淫羊藿苷的肠菌代谢研究Ⅰ.肠内细菌对淫羊藿苷的代谢转化
作者：刘铁汉 王毅 王本祥 吴立军
单位：刘铁汉 王毅 王本祥(长春中医学院附属医院新药研究中心 130021)；吴立军(沈阳药科大学天然药物研究室)
关键词：淫羊藿苷；宝藿苷Ⅰ；肠内菌代谢；电喷雾质谱
中草药001118摘 要 目的：在考察淫羊藿苷(icariin)于人工胃液中稳定性的基 础上，研究了肠道内细菌对淫羊藿苷的代谢作用。方法：于人工胃液或肠内菌培养液中，加 入淫羊藿苷温孵培养一定时间后，以薄板层析、高效液相色谱仪和电喷雾质谱仪，对培 养物成分做定性分析检查。结果：淫羊藿苷在人工胃液中有较高的稳定性。离体培养人肠道 内细菌可代谢淫羊藿苷，且其主要代谢产物为淫羊藿苷的苷元(icaritin)及其苷元的异戊烯 基位置异构体。在大鼠整体实验中，从粪便和尿液中均检出一主要代谢产物，并初步确定此 代谢产物为宝藿苷Ⅰ (baoliuoside Ⅰ)。结论：在离体条件下，淫羊藿苷可被人肠内菌代 谢，主要代谢产物为淫羊藿苷的苷元。大鼠灌服淫羊藿苷后，吸收入血的主要代谢物为宝藿 苷Ⅰ。
, 百拇医药
Studies on the Metabolism of Icariin by Intestinal Bacteria
Part Ⅰ: The Transformation of Icariin by Intestinal Flora
Liu Tiehan, Wang Yi and Wang Benxiang
(Research Center of New Drug of Affiliated Hospital, Changchun College of TCM Changchun 130021)
Wu Lijun
(Shenyang Pharmaceutical University)
, 百拇医药
Abstract The stability of icariin in artificial gastric jui ce and the transformation of icariin in intestine were studied. Icariin was inc uba ted with artificial gastric juice or intestinal flora for a certain period of ti me, and its metabolite examined by TLC, HPLC and ESI/MS. Results showed that ic a riin was stable in artificial gastric juice, but was metabolized to icaritin by h uman intestinal bacteria in vitro. A main metabolite, baohuosid e Ⅰ. was found in urine and feces of rat after ig administration of 200 mg/kg ic a riin. These results showed that icariin can be metabolized in vitro by human intestinal bacteria to icaritin and as baohuoside after oral admini stration.
, http://www.100md.com
Key words icariin baohuoside Ⅰ intestinal bacteria metab olism ESI/MS
