造血的支持功能。结果 胚胎期受辐射小鼠BMNCs数明显低于正常小鼠(P<0.01)，其骨髓基质细胞生长因子GM-CSF和SCF的表达均高于正常小鼠(P<0.05)，同时，胚胎期受辐射小鼠骨髓基质细胞对正常骨髓造血的支持能力也高于正常小鼠(P<0.05)。结论 2.0 Gy 137Cs γ射线对发育中的小鼠胚胎的造血基质细胞产生了明显影响。
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Effects of prenatal irradiation on the functions of murine haematopoietic stromal cells.
GAO Ying,QI Shuling, YANG Fengtong et al.
(Institute of Hematology,CAMS and PUMC,Tianjin,300020,China)
【Abstract】 Objective To observe the effects of prenatal irradiation on functions of haematopoietic stromal cells. Methods Long-term effects of 2.0Gy 137Cs γ-radiation at midterm gestation of mice on the haematopoietic stromal cells of their offspring were studied. Results The quantity of femoral bone marrow nucleated cells (BMNCs) in the irradiated offspring was markedly lower than that of the normal offspring (P<0.01).And stromal expressions of the growth factors,granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and stem cell factor (SCF),of the irradiated offspring were higher compared with those of the normal offspring (P<0.05).At the same time,the ability to support heamatopoiesis by the stromal cells in irradiated offspring was higher than that in normal offspring. Conclusion The results suggest that irradiation with 2.0Gy 137Cs γ-rays is sufficient to produce measurable effects on developing murine haematopoietic stromal cells.
, 百拇医药
【Key words】 Long-term effects of radiation; Bone marrow stromal cells; GM-CSF; SCF; CFU-GM
至今，研究辐射对造血基质细胞的影响，多是利用体外培养的基质细胞，体外培养的处于G0期的基质细胞具有较高的抗放能力，可耐受100 Gy的辐射，500 Gy照射后仍具分泌细胞因子的能力[1]。在体内，10 Gy以下的辐射对造血基质细胞几乎没有损伤[2]。
胚胎发育对辐射较敏感，据对目前的文献分析，孕鼠受照对子鼠造血基质细胞功能的影响少见报道。本文作者通过对孕鼠照射，获得胚胎期受辐射小鼠，比较其与正常子鼠基质细胞造血生长因子GM-CSF和SCF的表达情况和基质细胞对正常骨髓造血的支持能力，探讨胚胎期受辐射对子鼠骨髓基质细胞的影响以及基质细胞支持造血能力变化的分子基础。
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材料和方法
1.胚胎期受辐射小鼠：C57BL纯系小鼠，雌雄合笼，以阴栓出现为受孕标志，孕后15 d用137Cs γ放射源(Cammacell 40,Canada)一次全身均匀照射2.0 Gy，吸收剂量率0.955 Gy/min，同时设胚胎期不经照射的小鼠为正常对照。两组婴鼠出生后常规饲养，10周龄后取其骨髓。
2.骨髓有核细胞(BMNCs)计数：取小鼠两侧股骨，用IMDM培养液冲出骨髓，均匀分散，以白细胞稀释液1∶20稀释后记数。
3.小鼠骨髓细胞长期培养(LTBMCs)：按照Dexter的方法[3]。IMDM购自Gibco公司，小牛血清和马血清为天津血研所科技公司产品，琥珀酰氢化考的松购自Sigma公司。
4.基质细胞生长因子GM-CSF和SCF的表达：以免疫组化ABC法检测，参照ABC试剂盒说明书。小鼠抗人GM-SCF单抗，Sigma公司，大鼠抗小鼠SCF单抗，Genzyme公司，Vectstain ABC试剂盒，北京中山生物公司。
, 百拇医药