淫羊藿苷(icariin)是小檗科淫羊藿属植物的主要有效成分之一。注射途径给药或离体实验 表明，淫羊藿苷在心血管[1，2]，免疫调节[3～7]等方面有着广泛的生物 活性。然而，传统中药淫羊藿和现今绝大多数以淫羊藿苷为指标成分的药物制剂均为口服制 剂。因此，考察淫羊藿苷在消化道内的稳定性是揭示此类制剂作用机制研究中一个不可缺少 的重要环节。我们采用离体实验与大鼠整体实验相结合的方法，重点考察了肠内细菌对淫羊 藿苷的分解代谢作用，初步了解了淫羊藿苷在胃肠道内分解代谢的一般规律。
1 实验材料
1.1 动物：Wistar雄性大鼠(180～200 g)，购自白求恩医科大学实验动物室。
, 百拇医药
1.2 药品：淫羊藿苷为自制，经理化测定，证明纯度大于99%；胃蛋白酶购自Sigma公司。
1.3 仪器：Varium Unity -400型核磁共振波谱仪；Finigan mat 公司LCQ 电喷雾质谱仪 ；Shimadzu-8A 型分析制备两用高效液相色谱仪(UV检测器)；厌氧培养罐购自沈阳第五人 民医院；自制代谢用鼠笼。
1.4 试剂及其它材料：人工胃液按1995年版药典方法配制；厌氧培养液[8]：3 7.5 mL溶液A(0.87% K2HPO4),37.5 mL 溶液 B(0.47% KH2PO4，1.18% Na Cl, 1.2% (NH4)2SO4，0.12% CaCl2，0.25%MgSO4*H2O)，0.5 g L-cystine*H2O，2 mL 25% L-ascorbic acid, 50 mL 8% Na2CO3,牛肉膏1 g，蛋白胨 1 g，营养琼脂 1 g，最后调pH7.5～8 .0。粪便采于健康志愿者。
, 百拇医药
2 实验方法
2.1 淫羊藿苷在人工胃液中的稳定性考察：精密称取淫羊藿苷1.0 mg,加微量甲醇，加热 溶解，然后与16 mL温度为37 ℃人工胃液混合。用移液管分装于0，1，2，3号4支试管中( 预先置于37 ℃恒温水浴中)。然后分别用0.2 mol/L NaOH在0，1，2，3 h后调pH值至7.0 终止反应。0.45 μm的醋酸纤维膜过滤至5 mL容量瓶中，定容摇匀后，用HPLC分析(经考察 ，淫羊藿 苷含量与峰面积在0.004～0.2 mg/mL浓度范围内有较好的线性关系，r= 0.999 888)，每组进样 8 μL, 以0 h组检测到的淫羊藿苷量为100%，依据各峰面积与0 h组的峰面积之比求出经一 段时间后未发生变化的淫羊藿苷占原加入药物的百分含量。
2.2 用TLC法检测离体培养人肠内细菌对淫羊藿苷的代谢作用：取青年健康志愿者的新鲜 粪便，按0.5 g∶15 mL的比例加入厌氧培养液中，用玻璃珠和玻璃棒打匀，用纱布过滤即 得肠 菌培养液。取此新鲜配制的肠菌培养液9份，每份10 mL，各加淫羊藿苷2 mg,分别于37 ℃， 厌氧条件下培养0，2，4，8，16，24，48，72 h，用正丁醇萃取培养混合物，萃取液浓缩后 用于TLC分析。
, http://www.100md.com
2.3 淫羊藿苷体外代谢产物的制备分离和纯化：淫羊藿苷(1 000 mg)与新配制的肠菌培 养 液1 000 mL混合，于37 ℃厌氧条件下培养24 h后，用正丁醇等量萃取4次，60 ℃减压回收 ，所得残渣用乙酸乙酯提取。此提取液浓缩后，过滤，用于硅胶柱层析，以氯仿为洗脱剂， 得一黄色结晶(10.6 mg).
2.4 淫羊藿苷大鼠整体肠内菌代谢的考察
2.4.1 分析样本的制备：取大鼠3只，饲养7 d，待其充分适应本室环境后，收取空白尿 液 及空白粪便备用。禁食12 h后，连续ig给药 2 d，每天2次(200 mg/kg)，禁食但自由饮用糖 盐水(含5%葡萄糖和0.9%氯化钠)。不断收集给药后尿液和粪便，连续3 d。尿液用乙酸乙酯 萃取，粪便用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，过滤，即得澄明分析样本。
2.4.2 HPLC法对样本进行分析：采用Shimadzu-8A 分析制备两用HPLC，Spherisorb -C 18分析柱，以CH3OH-H2O＝7∶3为流动相，UV353 nm,流速为1 mL/min 对样本进行分析。
, http://www.100md.com
2.4.3 电喷雾质谱(ESI-MS)法对主要代谢产物的分析：采用Shimadzu-8A高效液相，Sp h erisorb-C18半制备柱，以CH3OH-H2O=7∶3为流动相。从给药鼠尿液中富 集粪便和尿液中均存在的主要代谢物，用于ESI-MS分析。
3 结果
3.1 淫羊藿苷在人工胃液中具有相对稳定性：淫羊藿苷分子中，3位与7位羟基上分别有鼠 李糖基和葡萄基与黄酮母核相连，有被胃酸迅速分解的可能。然而，考察结果表明，淫羊藿 苷在37 ℃ 人工胃液中作用2 h后，仍有92.7%以原苷形式存在，仅有少部分分解。所以， 大部分的淫羊藿苷能在正常的胃排空时间内通过胃进入小肠，避免胃酸的破坏。见表1。
表1 淫羊霍苷在人工胃液中的稳定性(37 ℃)[ HT 培养时间 (h)
, http://www.100md.com
0
1
2
3
剩余率(%)
100
95.4
92.7
87.8
注：人工胃液：10 g胃蛋白酶溶于100 mL稀盐酸中 (pH 1.2);HPLC 条件：Spherisorb C18柱；流动相CH3OH-H2O-AcOH=60∶40∶0.5;流速1.0 mL/mi n；紫外检测器；波长271 nm。
, http://www.100md.com
3.2 离体培养人肠道内细菌对淫羊藿苷的代谢作用：薄层检查结果表明淫羊藿苷很快被 离体培养人肠道内细菌所代谢(约始于8 h)，12 h后，原形药物不能用薄层方法检出，而代 之以一极性小于淫羊藿苷的代谢物斑点。见图1。
图1 人肠道菌群对淫羊藿苷代谢薄层 层析示意图
层析条件：硅胶板，硅胶厚度为0.25 mm,溶剂系统为石油醚(30 ℃～60 ℃)-丙酮-甲酸= 3.5∶1.5∶0.1；层析后用2%三氯化铝乙醇溶液显色并在254 nm紫外下观察。
3.3 淫羊藿苷离体肠菌代谢产物的鉴定：所得代谢产物：黄色针状结晶(甲醇)；Molish反 应阴性，盐酸-镁粉反应阳性，推测此代谢产物可能为不含糖基的黄酮类化合物，ESI -MS正 谱给出 m/z 369 [M+H]+,且其裂解特征与淫羊藿苷的碎片峰m/z 369 次级断裂特征基 本一致。预示此化合物为淫羊藿苷元或苷元的同分异构体。1HNMR谱中，当谱图未被 放大时 ，各峰信号归属与淫羊藿苷元基本一致[9]。然而，当谱图被放大后发现，相应于5 位羟基氢，3位羟基氢，7位羟基氢，A环6位氢，B环2′，6′位氢，异戊烯基烯氢质子信号 均不是单一信号，结合质谱情况，推断此代谢产物为3，5，7-三羟基-4′-甲氧基-8- 异戊烯基黄酮(Ⅰ)与3，5，7-三羟基-4′-甲氧基-6-异戊烯基黄酮(Ⅱ)的混合物。又 因为1HNMR谱中δ6.415峰明显强于δ6.423峰，因此，在代谢物中以化合物(Ⅰ)为 主。各峰信号具体归属见表2。
, 百拇医药
表2 淫羊藿苷体外肠菌代谢产物的1HNMR 图谱 数据 位置
Ⅰ
Ⅱ
6
6.415(1 H,s)
6.423(1H，s)
2′，6′
8.242(2H，d，j=9,2)
8.239(2H,d，j=9,2)
3′，5′
7.246(2H，d,j=9,2)
, 百拇医药
7.246(2H,d,j=9,2)
4′-OCH3
3.965(1H，s)
3.965(1H,s)
1″
3.523,3.558(each 1H)
3.523,3.558 (each 1H)
2″
5.296(1H,m)
5.293(1H,m)
4″
, 百拇医药
1.868(3H,s)
1.868(3H,s)
5″
1.747(3H，s)
1.747(3H，s)