5.基质细胞对正常骨髓造血的支持功能：以CFU-GM外体软琼脂单层培养法检测。培养3周的小鼠LTBMCs基质细胞，弃1/2上清，加入内含1×107正常小鼠骨髓有核细胞的新鲜培养液培养，以含1.0×107正常小鼠骨髓有核细胞的新鲜培养液单独培养为空白对照；2周后用软琼脂单层培养法检测培养上清中的CFU-GM，方法是以1/6培养上清中的悬浮细胞，接种于Dexter体系[马血清1 ml，小鼠胚胎条件培养液0.75 ml，IMDM培养液2.75 ml，3.3%琼脂(Difco)0.5 ml]中，置体积分数为5%CO2，饱和湿度，37℃下培养7 d，镜下计数大于50个细胞的集落数。
6.统计分析：用医学统计软件包(POMS)对计数资料进行t检验。
结 果
1.骨髓有核细胞数：10周龄的正常小鼠为(2.91±0.45)×107细胞/股骨，胚胎期受辐射小鼠为(1.98±0.24)×107细胞/股骨，与对照小鼠比较P<0.01，胚胎期受辐射小鼠骨髓有核细胞数明显低于正常小鼠。
, 百拇医药
2.基质细胞生长因子GM-CSF和SCF的表达：镜下观察基质细胞，依据反应产物的有无、深浅，分为0、1、2、3、4级，计算每100个基质细胞的阳性率和阳性指数。如表1所示，胚胎期受辐射小鼠基质细胞生长因子GM-SCF和SCF的阳性率和阳性指数均高于正常小鼠。图1～4显示受照子鼠基质细胞GM-CSF和SCF的表达强度均高于正常小鼠。
3.基质细胞对正常骨髓造血的支持能力CFU-GM集落数：正常小鼠CFU-GM集落数为116.1±47.8，胚胎期受辐射小鼠为222.7±128.5，与对照小鼠比较P<0.05，结果显示，在不同的骨髓基质细胞上加入相同的正常造血细胞，这些造血细胞的自我更新能力是不同的，胚胎期受辐射小鼠的基质细胞对正常骨髓造血的支持能力高于正常小鼠。
图1 正常小鼠骨髓基质细胞表面GM-CSF的表达(×100)
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图2 受照子鼠骨髓基质细胞表面GM-CSF的表达(×100)
图3 正常小鼠骨髓基质细胞表面CSF的表达(×100)
图4 受照子鼠骨髓基质细胞表面CSF的表达(×100)
表1 胚胎期2.0Gy的照射对子鼠骨髓
基质细胞生长因子GM-CSF和SCF表达的影响
组别
阳性率(%)
阳性指数
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GM-CSF：
对照
7.0±7.4
7.7±8.1
实验
29.9±21.2
54.8±53.3
SCF：
对照
8.3±6.2
12.1±10.3
实验
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22.0±17.8*
28.4±16.9*
注：*与对照组比较，P<0.05讨 论
一般认为造血微环境是由3部分组成，即基质细胞及其产生的可溶性和膜结合形式的生长因子、粘附分子和细胞外基质。基质细胞可以产生多种生长因子(如：GM-CSF、G-CSF、M-CSF等)以及抑制因子(如TNFα、TGFβ、TNFγ)。基质细胞的胞外基质(ECM)一方面可以结合并局部浓缩生长因子如GM-SCF、SCF、IL-3等，另一方面可以黏附造血干细胞[4]。可见基质细胞对造血细胞的增殖、分化有至关重要的作用。
胚胎期受辐射对子鼠造血基质细胞的远期影响近几年有少数报道，而且剂量和射线种类与本实验也有很大差异。Gaitan[5]等人观察对孕鼠进行4.5 Gy的X射线照射后对其子鼠造血基质细胞的远期影响，发现在骨髓细胞长期培养中，胚胎期受辐射小鼠的基质细胞释放的粒系细胞平均不足正常小鼠的1/2，而其基质上清液的CFU-GM集落刺激能力平均为正常小鼠的3.5倍，但作者没有对基质细胞及其表面的生长因子的变化做进一步的报道。
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GM-CSF和SCF是骨髓基质细胞产生的多功能生长因子。SCF的基因1990年才被发现，并进而发现了生长因子SCF，SCF主要作用于小鼠干细胞，维持其多向造血潜能性[6]。GM-CSF主要促进粒单系造血细胞的生长，抑制中性粒细胞凋亡[7]。
Mason[8]等观察到，给孕鼠注射30 Bq/g 239Pu(此剂量与1.8 Gy γ射线相当)，后代小鼠造血干细胞(CFU-S)数量下降；杨凤桐[9]等利用骨髓移植物方法证实了胚胎期受1.8 Gy γ射线照射造成子鼠骨髓基质祖细胞(CFU-F)数量下降。
本实验研究结果表明，胚胎期受2.0 Gy 137Cs-γ射线照射的小鼠，其基质细胞生长因子GM-CSF和SCF的表达均高于正常小鼠，对正常骨髓造血的支持能力也高于正常小鼠，提示受照子鼠骨髓基质细胞无明显功能缺陷，可能是由于辐射引起的造血干细胞与基质祖细胞长期不足而产生的正反馈。受照子鼠骨髓有核细胞数低于正常小鼠，推测是因体内造血干细胞数量严重受损或者体内某种抑制因子表达增强所致。由于目前所得的文献和研究有限，对本实验研究结果尚无法找到明确的解释，还需进一步的研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770192)
参考文献
1，Bierkens JG,Hendry JH,Testa NG.The radiation response and recovery of bone marrow stroma with particular reference to long-term bone marrow cultures.Eur J Haematol,1989,43:95-107.