3-OH
9.589(1H，s)
9.589(1H，s)
5-OH
12.485(1H，s)
12.470(1H，s)
7-OH
, 百拇医药
10.852(1H，s)
10.857(1H，s)
化学位移单位ppm，偶合常数单位为Hz，工作频率400 MHz，溶剂为DMSO-d6，TMS为 内标
3.4 一主要淫羊藿苷大鼠整体肠菌代谢产物的推定：从高效液相色谱图(图2)中可见，不 论在给药大鼠的粪便中，还是在给药大鼠的尿液中，至少可检出保留时间分别为10.3 min (Ⅰ)和21 min (Ⅱ)的代谢物峰出现。并且，保留时间为21 min的代谢物峰 (Ⅱ)由二个保留 时间相差很小的峰重叠在一起组成。用Shimadzu HPLC, Spherisorb 半制备柱，不断富集代 谢峰 Ⅰ和Ⅱ所对映的代谢物，用于ESI-MS分析，代谢峰 Ⅱ 所对映的代谢物在ESI-MS正 谱 全谱中显较强峰 m/z 536[M+Na]+和m/z 514 [M+H]+。采用分步解离技 术对此二离子进行分析。m/z 536峰脱掉146碎片(鼠李糖基碎片)后，得稳定子峰m/z 390。m/z 514 峰 脱掉146碎片(鼠李糖基碎片)后得m/z 369子离子，且此子离子的进一步裂解碎片与淫羊 藿苷子离子m/z 369 的质谱图一致。结合高效液相色谱情况，初步证明代谢峰Ⅱ中有宝藿苷 Ⅰ (3，5，7-三羟基-4′-甲氧基-8-异戊烯基黄酮-3-O-鼠李糖 苷)的存在。代谢峰(Ⅰ)所对映的代谢物有待进一步研究。
, 百拇医药
A-淫羊藿苷标准品； B-宝藿苷Ⅰ标准品； C-给药组粪便； D-给药组尿 样； E-粪便对照； F-尿样对照
a-未知代谢产物； b-宝藿苷Ⅰ
图2 大鼠粪便与尿中代谢产物的HPLC图谱
4 讨论
糖类化合物是肠道内细菌重要的碳源。因此，肠道内细菌的苷键水解酶系对具有苷键的药物 进行水解是肠道内细菌代谢药物的一大特征[10]。在本实验中，我们不但检测到了 肠道内细菌对淫羊藿苷分子中糖基的水解作用，而且也检测到了淫羊藿苷元位置异构体的生 成。由此我们推测肠内细菌代谢淫羊藿苷的可能途径如图3。
综上所述，淫羊藿苷易被肠道内菌丛所代谢。
, http://www.100md.com
图3 肠内细菌代谢淫羊藿苷的推想图[ ST
因此，有必要进一步对口服淫羊藿苷后原苷及 其肠菌代谢产物在血液中能否出现，及原苷与肠菌代谢产物在生物活性方面有何异同进行考 察，以期阐明传统中药制剂中淫羊藿苷发挥药效的机制，并促进新的药物制剂的开发。
Address： Liu Tiehan, Research Center of New Drug, Affiliated Hospital, C hangchun College of TCM, Changchun
国家中医药管理局资助课题
刘铁汉 沈阳药科大学中药系95级硕士研究生，现为中国科学院微生物研究所98级博士研究 生。
参 考 文 献
, 百拇医药
1，王天然，邢善田，周金黄.中国免疫学杂志，1986，2：74
2，王天然，邢善田，周金黄.药学通报，1987，22：533
3，刘崇铭，于庆海，张利民.沈阳药学院学报，1981，14：28
4，刘崇铭，于庆海，张利民.中草药，1982，13 (9)：31
5，李青南，吴 铁，谢 华，等.中草药，1993，24：637
, 百拇医药
6，曹颍瑛，郑钦岳，张国庆，等.第二军医大学学报，1998，19：199
7，赵 勇，张 玲，崔正言.中国药理学通报，1996，12：52
8，Massao Hattori, Shu Y Z， Mined Shimizu, et al. Chem Pharm Bull, 1985,33:3838
9，李 枫，刘永隆.药学学报，1988，23：739
10，康 白主编.微生态学.大连：大连出版社，1988：95
(1999-12-14收稿), 百拇医药
单位：刘铁汉 王毅 王本祥(长春中医学院附属医院新药研究中心 130021)；吴立军(沈阳药科大学天然药物研究室)
关键词：淫羊藿苷；宝藿苷Ⅰ；肠内菌代谢；电喷雾质谱
中草药001118摘 要 目的：在考察淫羊藿苷(icariin)于人工胃液中稳定性的基 础上，研究了肠道内细菌对淫羊藿苷的代谢作用。方法：于人工胃液或肠内菌培养液中，加 入淫羊藿苷温孵培养一定时间后，以薄板层析、高效液相色谱仪和电喷雾质谱仪，对培 养物成分做定性分析检查。结果：淫羊藿苷在人工胃液中有较高的稳定性。离体培养人肠道 内细菌可代谢淫羊藿苷，且其主要代谢产物为淫羊藿苷的苷元(icaritin)及其苷元的异戊烯 基位置异构体。在大鼠整体实验中，从粪便和尿液中均检出一主要代谢产物，并初步确定此 代谢产物为宝藿苷Ⅰ (baoliuoside Ⅰ)。结论：在离体条件下，淫羊藿苷可被人肠内菌代 谢，主要代谢产物为淫羊藿苷的苷元。大鼠灌服淫羊藿苷后，吸收入血的主要代谢物为宝藿 苷Ⅰ。
, 百拇医药
Studies on the Metabolism of Icariin by Intestinal Bacteria
Part Ⅰ: The Transformation of Icariin by Intestinal Flora
Liu Tiehan, Wang Yi and Wang Benxiang
(Research Center of New Drug of Affiliated Hospital, Changchun College of TCM Changchun 130021)
Wu Lijun
(Shenyang Pharmaceutical University)
, 百拇医药
Abstract The stability of icariin in artificial gastric jui ce and the transformation of icariin in intestine were studied. Icariin was inc uba ted with artificial gastric juice or intestinal flora for a certain period of ti me, and its metabolite examined by TLC, HPLC and ESI/MS. Results showed that ic a riin was stable in artificial gastric juice, but was metabolized to icaritin by h uman intestinal bacteria in vitro. A main metabolite, baohuosid e Ⅰ. was found in urine and feces of rat after ig administration of 200 mg/kg ic a riin. These results showed that icariin can be metabolized in vitro by human intestinal bacteria to icaritin and as baohuoside after oral admini stration.
, http://www.100md.com
Key words icariin baohuoside Ⅰ intestinal bacteria metab olism ESI/MS