2，Bierkerns JG,Hendry JH,Testa NG. Recovery of the proliferative and functional integrity of mouse bone marrow in long-term cultures established after whole-body irradiation at different doses and dose rates.Exp Hematol,1991,19:81-86.
, 百拇医药
3，Dexter TM,Allen TD，Lajtha LG.Condition controlling the proliferation of hematopoietic stem cells in vitro.J Cell Physiol,1977,11:335-344.
4，Long MW.Blood cell cytoadhesion molecules.Exp Hematol,1992,20:288-301.
5，Gaitan S,Tejero C,Humphreys ER,et al.A relationship between residual stromal damage in hematopoietic tissue and functional activity of granulocytes.Exp Hematol,1993,21:1227-1232.
6，Van OR,Lamont C,Witsell A,et al.Radioprotection of bone marrow stem cell subsets by interleukin-1 and kit-ligand:implication for CFU-S as the responsible target cell population.Exp Hematol,1997,25:205-210.
, 百拇医药
7，Farese AM,Williams DE,Seiler FR,et al.Combination protocols of cytokine therapy with interleukin-3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in a primate model of radiation induced marrow aplasia.Blood,1993,1582:3012-3018.
8，Mason TM,Lord BI,Molineux G,et al.Alpha-irradiation of haemopoietic tissue in pre-and postnatal mice:2.Effects of mid-term contamination with 239Pu in utero.Int J Radiat Biol,1992,61:393-403.
9，Yang FT,Lord BI,Hendry JH,et al.Gamma irradiation of the fetus damage the developing hemopoietic microenvironment rather than the hemopoietic progenitor cells.Radiat Res,1995,141:309-313.
(收稿日期:1999-12-11), http://www.100md.com
单位：高颖(300020 天津，中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所)；齐淑玲(300020 天津，中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所)；杨凤桐(中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所)；张宇光(中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所)；王映兰(中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所)刘杰文(300020 天津，中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所)
关键词：辐射远期影响；骨髓基质细胞；粒单系集落刺激因子；干细胞因子；粒单细胞系祖细胞集落形成单位
中华放射医学与防护杂志000507 【摘要】 目的 研究胚胎期2.0 Gy 137Cs γ射线照射后对子鼠造血基质细胞的远期影响。方法 建立胚胎期受辐射小鼠模型；以细胞计数检测股骨骨髓有核细胞(BMNCs)数；用免疫组化ABC法检测基质细胞粒单系集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞因子(SCF)的表达；用体外小鼠骨髓细胞培养法以粒单细胞系祖细胞集落形成单位(CFU-GM)为指标观察基质细胞对正常骨髓造血的支持功能。结果 胚胎期受辐射小鼠BMNCs数明显低于正常小鼠(P<0.01)，其骨髓基质细胞生长因子GM-CSF和SCF的表达均高于正常小鼠(P<0.05)，同时，胚胎期受辐射小鼠骨髓基质细胞对正常骨髓造血的支持能力也高于正常小鼠(P<0.05)。结论 2.0 Gy 137Cs γ射线对发育中的小鼠胚胎的造血基质细胞产生了明显影响。
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Effects of prenatal irradiation on the functions of murine haematopoietic stromal cells.
GAO Ying,QI Shuling, YANG Fengtong et al.
(Institute of Hematology,CAMS and PUMC,Tianjin,300020,China)
【Abstract】 Objective To observe the effects of prenatal irradiation on functions of haematopoietic stromal cells. Methods Long-term effects of 2.0Gy 137Cs γ-radiation at midterm gestation of mice on the haematopoietic stromal cells of their offspring were studied. Results The quantity of femoral bone marrow nucleated cells (BMNCs) in the irradiated offspring was markedly lower than that of the normal offspring (P<0.01).And stromal expressions of the growth factors,granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and stem cell factor (SCF),of the irradiated offspring were higher compared with those of the normal offspring (P<0.05).At the same time,the ability to support heamatopoiesis by the stromal cells in irradiated offspring was higher than that in normal offspring. Conclusion The results suggest that irradiation with 2.0Gy 137Cs γ-rays is sufficient to produce measurable effects on developing murine haematopoietic stromal cells.