淫羊藿苷(icariin)是小檗科淫羊藿属植物的主要有效成分之一。注射途径给药或离体实验 表明，淫羊藿苷在心血管[1，2]，免疫调节[3～7]等方面有着广泛的生物 活性。然而，传统中药淫羊藿和现今绝大多数以淫羊藿苷为指标成分的药物制剂均为口服制 剂。因此，考察淫羊藿苷在消化道内的稳定性是揭示此类制剂作用机制研究中一个不可缺少 的重要环节。我们采用离体实验与大鼠整体实验相结合的方法，重点考察了肠内细菌对淫羊 藿苷的分解代谢作用，初步了解了淫羊藿苷在胃肠道内分解代谢的一般规律。
1 实验材料
1.1 动物：Wistar雄性大鼠(180～200 g)，购自白求恩医科大学实验动物室。
, 百拇医药
1.2 药品：淫羊藿苷为自制，经理化测定，证明纯度大于99%；胃蛋白酶购自Sigma公司。
1.3 仪器：Varium Unity -400型核磁共振波谱仪；Finigan mat 公司LCQ 电喷雾质谱仪 ；Shimadzu-8A 型分析制备两用高效液相色谱仪(UV检测器)；厌氧培养罐购自沈阳第五人 民医院；自制代谢用鼠笼。
1.4 试剂及其它材料：人工胃液按1995年版药典方法配制；厌氧培养液[8]：3 7.5 mL溶液A(0.87% K2HPO4),37.5 mL 溶液 B(0.47% KH2PO4，1.18% Na Cl, 1.2% (NH4)2SO4，0.12% CaCl2，0.25%MgSO4*H2O)，0.5 g L-cystine*H2O，2 mL 25% L-ascorbic acid, 50 mL 8% Na2CO3,牛肉膏1 g，蛋白胨 1 g，营养琼脂 1 g，最后调pH7.5～8 .0。粪便采于健康志愿者。
, 百拇医药
2 实验方法
2.1 淫羊藿苷在人工胃液中的稳定性考察：精密称取淫羊藿苷1.0 mg,加微量甲醇，加热 溶解，然后与16 mL温度为37 ℃人工胃液混合。用移液管分装于0，1，2，3号4支试管中( 预先置于37 ℃恒温水浴中)。然后分别用0.2 mol/L NaOH在0，1，2，3 h后调pH值至7.0 终止反应。0.45 μm的醋酸纤维膜过滤至5 mL容量瓶中，定容摇匀后，用HPLC分析(经考察 ，淫羊藿 苷含量与峰面积在0.004～0.2 mg/mL浓度范围内有较好的线性关系，r= 0.999 888)，每组进样 8 μL, 以0 h组检测到的淫羊藿苷量为100%，依据各峰面积与0 h组的峰面积之比求出经一 段时间后未发生变化的淫羊藿苷占原加入药物的百分含量。
2.2 用TLC法检测离体培养人肠内细菌对淫羊藿苷的代谢作用：取青年健康志愿者的新鲜 粪便，按0.5 g∶15 mL的比例加入厌氧培养液中，用玻璃珠和玻璃棒打匀，用纱布过滤即 得肠 菌培养液。取此新鲜配制的肠菌培养液9份，每份10 mL，各加淫羊藿苷2 mg,分别于37 ℃， 厌氧条件下培养0，2，4，8，16，24，48，72 h，用正丁醇萃取培养混合物，萃取液浓缩后 用于TLC分析。
, http://www.100md.com
2.3 淫羊藿苷体外代谢产物的制备分离和纯化：淫羊藿苷(1 000 mg)与新配制的肠菌培 养 液1 000 mL混合，于37 ℃厌氧条件下培养24 h后，用正丁醇等量萃取4次，60 ℃减压回收 ，所得残渣用乙酸乙酯提取。此提取液浓缩后，过滤，用于硅胶柱层析，以氯仿为洗脱剂， 得一黄色结晶(10.6 mg).
2.4 淫羊藿苷大鼠整体肠内菌代谢的考察
2.4.1 分析样本的制备：取大鼠3只，饲养7 d，待其充分适应本室环境后，收取空白尿 液 及空白粪便备用。禁食12 h后，连续ig给药 2 d，每天2次(200 mg/kg)，禁食但自由饮用糖 盐水(含5%葡萄糖和0.9%氯化钠)。不断收集给药后尿液和粪便，连续3 d。尿液用乙酸乙酯 萃取，粪便用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，过滤，即得澄明分析样本。