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【Key words】 Long-term effects of radiation; Bone marrow stromal cells; GM-CSF; SCF; CFU-GM
至今，研究辐射对造血基质细胞的影响，多是利用体外培养的基质细胞，体外培养的处于G0期的基质细胞具有较高的抗放能力，可耐受100 Gy的辐射，500 Gy照射后仍具分泌细胞因子的能力[1]。在体内，10 Gy以下的辐射对造血基质细胞几乎没有损伤[2]。
胚胎发育对辐射较敏感，据对目前的文献分析，孕鼠受照对子鼠造血基质细胞功能的影响少见报道。本文作者通过对孕鼠照射，获得胚胎期受辐射小鼠，比较其与正常子鼠基质细胞造血生长因子GM-CSF和SCF的表达情况和基质细胞对正常骨髓造血的支持能力，探讨胚胎期受辐射对子鼠骨髓基质细胞的影响以及基质细胞支持造血能力变化的分子基础。
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材料和方法
1.胚胎期受辐射小鼠：C57BL纯系小鼠，雌雄合笼，以阴栓出现为受孕标志，孕后15 d用137Cs γ放射源(Cammacell 40,Canada)一次全身均匀照射2.0 Gy，吸收剂量率0.955 Gy/min，同时设胚胎期不经照射的小鼠为正常对照。两组婴鼠出生后常规饲养，10周龄后取其骨髓。
2.骨髓有核细胞(BMNCs)计数：取小鼠两侧股骨，用IMDM培养液冲出骨髓，均匀分散，以白细胞稀释液1∶20稀释后记数。
3.小鼠骨髓细胞长期培养(LTBMCs)：按照Dexter的方法[3]。IMDM购自Gibco公司，小牛血清和马血清为天津血研所科技公司产品，琥珀酰氢化考的松购自Sigma公司。
4.基质细胞生长因子GM-CSF和SCF的表达：以免疫组化ABC法检测，参照ABC试剂盒说明书。小鼠抗人GM-SCF单抗，Sigma公司，大鼠抗小鼠SCF单抗，Genzyme公司，Vectstain ABC试剂盒，北京中山生物公司。
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5.基质细胞对正常骨髓造血的支持功能：以CFU-GM外体软琼脂单层培养法检测。培养3周的小鼠LTBMCs基质细胞，弃1/2上清，加入内含1×107正常小鼠骨髓有核细胞的新鲜培养液培养，以含1.0×107正常小鼠骨髓有核细胞的新鲜培养液单独培养为空白对照；2周后用软琼脂单层培养法检测培养上清中的CFU-GM，方法是以1/6培养上清中的悬浮细胞，接种于Dexter体系[马血清1 ml，小鼠胚胎条件培养液0.75 ml，IMDM培养液2.75 ml，3.3%琼脂(Difco)0.5 ml]中，置体积分数为5%CO2，饱和湿度，37℃下培养7 d，镜下计数大于50个细胞的集落数。
6.统计分析：用医学统计软件包(POMS)对计数资料进行t检验。
结 果
1.骨髓有核细胞数：10周龄的正常小鼠为(2.91±0.45)×107细胞/股骨，胚胎期受辐射小鼠为(1.98±0.24)×107细胞/股骨，与对照小鼠比较P<0.01，胚胎期受辐射小鼠骨髓有核细胞数明显低于正常小鼠。
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2.基质细胞生长因子GM-CSF和SCF的表达：镜下观察基质细胞，依据反应产物的有无、深浅，分为0、1、2、3、4级，计算每100个基质细胞的阳性率和阳性指数。如表1所示，胚胎期受辐射小鼠基质细胞生长因子GM-SCF和SCF的阳性率和阳性指数均高于正常小鼠。图1～4显示受照子鼠基质细胞GM-CSF和SCF的表达强度均高于正常小鼠。
3.基质细胞对正常骨髓造血的支持能力CFU-GM集落数：正常小鼠CFU-GM集落数为116.1±47.8，胚胎期受辐射小鼠为222.7±128.5，与对照小鼠比较P<0.05，结果显示，在不同的骨髓基质细胞上加入相同的正常造血细胞，这些造血细胞的自我更新能力是不同的，胚胎期受辐射小鼠的基质细胞对正常骨髓造血的支持能力高于正常小鼠。
图1 正常小鼠骨髓基质细胞表面GM-CSF的表达(×100)
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图2 受照子鼠骨髓基质细胞表面GM-CSF的表达(×100)
图3 正常小鼠骨髓基质细胞表面CSF的表达(×100)
图4 受照子鼠骨髓基质细胞表面CSF的表达(×100)
表1 胚胎期2.0Gy的照射对子鼠骨髓
基质细胞生长因子GM-CSF和SCF表达的影响
组别
阳性率(%)
阳性指数
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GM-CSF：
对照
7.0±7.4
7.7±8.1
实验
29.9±21.2
54.8±53.3
SCF：
对照
8.3±6.2
12.1±10.3
实验
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22.0±17.8*
28.4±16.9*
注：*与对照组比较，P<0.05讨 论
一般认为造血微环境是由3部分组成，即基质细胞及其产生的可溶性和膜结合形式的生长因子、粘附分子和细胞外基质。基质细胞可以产生多种生长因子(如：GM-CSF、G-CSF、M-CSF等)以及抑制因子(如TNFα、TGFβ、TNFγ)。基质细胞的胞外基质(ECM)一方面可以结合并局部浓缩生长因子如GM-SCF、SCF、IL-3等，另一方面可以黏附造血干细胞[4]。可见基质细胞对造血细胞的增殖、分化有至关重要的作用。