2.4.2 HPLC法对样本进行分析：采用Shimadzu-8A 分析制备两用HPLC，Spherisorb -C 18分析柱，以CH3OH-H2O＝7∶3为流动相，UV353 nm,流速为1 mL/min 对样本进行分析。
, http://www.100md.com
2.4.3 电喷雾质谱(ESI-MS)法对主要代谢产物的分析：采用Shimadzu-8A高效液相，Sp h erisorb-C18半制备柱，以CH3OH-H2O=7∶3为流动相。从给药鼠尿液中富 集粪便和尿液中均存在的主要代谢物，用于ESI-MS分析。
3 结果
3.1 淫羊藿苷在人工胃液中具有相对稳定性：淫羊藿苷分子中，3位与7位羟基上分别有鼠 李糖基和葡萄基与黄酮母核相连，有被胃酸迅速分解的可能。然而，考察结果表明，淫羊藿 苷在37 ℃ 人工胃液中作用2 h后，仍有92.7%以原苷形式存在，仅有少部分分解。所以， 大部分的淫羊藿苷能在正常的胃排空时间内通过胃进入小肠，避免胃酸的破坏。见表1。
表1 淫羊霍苷在人工胃液中的稳定性(37 ℃)[ HT 培养时间 (h)
, http://www.100md.com
0
1
2
3
剩余率(%)
100
95.4
92.7
87.8
注：人工胃液：10 g胃蛋白酶溶于100 mL稀盐酸中 (pH 1.2);HPLC 条件：Spherisorb C18柱；流动相CH3OH-H2O-AcOH=60∶40∶0.5;流速1.0 mL/mi n；紫外检测器；波长271 nm。
, http://www.100md.com
3.2 离体培养人肠道内细菌对淫羊藿苷的代谢作用：薄层检查结果表明淫羊藿苷很快被 离体培养人肠道内细菌所代谢(约始于8 h)，12 h后，原形药物不能用薄层方法检出，而代 之以一极性小于淫羊藿苷的代谢物斑点。见图1。
图1 人肠道菌群对淫羊藿苷代谢薄层 层析示意图
层析条件：硅胶板，硅胶厚度为0.25 mm,溶剂系统为石油醚(30 ℃～60 ℃)-丙酮-甲酸= 3.5∶1.5∶0.1；层析后用2%三氯化铝乙醇溶液显色并在254 nm紫外下观察。
3.3 淫羊藿苷离体肠菌代谢产物的鉴定：所得代谢产物：黄色针状结晶(甲醇)；Molish反 应阴性，盐酸-镁粉反应阳性，推测此代谢产物可能为不含糖基的黄酮类化合物，ESI -MS正 谱给出 m/z 369 [M+H]+,且其裂解特征与淫羊藿苷的碎片峰m/z 369 次级断裂特征基 本一致。预示此化合物为淫羊藿苷元或苷元的同分异构体。1HNMR谱中，当谱图未被 放大时 ，各峰信号归属与淫羊藿苷元基本一致[9]。然而，当谱图被放大后发现，相应于5 位羟基氢，3位羟基氢，7位羟基氢，A环6位氢，B环2′，6′位氢，异戊烯基烯氢质子信号 均不是单一信号，结合质谱情况，推断此代谢产物为3，5，7-三羟基-4′-甲氧基-8- 异戊烯基黄酮(Ⅰ)与3，5，7-三羟基-4′-甲氧基-6-异戊烯基黄酮(Ⅱ)的混合物。又 因为1HNMR谱中δ6.415峰明显强于δ6.423峰，因此，在代谢物中以化合物(Ⅰ)为 主。各峰信号具体归属见表2。
, 百拇医药
表2 淫羊藿苷体外肠菌代谢产物的1HNMR 图谱 数据 位置
Ⅰ
Ⅱ
6
6.415(1 H,s)
6.423(1H，s)
2′，6′
8.242(2H，d，j=9,2)
8.239(2H,d，j=9,2)
3′，5′
7.246(2H，d,j=9,2)
, 百拇医药
7.246(2H,d,j=9,2)
4′-OCH3
3.965(1H，s)
3.965(1H,s)
1″
3.523,3.558(each 1H)
3.523,3.558 (each 1H)
2″
5.296(1H,m)
5.293(1H,m)
4″
, 百拇医药
1.868(3H,s)
1.868(3H,s)
5″
1.747(3H，s)
1.747(3H，s)
3-OH
9.589(1H，s)