胚胎期受辐射对子鼠造血基质细胞的远期影响近几年有少数报道，而且剂量和射线种类与本实验也有很大差异。Gaitan[5]等人观察对孕鼠进行4.5 Gy的X射线照射后对其子鼠造血基质细胞的远期影响，发现在骨髓细胞长期培养中，胚胎期受辐射小鼠的基质细胞释放的粒系细胞平均不足正常小鼠的1/2，而其基质上清液的CFU-GM集落刺激能力平均为正常小鼠的3.5倍，但作者没有对基质细胞及其表面的生长因子的变化做进一步的报道。
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GM-CSF和SCF是骨髓基质细胞产生的多功能生长因子。SCF的基因1990年才被发现，并进而发现了生长因子SCF，SCF主要作用于小鼠干细胞，维持其多向造血潜能性[6]。GM-CSF主要促进粒单系造血细胞的生长，抑制中性粒细胞凋亡[7]。
Mason[8]等观察到，给孕鼠注射30 Bq/g 239Pu(此剂量与1.8 Gy γ射线相当)，后代小鼠造血干细胞(CFU-S)数量下降；杨凤桐[9]等利用骨髓移植物方法证实了胚胎期受1.8 Gy γ射线照射造成子鼠骨髓基质祖细胞(CFU-F)数量下降。
本实验研究结果表明，胚胎期受2.0 Gy 137Cs-γ射线照射的小鼠，其基质细胞生长因子GM-CSF和SCF的表达均高于正常小鼠，对正常骨髓造血的支持能力也高于正常小鼠，提示受照子鼠骨髓基质细胞无明显功能缺陷，可能是由于辐射引起的造血干细胞与基质祖细胞长期不足而产生的正反馈。受照子鼠骨髓有核细胞数低于正常小鼠，推测是因体内造血干细胞数量严重受损或者体内某种抑制因子表达增强所致。由于目前所得的文献和研究有限，对本实验研究结果尚无法找到明确的解释，还需进一步的研究。
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参考文献
1，Bierkens JG,Hendry JH,Testa NG.The radiation response and recovery of bone marrow stroma with particular reference to long-term bone marrow cultures.Eur J Haematol,1989,43:95-107.
2，Bierkerns JG,Hendry JH,Testa NG. Recovery of the proliferative and functional integrity of mouse bone marrow in long-term cultures established after whole-body irradiation at different doses and dose rates.Exp Hematol,1991,19:81-86.
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3，Dexter TM,Allen TD，Lajtha LG.Condition controlling the proliferation of hematopoietic stem cells in vitro.J Cell Physiol,1977,11:335-344.
4，Long MW.Blood cell cytoadhesion molecules.Exp Hematol,1992,20:288-301.
5，Gaitan S,Tejero C,Humphreys ER,et al.A relationship between residual stromal damage in hematopoietic tissue and functional activity of granulocytes.Exp Hematol,1993,21:1227-1232.
6，Van OR,Lamont C,Witsell A,et al.Radioprotection of bone marrow stem cell subsets by interleukin-1 and kit-ligand:implication for CFU-S as the responsible target cell population.Exp Hematol,1997,25:205-210.
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7，Farese AM,Williams DE,Seiler FR,et al.Combination protocols of cytokine therapy with interleukin-3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in a primate model of radiation induced marrow aplasia.Blood,1993,1582:3012-3018.
8，Mason TM,Lord BI,Molineux G,et al.Alpha-irradiation of haemopoietic tissue in pre-and postnatal mice:2.Effects of mid-term contamination with 239Pu in utero.Int J Radiat Biol,1992,61:393-403.
9，Yang FT,Lord BI,Hendry JH,et al.Gamma irradiation of the fetus damage the developing hemopoietic microenvironment rather than the hemopoietic progenitor cells.Radiat Res,1995,141:309-313.
(收稿日期:1999-12-11), http://www.100md.com