9.589(1H，s)
5-OH
12.485(1H，s)
12.470(1H，s)
7-OH
, 百拇医药
10.852(1H，s)
10.857(1H，s)
化学位移单位ppm，偶合常数单位为Hz，工作频率400 MHz，溶剂为DMSO-d6，TMS为 内标
3.4 一主要淫羊藿苷大鼠整体肠菌代谢产物的推定：从高效液相色谱图(图2)中可见，不 论在给药大鼠的粪便中，还是在给药大鼠的尿液中，至少可检出保留时间分别为10.3 min (Ⅰ)和21 min (Ⅱ)的代谢物峰出现。并且，保留时间为21 min的代谢物峰 (Ⅱ)由二个保留 时间相差很小的峰重叠在一起组成。用Shimadzu HPLC, Spherisorb 半制备柱，不断富集代 谢峰 Ⅰ和Ⅱ所对映的代谢物，用于ESI-MS分析，代谢峰 Ⅱ 所对映的代谢物在ESI-MS正 谱 全谱中显较强峰 m/z 536[M+Na]+和m/z 514 [M+H]+。采用分步解离技 术对此二离子进行分析。m/z 536峰脱掉146碎片(鼠李糖基碎片)后，得稳定子峰m/z 390。m/z 514 峰 脱掉146碎片(鼠李糖基碎片)后得m/z 369子离子，且此子离子的进一步裂解碎片与淫羊 藿苷子离子m/z 369 的质谱图一致。结合高效液相色谱情况，初步证明代谢峰Ⅱ中有宝藿苷 Ⅰ (3，5，7-三羟基-4′-甲氧基-8-异戊烯基黄酮-3-O-鼠李糖 苷)的存在。代谢峰(Ⅰ)所对映的代谢物有待进一步研究。
, 百拇医药
A-淫羊藿苷标准品； B-宝藿苷Ⅰ标准品； C-给药组粪便； D-给药组尿 样； E-粪便对照； F-尿样对照
a-未知代谢产物； b-宝藿苷Ⅰ
图2 大鼠粪便与尿中代谢产物的HPLC图谱
4 讨论
糖类化合物是肠道内细菌重要的碳源。因此，肠道内细菌的苷键水解酶系对具有苷键的药物 进行水解是肠道内细菌代谢药物的一大特征[10]。在本实验中，我们不但检测到了 肠道内细菌对淫羊藿苷分子中糖基的水解作用，而且也检测到了淫羊藿苷元位置异构体的生 成。由此我们推测肠内细菌代谢淫羊藿苷的可能途径如图3。
综上所述，淫羊藿苷易被肠道内菌丛所代谢。
, http://www.100md.com
图3 肠内细菌代谢淫羊藿苷的推想图[ ST
因此，有必要进一步对口服淫羊藿苷后原苷及 其肠菌代谢产物在血液中能否出现，及原苷与肠菌代谢产物在生物活性方面有何异同进行考 察，以期阐明传统中药制剂中淫羊藿苷发挥药效的机制，并促进新的药物制剂的开发。
Address： Liu Tiehan, Research Center of New Drug, Affiliated Hospital, C hangchun College of TCM, Changchun
国家中医药管理局资助课题
刘铁汉 沈阳药科大学中药系95级硕士研究生，现为中国科学院微生物研究所98级博士研究 生。
参 考 文 献
, 百拇医药
1，王天然，邢善田，周金黄.中国免疫学杂志，1986，2：74
2，王天然，邢善田，周金黄.药学通报，1987，22：533
3，刘崇铭，于庆海，张利民.沈阳药学院学报，1981，14：28
4，刘崇铭，于庆海，张利民.中草药，1982，13 (9)：31
5，李青南，吴 铁，谢 华，等.中草药，1993，24：637
, 百拇医药
6，曹颍瑛，郑钦岳，张国庆，等.第二军医大学学报，1998，19：199
7，赵 勇，张 玲，崔正言.中国药理学通报，1996，12：52
8，Massao Hattori, Shu Y Z， Mined Shimizu, et al. Chem Pharm Bull, 1985,33:3838
9，李 枫，刘永隆.药学学报，1988，23：739
10，康 白主编.微生态学.大连：大连出版社，1988：95
(1999-12-14收稿), 百拇医药